ЛЕКЦИИ Регуляция метаболизма Курс лекций. Е.А. Николайчик. Курс лекций Минск 2002 II
 Скачать 2.61 Mb.
|
|
ftsK является другим кандидатом на участие в разделении хромосомы. Первичная структура FtsK имеет сильное сходство с белком SpoIIIE B. subtilis и множеством Tra белков конъюгативных плазмид Streptomyces, для которых участие в перемещении ДНК было продемонстрировано. Первоначальная ftsK44 мутация не влияла на сегрегацию хромосом, но, когда - 55 - экспрессия C-концевого домена была уменьшена, дефект сегрегации был действительно обнаружен. 10.1.5. Дифференциация сайтов деления: система min. Функция генов в локусе minB должна предотвратить формирование септы в неправильном месте. Локус состоит из трех генов, minC, minD и minE. Белки MinC и MinD действуют вместе, образуя неспецифический ингибитор формирования септы, блокирующий клеточное деление на всех доступных сайтах. Белок MinE предотвращает действие этого ингибитора на внутренних сайтах, тем не менее разрешая ему действовать на клеточных полюсах. Хотя MinC обычно нуждается в активации белком MinD, чтобы функционировать должным образом, он может также действовать вместе с другим ингибитором деления, DicB. В мутантах minB (лишенных MinC или MinD) септа может формироваться или внутри клетки или на ее полюсах, но общее количество септ то же самое, что в нормальных клетках. Каждое полярное деление потребляет "квант" "потенциала деления" и одно центральное деление утрачивается, таким образом делая клетку длиннее. Следует также заметить, что время до следующего деления обратно пропорционально длине клетки, но даже в самых длинных клетках только одна септа может формироваться одновременно. Местоположение MinD во внутренней мембране было определено иммуноэлектронной микроскопией. Было также показано, что MinD имеет активность АТФазы in vitro. Было показано, что, несмотря на свои маленький размер (88 AК), белок MinE имеет три отдельных домена с различными функциями. Маленький N-концевой домен необходим, чтобы противодействовать активности ингибитора деления MinCD, центральная область может быть вовлечена в димеризацию или олигомеризацию, а большая C-концевая часть определяет топологическую специфичность функции MinE, позволяя ему действовать только на внутренних сайтах деления. Недавно было показано, что MinE образует кольцевную структуру около середины молодых клеток. Формирование этого кольца требовало MinD, но было независимо от MinC и FtsZ. Таким образом, в настоящее время MinE выглядит как белок, первым появляющийся на формирующемся сайте деления, что, возможно, является необходимым для правильной локализации кольца FtsZ, хотя не для его формирования. Пока еще в точности не известно, как работают Min белки. Попытка показать прямое взаимодействие этих трех белков с их наиболее вероятной мишенью, FtsZ, оказалась неудачной; хотя этот подход, использующий дрожжевую двухгибридную систему, легко показывает взаимодействие между членами системы Min и то, что MinE уменьшает взаимодействие между MinC и MinD. Природа топологического сигнала, узнаваемого белком MinE, также неизвестна. 10.1.6. Сборка и порядок действия белков клеточного деления на сайте деления. Бактериальное клеточное деление, хотя и кажется простым на первый взгляд, является фактически весьма сложным процессом, в котором принимает участие много белков. Очевидно, что действие этих белков должно быть скоординировано так или иначе, и самый легкий путь, которым такая координация могла бы быть достигнута - через формирование макромолекулярного комплекса на сайте деления. Предполагается, что эта, все еще в значительной степени гипотетическая, структура, названная дивисомой или септатором, собирается на сайте деления в самом его начале. Процесс, вероятно, начинается на сайте нуклеации, где инициируется сборка Z-кольца. Предполагается, что другие белки деления включаются в состав дивисомы после формирования Z-кольца. Хотя генетическое доказательство в пользу возможности взаимодействия между генами клеточного деления существовало в течение некоторого времени, только прямая демонстрация белок- белкового взаимодействия могла доказывать, что это взаимодействие действительно имеет место. Эти данные начали накапливаться недавно. zipA ген был фактически обнаружен через прямое связывание его продукта с FtsZ. Специфическое связывание очищенного N-концевого домена MukB с FtsZ было недавно продемонстрировано. Косвенное доказательство для FtsA-FtsZ взаимодействия обеспечивается исследованиями локализации гетерологичного FtsA в E. coli. FtsA белок из Rhizobium meliloti или Agrobacterium tumefaciens был способен локализоваться правильно в клетках E. coli, только если FtsZ белок от того же самого организма также обеспечивался. Взаимодействие между FtsZ и FtsA также наблюдалось при использовании дрожжевой двухгибридной системы . Также, косвенное доказательство существует для возможного взаимодействия FtsW с PBP3 и PBP3 и PBP1B. Взаимодействие между высокомолекулярным PBP и литическими ферментами уже было обсуждено выше. Недавнее изучение локализации белков клеточного деления с использованием - 56 - иммунофлуоресценции и гибридов с GFP обеспечило информацию относительно локализации в середине клетки некоторых белков, что является предпосылкой для их участия в дивисоме. Локализация в сайте деления была сначала показана для FtsZ с использованием окрашивания иммунозолотом, а затем подтверждена иммунофлуоресцентной микроскопией и in vivo с использованием гибридов с GFP. Несколько других белков деления также локализовались в септе - FtsA, FtsQ, ZipA , FtsW. Недавние эксперименты с локализацией белков деления в нескольких fts мутантах дают ключ к порядку их привлечения в дивисому и, возможно, к последовательности их действия во время деления. Расположение FtsA в середине клетки зависит от предшествующего формирования Z-кольца . Перемещение FtsQ к септе требует FtsZ и FtsA, но не FtsL и FtsI. Септальная локализация FtsI оказывается зависящей от присутствия FtsZ и FtsA, так же, как FtsL и FtsQ. В то же время, сборка колец FtsZ слегка нарушена, если инактивирован PBP3, а сокращение кольца не происходит. FtsN также образует кольца в центре клетки, но требует не только FtsZ, но также и FtsA, FtsQ и FtsI для правильной локализации. Хотя фенотип первоначального ftsK мутанта и результаты, полученные с GFP гибридами предполагали позднее время действия для FtsK, иммунофлуоресцентное мечение показало, что белок локализовался к септе довольно рано; только FtsZ и FtsA, но не FtsQ или FtsI требуются для правильной локализации. Подводя итог, можно сказать, что доступные данные предлагают следующий порядок сборки в "дивисому" нескольких белков деления: FtsZ-FtsA-FtsQ-FtsL-FtsI. FtsN может быть включен в септу после FtsI, но мультикопийная супрессия мутаций в генах, кодирующих FtsA, FtsQ, FtsI и FtsK, может указывать более раннюю роль для белка. FtsK включается в септу после FtsA, но не известно, зависят ли более поздние белки от его локализации. ZipA и FtsA локализуются к септе после FtsZ и не требуют присутствия друг друга для этой локализации. FtsW может действовать прежде FtsZ, по крайней мере это требуется для стабилизации Z-кольца (Рис. 10.4). FtsI - фермент, абсолютно требуемый для синтеза муреина септы, - является одним из последних белков, включаемых в дивисому. С другой стороны, сокращение Z-кольца требует активности FtsI. Это указывает, что целая структура дивисомы, возможно, должна быть собрана прежде, чем начнется синтез септы и ее сокращение. FtsI может также обеспечивать связь между периплазматическим пептидогликансинтезирующим комплексом (обсужденным выше) и белками клеточного деления. Хотя прямое взаимодействие FtsI с любым другим белком клеточного деления не было демонстрировано, косвенные доказательства таких взаимодействий свидетельствуют в пользу того, что FtsI - часть дивисомы. Поскольку непосредственное связывание FtsI с другими муреиновыми синтетазами и литическими ферментами было обнаружено, эти белки также должны входить в состав дивисомы. Важная проблема возникает из-за того, что многие из белков клеточного деления присутствуют в количествах, намного меньших, чем FtsZ. Например, соотношение FtsA к FtsZ обычно составляет 1:100. FtsQ, FtsL (?) и FtsN (?) вероятно присутствуют в еще меньших количествах, чем FtsZ. Было предложено, что "минорные" белки образуют комплексы друг с другом, "подсборки", которые присоединены к Z-кольцу, но расположены далеко друг от друга в начале Рис.10.4. Сборка аппарата деления Escherichia coli - 57 - сокращения, сдвигаясь ближе друг к другу только в процессе сокращения. Не известно, какая сила является ответственной за сокращение кольца и прогресс деления. Конечная стадия деления должна отличаться от сокращения, потому что дивисома должна быть демонтирована, и дочерние клетки должны разделиться, что может (или нет) требовать дополнительных белков для расщепления пептидных связей, которые вероятно скрепляют две клетки. Альтернативно, этот шаг мог быть выполнен "нормальными" литическими ферментами. 10.1.7. Регуляция клеточного деления. Наиболее важный вопрос о регуляции клеточного деления – о правильном выборе времени сборки и точном размещении септы, - все еще остается в значительной степени без ответа. Есть, однако, некоторая информация относительно других аспектов регуляции деления - регуляция транскрипции нескольких генов деления, участие белковых регуляторов на уровне транскрипции или прямых белок- белковых взаимодействий и специальный случай регуляции деления во время SOS ответа. Транскрипционная регуляция. Большинство генов клеточного деления расположены в большом генном кластере dcw (division and cell wall) или mra на 2 минуте хромосомы E. coli (Рис. 10.5). Несколько mur генов, вовлеченных в синтез пептидогликана, также расположены в этом кластере. Транскрипционные терминаторы не были найдены в пределах этого большого кластера из 16 генов, что вело к предположению, что весь кластер составляет один оперон. Гены в кластере обычно разделены только несколькими парами оснований, а в некоторых случаях даже перекрываются, что предполагает возможность трансляционного сопряжения. Поскольку структура оперона обычно подразумевает какую-то координацию генной регуляции, проводились исследования регуляции транскрипции генов в этой области. Большинство генов в кластере имеет несколько промоторов, в различной степени ответственных за их транскрипцию и иногда реагирующих на различные стимулы окружающей среды. Рис.10.5. dcw (mra) оперон генов клеточного деления и биосинтеза пептидогликана Escherichia coli - 58 - Сильный промотор расположен в самом начале кластера dcw. Этот промотор mra необходим для полной экспрессии первых девяти генов, до ftsW. Инактивация этого промотора не летальна, если первые девять генов кластера введены в клетку in trans, что указывает на присутствие дополнительных промоторов, способных к транскрипции нижележащих генов. Оказывается, однако, что транскрипция всех нижележащих генов, включая ftsZ, уменьшена, если этот (mra) промотор инактивирован. Хотя промотор mra, вероятно, важен для нормальной транскрипции всех генов в кластере dcw, дополнительные промоторы в пределах кластера также важны и были фактически охарактеризованы первыми. Из-за очевидной значимости ftsZ в клеточном делении регуляция его транскрипции была изучена наиболее экстенсивно. Гену предшествует набор промоторов различной силы и типов, что, вероятно, отражает потребность настройки экспрессии гена в различных условиях. Первоначально основная роль в транскрипции ftsZ была приписана его двум проксимальным промоторам. Однако позже было показано, что наиболее сильный из этих "промоторов" на самом деле является сайтом процессинга для РНКазы E. Когда это было принято во внимание, оказалось, что почти половина транскриптов ftsZ происходила от двух промоторов в пределах ddlB. Однако позже было показано, что еще более сильный промотор расположен выше и две трети транскриптов начинаются перед ddlB. Это коррелирует с более ранним наблюдением, что более чем 6 т.н.п. перед ftsZ требуются для его нормальной экспрессии. Регуляция экспрессии ftsZ с его проксимальных промоторов оказывается важной для надлежащего функционирования аппарата деления (Рис. 10.6). Вставка управляемого tac промотора непосредственно перед ftsZ вела к заметным изменениям нормального цикла деления, хотя клетки остались жизнеспособными. Это может указывать на то, что нормальный промотор ftsZ так или иначе регулирует транскрипцию гена в течение клеточного цикла (результат этой регуляции может максимизировать число жизнеспособных клеток на единицу массы). Эта возможность поддерживается колебанием количества транскрипта ftsZ в синхронизированных клетках. Также наблюдалось изменения в количестве транскрипта ftsZ, но приписывали их временному ингибированию транскрипции после репликации этой хромосомной области. Транскрипция, начинающаяся перед ftsA, показала периодичность и составляла существенную пропорцию транскриптов, захватывающих FtsZ, в то время как проксимальный промотор ftsZ транскрибировался конститутивно в течение всего клеточного цикла. Хотя эти сообщения о колеблющихся уровнях транскрипта в течение клеточного цикла обеспечивают возможную связь между регуляцией генной экспрессии и иницииацией клеточного деления, неизвестно, как уровни транскрипта управляются, т.е. какие белки и промоторы являются ответственными за эти колебания. С другой стороны, регуляция транскрипции, начинающейся с двух промоторов, расположенных в пределах ddlB, была изучена более подробно. sdiA ген (suppressor of division inhibition) был изолирован по его способности супрессировать действие нескольких ингибиторов деления. Будучи сверхэкспрессированым, его продукт индуцировал формирование мини-клеток и позволял мутанту ftsZ84 делиться при непермиссивной температуре. Эти эффекты наблюдались из-за того, что белок SdiA активировал транскрипцию с одного из промоторов в ddlB перед ftsQAZ и envA генами. Значение этой активации не ясно, поскольку ген не является жизненно необходимым. Однако ген может играть роль в стационарной фазе, потому что белок имеет обширную гомологию с большим семейством LuxR-подобных транскрипционных активаторов "quorum sensing" семейства. Все известные активаторы этого семейства работают в паре с другим геном (гомологичным luxI), чьей функцией является продукция маленькой свободно диффундирующей молекулы, N- ацил-гомосеринлактона, с ацил- цепью, длина которой варьирует у Рис.10.6. Регуляция экспрессии проксимальных промоторов ftsZ у Escherichia coli - 59 - различных видов. Поскольку эта молекула накапливается при увеличении плотностьи клеток в популяции, luxR-подобный ген активирует транскрипцию соответствующего регулона. Интересно, что E. coli явно не имеет гомолога luxI, что поднимает вопрос: что действует как активатор SdiA? Две противоречивых работы рассматривали эту проблему. Не было найдено никакого доказательства эффекта предполагаемого автоиндуктора на регуляцию SdiA-зависимого промотора (ftsQp2). Фактически, они наблюдали небольшое (30-35%) уменьшение транскрипции с этого промотора в течение роста в "культивированной" среде, в которой предварительно выращивались клетки E.coli. Этот эффект был меньше, чем снижение транскрипции с того же самого промотора (40-60%) в результате инсерционной инактивации гена sdiA. Вопреки этому сообщению, позднее было продемонстрировано не только увеличение транскрипции с ftsQp2 промотора в стационарной фазе, но также и активацию этого промотора автоиндукторами V. fischeri и V. harveyi, так же, как "культивированной" средой. Это свидетельствует в пользу того, что sdiA действительно действует подобно другим luxR-подобным регуляторам, хотя нативная молекула автоиндуктора в E.coli остается неизвестной. rpoS ген, кодирующий сигма-фактор стационарной фазы, также вовлечен в регуляцию транскрипции ftsQAZ генов. В частности ftsQp1, один из нескольких промоторов, ответственных за транскрипцию ftsQAZ генов, но никакой другой промотор в ddlB-ftsZ области, зависит от RpoS. stfZ - маленький ген, транскрибирующийся с антисмысловой цепи в 5' области ftsZ. Присутствие промоторной активности и функционального терминатора в этой области было показано, а ингибирование клеточного деления при повышенных температурах, когда эта область ДНК присутствует в множественных копиях, вело к предложению, что она действует как антисмысловая РНК, блокирующая трансляцию ftsZ подобно реликтовому фаговому гену dicF. Посттранскрипционная регуляция. Хотя многие, если не все, гены в кластере mra транслируются с полицистронных мРНК, относительная эффективность трансляции различных ORF изменяется значительно. Это неудивительно, поскольку продукты различных генов клеточного деления присутствуют в клетке в весьма различных количествах. FtsZ является, вероятно, наиболее распространенным (до 20,000 молекул в клетку), а FtsQ - одним из наименее распространенных. Несколько ORF в этой области не имеют хороших рибосомсвязывающих сайтов и, кроме того, несколько генов имеют отличные от ATG старт-кодоны. Это подразумевало, что трансляция различных ORF в этой области должна демонстрировать существенные различия в эффективности, и это действительно имеет место. Другой важный аспект посттранскрипционного контроля клеточного деления - ингибирование деления в течение SOS ответа. Повреждение ДНК в E.coli индуцирует экспрессию нескольких генов, которые исполняют две функции, важные для выживания клетки. Некоторые из индуцируемых белков вовлечены в восстановление ДНК, но функция других заключается в том, чтобы задержать клеточное деление, пока ДНК не восстановлена. SOS-индуцированый блок деления является результатом действия белка SulA. Продукт гена |