ЛЕКЦИИ Регуляция метаболизма Курс лекций. Е.А. Николайчик. Курс лекций Минск 2002 II
 Скачать 2.61 Mb.
|
|
8. Утилизация азота Бактерии могут использовать множество азотсодержащих соединений в качестве источника клеточного азота - от простейших неорганических (азот, нитрат) до сложных соединений включая аминокислоты и нуклеозиды. Аммиак является наиболее предпочтительным источником азота практически для всех бактерий. Однако бактериям чаще приходится утилизировать альтернативные источники азота, для чего они синтезируют множество белков, необходимых для транспорта внутрь клетки и последующего метаболизма азотсодержащих соединений. Синтез, а в некоторых случаях и активность, этих белков строго контролируются в соответствии с доступностью субстратов. Практически у всех бактерий глутамат и глутамин служат как основные доноры азота в биосинтетических реакциях. За образование этих аминокислот практически у всех бактерий отвечают два фермента. Первый, глутамин синтетаза, продуцирует глутамин из глутамата и аммиака: NH 3 + глутамат + ATP –> глутамин + ADP + P i , тогда как второй, глутамат синтетаза, переносит аминогруппу с глутамина на 2-кетоглутарат с образованием двух молекул глутамата: глутамин + 2-кетоглутарат + NADPH –> 2 глутамат + NADP + Суммарным результатом этих двух реакций является продукция глутамата из аммиака и 2- кетоглутарата. Эти реакции катализируются двумя ферментами: Глутаминсинтетаза (GlnA). Додекамерный фермент, состоящий из 12 идентичных субъединиц размером 55 кДа. Субъединицы организованы в два шестичленных кольца, лежащих друг на друге и сдерживаемых гидрофобными взаимодействиями и водородными связями. Активность фермента регулируется путем аденилирования (которое инактивирует фермент). Аденилирование происходит в ответ на увеличение внутриклеточной концентрации аммония - чем выше его концентрация, тем больше субъединиц GlnA инактивировано. Этот процесс катализируется аденилилтрансферазой (GlnE), основной функцией которой является преодоление последствий "аммонийного шока", происходящего при попадании бактерий из бедной азотом среды в богатую. В этих условиях высокая активность глутаминсинтетазы приводит к переводу практически всего глутамата в глутамин, лишая клетку необходимой аминокислоты. Аденилилтрансфераза, быстро инактивируя глутаминсинтетазу при повышении внутриклеточной концентрации аммония, предотвращает это явление. Глутаматсинтетаза - гетеродимер, субъединицы которого кодируются генами gltBD. Синтез глутаматсинтетазы находится под контролем Lrp (leucine-responsive regulatory protein), что приводит к репрессии синтеза фермента в богатой среде. Биохимические и генетические механизмы контроля утилизации азота наиболее изучены у представителей семейства Enterobacteriaceae. У этих бактерий система регуляции метаболизма азота (Рис. 8.1) кодируется четырьмя генами: glnD, кодирующим уридилтрансферазу/деуридилазу (UTase/UR), H-P H D D D-P A T P ADP Активация регулона NTR P i мало азота много азота UT/UR PII-UMP PII NtrB NtrB NtrC NtrC NtrC D D Рис. 8.1. Регуляция азотного метаболизма белками NtrB и NtrC - 42 - glnB, кодирующим малый регуляторный белок P II , ntrB, кодирующим гистидинкиназу, и ntrC, кодирующим регулятор ответа - транскрипционный энхансер. Белок NtrB (продукт гена glnL) является типичной сенсор-киназой, однако, будучи цитоплазматическим, не имеет мембранного якоря. Цитоплазматическим сигналом, детектируемым NtrB, является белок P II , который в уридилированной форме сигнализирует о недостатке, а в немодифицированной форме - об избытке азота. При нехватке азота NtrB катализирует фосфорилирование и, следственно, активацию регулятора ответа NtrC. N-концевой домен NtrB является сенсором, взаимодействующим с белком P II , а C-концевой домен обладает автокиназной активностью, фосфорилируя аминокислотный остаток His-139. Кроме того, NtrB обладает еще и фосфатазной активностью и может дефосфорилировать NtrC, что зависит от присутствия немодифицированного P II . Именно фосфатазная, а не киназная активность подвержена регуляции в данном случае – повышение внутриклеточной концентрации глутамина ведет к усилению фосфатазной активности NtrB. NtrC (продукт гена glnG) - димерный (как и NtrB) белок с массой субъединицы 55 кДа. Этот белок является типичным примером σ 54 -зависимых активаторов и имеет три четко выраженных домена. N-концевой домен является "приемником", и именно здесь распложен остаток аспартата, фосфорилируемый при взаимодействии с NtrB (Asp-54). Только фосфорилированная по Asp-54 форма белка способна активировать транскрипцию. Фосфорилирование NtrC стимулирует взаимодействие с ДНК, но не непосредственно связывание, а олигомеризацию димеров NtrC на активаторных последовательностях. Центральный домен NtrC типичен для σ N -зависяших активаторных белков, и именно этот домен взаимодействует с σ N -содержащей РНК-полимеразой (E σ N ). Домен содержит АТФ- связывающий сайт и обладает АТФазной активностью, необходимой для формирования открытого комплекса с E σ N . Эта АТФазная активность стимулируется связыванием с ДНК и фосфорилированием по Asp-54. Связывание NtrC с ДНК обеспечивается C-концевым доменом, который содержит типичный мотив "спираль-поворот-спираль" (такую структуру мы уже рассматривали на примере репрессора фага λ). Этот мотив позволяет NtrC связываться с активаторными последовательностями - энхансерами, обычно расположенными на расстоянии около 100 н.п. перед промоторными последовательностями, с которыми связывается E σ N . Функцией энхансера является способствование олигомеризации димеров NtrC, необходимой для активации транскрипции. NtrC может также выступать и в роли репрессора, если сайты его связывания перекрываются с промотором. У кишечных бактерий подвержены регуляции через NtrC многие гены - glnA ntrBC; гены, кодирующие транспорт глутамина (glnHPQ), аргинина (argT) и гистидина (hisJQMP); гены, необходимые для ассимиляции нитрита и нитрата (nasFEDCBA); регуляторные гены фиксации азота nifLA у K. pneumoniae и nac у K. aerogenes. Уридилтрансфераза (GlnD). Этот белок отвечает как за присоединение уридинмонофосфата к P II (GlnB), так и за его отсоединение. Количество внутриклеточного азота отражается на соотношении концентраций глутамина и 2-кетоглутарата (высокое при избытке и низкое при недостатке азота), что влияет на активность уридилтрансферазы. Активность этого фермента стимулируется 2-кетоглутаратом и АТФ и ингибируется глутамином. Следовательно, степень уридилирования P II (GlnB) зависит от соотношения концентраций глутамина и 2-кетоглутарата. P II (GlnB). Тримерный белок, способный связывать АТФ, 2-кетоглутарат и глутамат. Связывание P II с NtrB стимулирует фосфатазную активность NtrB по отношению к NtrC. Для такой стимуляции NtrB необходимо связать АТФ и 2-кетоглутарат либо глутамат. В условиях азотного голодания 2- кетоглутарат индуцирует конформационное изменение P II , способствующее его уридилированию. В условиях же избытка азота уридилтрансфераза связывает глутамин, что блокирует уридилирование и, наоборот, способствует деуридилированию P II . Уридилированная форма P II неспособна связываться с NtrB. Неуридилированная форма взаимодействует не только с NtrB, но и с аденилилтрансферазой, стимулируя ее активность, что ингибирует глутаминсинтетазу. NtrC в первую очередь активирует RpoN-зависимый промотор оперона glnALG (гены которого кодируют два регуляторных белка и глутаминсинтетазу). увеличение синтеза регуляторных белков - 43 - приводит к увеличению внутриклеточной концентрации NtrC-P, что активирует многие RpoN- зависимые гены. Одним из таких генов является nac, необходимый для активации транскрипции ряда генов азотного метоболизма, имеющих σ 70- зависимые промоторы. Литература: 1. M. Buck, M. A. Gallegos, D. J. Studholme, Y. Guo, And J. D. Gralla. The Bacterial Enhancer-Dependent σ 54 ( σ N ) Transcription Factor. J. Bacteriol. 2000, p. 4129–4136 Vol. 182, No. 15 2. D.J. Studholme, M. Buck. The biology of enhancer-dependent transcriptional regulation inbacteria: insights from genome sequences. FEMS Microbiol. Lett. 186 (2000) 1-9 9. Кислородный стресс и редокс контроль. Метаболизм клеток существенно различается в аэробных и анаэробных условиях. В аэробных условиях клетка может получить гораздо больше энергии, но это не дается ей бесплатно – кислород окисляет не только источники энергии, но и многие жизненно важные клеточные компоненты. Поэтому в аэробных условиях в клетке при помощи регуляторов OxyR и SoxR индуцируются белки, защищающие ее от кислорода, такие как супероксиддисмутаза и каталаза. С другой стороны, клетка вынуждена существенно перестраивать свой метаболизм если она попадает в бедные энергией анаэробные условия – теперь она уже не может себе позволить многие "роскоши". Такая метаболическая перестройка контролируется регуляторными белками – гистидиновой сенсорной киназой ArcB и регулятором транскрипции FNR. Эти два белка контролируют такие разнообразные процессы, как дыхание и фотосинтез, утилизация углерода и азота. Эти два регулятора реагируют на разные концентрации кислорода, позволяя точно подстраивать контроль различных генов к условиям полного или частичного анаэтобиоза. Активные радикалы: их повреждающее действие и механизм инактивации Кислородный стресс вызван действием активных кислородных интермедиатов, таких как анион супероксида (O 2 •-), перекись водорода H 2 O 2 и гидроксил-радикал HO•, которые способны повреждать белки, нуклеиновые кислоты и клеточные мембраны (Рис.9.1). Кроме того, повреждающее действие на клеточные структуры имеют производные этих активных соединений гипохлорная кислота (HOCl) и активные азотные интермедиаты - азотистый оксид (NO•). пероксинитрит (HOONO) и нитрозотиолы (RSNO). Для предотвращения повреждений клетка вынуждена постоянно синтезировать ферменты, инактивирующие активные радикалы и устраняющие вызванные ими повреждения. Причина окислительного стресса. Окислительный стресс является неизбежным побочным продуктом аэробного стиля жизни, поскольку O 2 •- и H 2 O 2 формируются каждый раз, когда молекулярный кислород химически окисляет переносчики электронов. Особенно активны в этом отношении восстановленные флавопротеины. У экспоненциально растущих бактерий E. coli O 2 •- и H 2 O 2 образуются при автоокислении компонентов дыхательной цепи. Флавин NADH дегидрогеназы II является основным местом переноса электронов к кислороду. Фумаратредуктаза - терминальная оксидаза, индуцируемая при анаэробном росте, - очень активно взаимодействует с кислородом и, возможно, является основной причиной стресса, возникающего при переходе от анаэробных к аэробным условиям. Растущие в PQ O 2 O 2 H 2 O 2 + O 2 - Fe 2+ HO. PQ SiRase Ndh II H 2 O 2 _ S _ S _ SH _ SH Acn[3Fe-4S] 1+ Acn[4Fe-4S] 2+ PQ O 2 O 2 H 2 O 2 + O 2 - Fe 2+ HO. PQ SiRase Ndh II H 2 O 2 _ S _ S _ SH _ SH Acn[3Fe-4S] 1+ Acn[4Fe-4S] 2+ Рис.9.1. Повреждение макромолекул клетки активными формами кислорода - 44 - аэробных условиях E. coli производят достаточно супероксиддисмутазы, чтобы поддерживать концентрацию O 2 •- на уровне порядка 10 -10 M. Это около половины той концентрации, которая могла бы уменьшить активность жизненно важных ферментов и ингибировать рост. Концентрация H 2 O 2 на порядок меньше ингибирующей. Таким образом, защитные системы бактериальной клетки поддерживают концентрацию активных производных кислорода на уровне, лишь слегка более низком, чем токсичный. Это активно используется растениями, животными, а иногда и другими бактериями для защиты от своих бактериальных конкурентов (или патогенов). Например, фагоциты животных используют NADPH оксидазу, NO• синтазу и миелопероксидазу для того, чтобы бомбардировать захваченные бактерии O 2 •-, NO•, HOCl и их производными H 2 O 2 , HOONO и RSNO Механизмы окислительных повреждений клетки. Наиболее чувствительными к окислительным повреждениям являются различные дегидратазы, использующие железо-серные кластеры [4Fe-4S] для связывания и дегидрирования субстратов. Окисление таких дегидратаз супероксид-ионом вызывает разрушение Fe-S кластеров и потерю активности. Кроме того, побочным продуктом такого окисления являются многочисленные ионы железа, высвобождаемые в цитоплазму, где они совместно с H 2 O 2 катализируют окисление ДНК. H 2 O 2 эффективно окисляет тиолы, поэтому повреждает множество дегидрогеназ, использующих остатки цистеина в каталитическом центре. Кроме того, взаимодействие H 2 O 2 с ионами Fe 2+ дает сильнейший окислитель HO• (гидроксил), способный взаимодействовать практически со всеми биомолекулами, в первую очередь с ДНК, с чем и связана в первую очередь летальность действия H 2 O 2 (действие активных форм азота) Защита от окислительного стресса. Для защиты от окислительного стресса клетка использует целый ряд антиоксидантных ферментов и систем репарации, большинство которые экспрессируется на низком базальном уровне в нормальных условиях. При воздействии супероксида и перекиси водорода экспрессия многих антиоксидантных белков индуцируется, что зависит в основном от действия двух регуляторов - SoxRS и OxyR. SoxRS регулон SoxRS в ответ на супероксид регулирует экспрессию не менее 10 белков, включая супероксиддисмутазу (SodA), участвующую в репарации ДНК эндонуклеазу IV (Nfo) и резистентные к супероксиду изоформы фумаразы (FumC) и аконитазы (AcnA). Аконитаза конвертирует цитрат в изоцитрат в цикле Кребса. Это мономер с одним железо-серным центром, который может находиться в каталитически активной [4Fe-4S] и неактивной (например, из-за окислительного повреждения) [3Fe-4S] форме. Кроме того, SoxRS обеспечивает увеличение концентрации глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (Zwf), что усиливает восстановительную силу клетки, и увеличение количества репрессора метаболизма железа Fur, что снижает поглощение железа и, следовательно, снижает выработку гидроксила. Индукция регулона происходит в два этапа. Сначала редокс-сенсорный белок SoxR под влиянием супероксид-иона индуцирует транскрипцию soxS, а затем уже SoxS непосредственно активирует гены- мишени, связываясь с их промоторными областями. Конститутивно экспрессируемый белок SoxR (Рис. 9.2) - димер, каждая из субъединиц которого содержит по одному стабильному [2Fe-2S] центру. Окисление восстановленной формы [2Fe-2S] + в форму [2Fe-2S] 2+ приводит к активации SoxR. Какая молекула вызывает окисление SoxR, пока неясно. Возможно, это делает сам супероксид-ион. Только окисленная форма SoxR может активировать транскрипцию soxS, однако восстановленная SoxR форма обладает той же аффинностью к ДНК. Следовательно, окисление регулятора должно каким-то образом изменять его взаимодействие с ДНК. Рис.9.2. Активация транскрипции белком SoxR - 45 - Интересным является то, где SoxR связывается с регуляторной областью – между сайтами –10 и –35 промотора, что очень необычно для активатора транскрипции. Кроме того, расстояние между этими сайтами слишком большое для активного промотора – 19 н.п. Скорее всего, промоторная область soxS одновременно оказывается занятой РНК-полимеразой и SoxR, расположенными по разные стороны ДНК, а окисление SoxR каким-то образом помогает РНК-полимеразе образовать открытый комплекс на нестандартном промоторе. Гены soxS и soxR расположены рядом друг с другом, транскрибируются в противоположные стороны, причем их промоторные области перекрываются. OxyR регулон Другой транскрипционный фактор, OxyR, в ответ на H 2 O 2 активирует синтез примерно 30 белков (четко показан контроль через OxyR только для 9 из них), в том числе каталазы (гидропероксидазы I, KatG), двух субъединиц алкилгидропероксид редуктазы (AhpCF), глутаредоксина (GrxA), глутатион редуктазы (GorA), Mn-супероксиддисмутазы и Fur-репрессора. Регулируемые OxyR неспецифический ДНК-связывающий белок Dps (DNA-binding protein from starved cells) и регуляторная РНК OxyS защищают от мутагенеза. Активируется также синтез ряда генов теплового шока и регулятора синтеза капсульных полисахаридов. Ген oxyR кодирует небольшой 34 kDa белок, примадлежащий к семействы LysR-подобных регуляторов. Как и большинство регуляторов этого семейства, OxyR негативно контролирует свой собственный синтез, причем как в присутствии H 2 O 2 , так и в ее отсутствии. Такая регуляция поддерживает количество белка на постоянном уровне. OxyR также активирует транскрипцию соседнего, транскрибируемого в противоположном направлении, гена oxyS, продуктом которого является небольшая нетранслируемая РНК, влияющая на экспрессию целого ряда генов. Тетрамер OxyR существует в двух формах - окисленной и восстановленной, но только окисленная форма активирует транскрипцию, связываясь с карбоксиконцевым доменом α-субъединицы РНК- полимеразы (Рис. 9.3). H 2 O 2 непосредственно окисляет OxyR, приводя к образованию дисульфидной связи между двумя цистеиновыми остатками одной субъединицы OxyR. Образование этой дисульфидной связи вызывает конформационное изменение, которое влияет на связывание с ДНК. Восстановление (и, следовательно, инактивация) OxyR осуществляется глутаредоксином 1 (тиол:дисульфид оксидоредуктазой, использующей восстановленный глутатион и NADH в качестве восстановителей), а поскольку глутаредоксин, также как и глутатионредуктаза, находятся под контролем OxyR, получается, что OxyR сам активирует экспрессию ферментов, необходимых для его восстановления, т.е. инактивации. . |