7. Хемотаксис
7.1 Устройство и принцип действия двигательного аппарата бактерий
Движение бактерий мы рассмотрим на примере E. coli как наиболее изученной бактерии. Эта бактерия передвигается за счет вращения своих жгутиков, которые действуют, как винты корабля.
Каждая бактерия может иметь шесть или более "винтов", разбросанных по поверхности клетки случайным образом. Хотя каждый "винт" вращается независимо, но при вращении против часовой стрелки нити жгутиков сближаются за счет гидродинамических сил и образуют пучок, вращающийся в одну сторону позади клетки. Вращение против часовой стрелки приводит к более-менее прямолинейному поступательному движению бактерии, тогда как вращение по часовой стрелке заставляет бактерию кувыркаться на месте (Рис. 7.1). В результате при последующем переключении направления вращения жгутика бактерия начнет двигаться в случайном направлении. В однородной среде бактерия кувыркается примерно раз в секунду.
Нить жгутика является тонкой ровной трубкой, созданной из уложенных спирально молекул одного единственного белка – флагеллина. Длина жгутикового филамента варьирует и может достигать
10 длин тела бактерии. Нить жгутика прикрепляется к базальному телу при помощи полого гибкого крюка. Крюк прикреплен к оси – полой прямой трубке, составляющей основу ротора жгутика. Ось окружена тремя кольцами – двойным MS кольцом, находящимся в цитоплазматической мембране и слегка выступающим из нее, P кольцом в слое пептидогликана и L кольцом в наружной мембране.
Специфическая для компонентов жгутика система секреции III типа, располагающаяся в базальном
- 35 - теле, транспортирует через мембрану белки оси, крюка и нити в правильной последовательности и в нужных количествах. Секретируемые компоненты поступают к месту сборки формирующегося жгутика через полость в его центре.
Предполагается, что белки-компоненты секреторного аппарата располагаются в основном на цитоплазматической стороне MS кольца (Рис.
7.2.).
Вращение жгутика обеспечивается молекулярным мотором, спрособным переключать направление вращения (Рис. 7.3.). Источником энергии для работы мотора служит трансмембранный протонный градиент. Моторно- переключательный комплекс крепится на цитоплазматической стороне MS кольца и образует колоколообразную структуру, известную как C- кольцо. Этот комплекс содержит три белка (FliG,
FliM и FliN), участвующие в генерации вращательного монента и переключении направления вращения. Считается, что этот комплекс вращается вместе с MS кольцом, осью, крюком и нитью. Статор мотора сделан из двух белков, окружающих MS кольцо.
Карбоксиконцевой домен одного из этих белков,
MotB, закреплен в клеточной стенке, а четыре гидрофобных спирали MotA взаимодействуют с аминоконцевой мембранной
α-спиралью, образую проводящий протоны канал через цитоплазматическую мембрану. Предполагается, что до восьми независимых комплексов Mot белков взаимодействуют с моторно-переключательным комплексом, генеруруя вращение в ответ на перемещение протонов внутрь клетки.
Взаимодействие между ротором и статором обеспечивается рядом разноименно заряженных АК остатков в белках FliG (ротор) и MotA (статор)
Регуляция синтеза жгутикового аппарата
Более 40 генов, кодирующих белки, необходимые для биосинтеза жгутиков, организованы в несколько оперонов. Естественно, что экспрессиия такого количества генов находится под строгим контролем. Контроль в данном случае организован иеархически. На вершине иерархии находится flhDC оперон, кодирующий два белка, из которых собирается гетеротетрамерный активации транскрипции генов второго "уровня". Многие глобальные регуляторы, такие, например, как БАК,
DnaA, связанный с нуклеоидом белок H-NS, влияют на уровень экспрессии оперона flhDC и, следовательно, на образование жгутиков.
Транскрипция генов первых двух уровней обеспечивается РНК-полимеразой с основным сигма-фактором (RpoD). Продуктами генов второго
Рис. 7.1. Движение E. coli
базаль- ное тело пере- клю- чатель соединение мотор подшипник
L
P
S (FliF)
M (FliF)
C
ВМ
ПГ
ЦМ
периплазма цитоплазма стержень центральный канал
MotA
FliG
FliN
FliM
крюк нить жгутика колпачок
MotB
Рис. 7.2. Строение бактериального жгутика
ВМ –внешняя мембрана ПГ – пептидогликан
ЦМ – цитоплазматическая мембрана L, P, S, M,
C – кольца базального тела жгутика (видимые в электронном микроскопе)
- 36 - уровня являются белки, входящие в состав базального тела жгутика и крюка, а также регуляторные белки FlgM и FliA. FliA кодирует альтернативный сигма-фактор
σ
28
или
σ
F
, необходимый для экспрессии генов третьего, и последнего, уровня , а FlgM
является анти-сигма фактором, ингибирующим активность
FliA. Когда секреторный аппарат
(базальное тело жгутика) и крюк собираются,
FlgM экспортируется из клетки и освобождает FliA, который наконец может активировать поздние гены жгутика.
7.2 Что такое хемотаксис и как он реализован у бактерий? Хемотаксис - способность бактерий двигаться по направлению к аттрактантам
(зачастую питательным веществам) и от репеллентов
(например, токсинов).
В качестве аттрактантов выступают практически все сахара и аминокислоты, в качестве репеллентов - жирные кислоты, спирты и другие потенциально вредоносные вещества. Чувствительность бактерий впечатляет - они легко детектируют изменение концентрации на
0.1% при микромолярных концентрациях веществ, а диапазон детектируемых концентраций перекрывает пять порядков. Аттрактанты и репелленты детектируются за счет непосредственного взаимодействия со специфическими хеморецепторами, а не за счет каких-либо внутриклеточных эффектов детектируемого вещества. Мембранные рецепторы группируются в кластеры, как правило расположенные на полюсах клетки, однако это не может помочь бактерии уловить разницу концентраций между полюсами, поскольку она будет слишком маленькой из-за малого размера самой клетки. Вместо этого бактерии ориентируются в химических градиентах путем измерения временных изменений концентраций при движении. Обычно скорость движения эшерихии составляет 10-20 своих длин в секунду. Сравнивая текущую загруженность хеморецепторов специфическими лигандами с таковой несколько секунд назад, клетка фактически может "измерить" разницу концентраций определенного вещества на расстоянии, во много раз превышающем длину самой клетки. Такое измерение концентрации лиганда во времени возможно за счет адаптивного метилирования хеморецепторов, которое зависит от загруженности их лигандами. Задержка во времени между связыванием лиганда и метилированием рецептора представляет собой своеобразную молекулярную "память", которая и позволяет измерять изменение концентраций лиганда. Если выбранное направление движения соответствует увеличению концентрации аттрактанта (снижению концентрации репеллента), время до следующего кувыркания увеличивается. К сожалению, из-за своего малого размера клетка постоянно сбивается с "верного" пути броуновским движением и поэтому просто не может продолжительно двигаться прямо. Такой механизм поэтому только в общем обеспечивает движение филамент крюк
L и P кольца стержень
MS кольцо внешняя мембрана пептидогликан цитоплазм. мембрана
MotA/B статор
C кольцо секреторный аппарат
H
+
или Na
+
H
+
Два возможных механизма работы мотора
(b)
(a)
45
nm
+
+
+
–
–
–
+
+
+
–
–
–
+
+
+
–
–
–
+
+
+
или Na
+
Рис. 7.3. Работа мотора жгутика - 37 - бактерии по градиенту концентрации в нужном направлении, но для бактерий является достаточно эффективным (Рис. 7.4).
Механизм, основанный на переключении направления вращения жгутиков, приводящий к прямолинейному движению, которое через варьирующие промежутки времени сменяется кувырканием на месте, не является единственным. У
Rhodobacter sphaeroides вращение единственного жгутика сменяется его полной остановкой, а у
Rhizobium meliloti вращение жгутика никогда не прекращается – изменяется только его скорость. Но во всех этих случаях результат работы сенсорной системы хемотаксиса один и тот же – если бактерия движется в "нужном" направлении, продолжительность такого движения увеличивается.
Сенсорный механизм хемотаксиса более сложен, чем рассмотренные нами ранее. Это объясняется прежде всего двумя причинами. Во-первых, поскольку броуновское движение может очень быстро изменить ориентацию бактериальной клетки, клетки должны обрабатывать хемотаксические сигналы очень быстро, и, действительно, от стимула до переключения "моторов" у клетки проходит не более 0.2 секунды. Во-вторых, для правильного сравнения пространственных градиентов клеткам необходимо такое устройство сенсорного механизма, которое "гасило" бы сенсорную стимуляцию в статических условиях, т.е. в отсутствии градиента концентрации, как бы много какого-то аттрактанта или репеллента ни присутствовало бы в среде.
7.3 Белковый аппарат хемотаксиса Три класса белков участвуют в хемотаксисе: трансмембранные рецепторы, цитоплазматические сигнальные белки и ферменты адаптивного метилирования.
Рецепторы хемотаксиса Многие бактерии детектируют хемотаксические стимулы при помощи рецепторов, известных как метилируемые белки хемотаксиса (methyl-accepting chemotaxis proteins, MCPs). Эти белки являются мембранными сенсорами, в принципе аналогичными по своей структуре EnvZ, с тем только отличием, что цитоплазматический сигнальный домен не является автокиназой. Функцию автокиназы выполняет другой белок - CheA, а сигнальные домены MCP обеспечивают взаимодействие с CheA. Еще одно отличие от типичного сенсора - по обе стороны
сигнального домена располагаются сайты метилирования, необходимые для адаптации рецепторов. MCP белки состоят из ок. 550 ак, и явл. димерами. Хорошо изучены 4 MCP из E. coli, реагирующие на серин (Tsr), аспартат и мальтозу (Tar), рибозу, глюкозу и галактозу (Trg) и дипептиды (Tap). У сальмонелл нет Tap, но есть сенсор цитрата
Рис. 7.4. Движение E.coli по градиенту аттрактанта за счет контроля продолжительности вращения жгутиков в одном направлении(b)
(a)
без стимула со стимулом движе ние переориентация аттрактант
- 38 -
Tcp. Серин, аспартат и цитрат связываются непосредственно с рецепторами, тогда как сахара и дипептиды сначала связываются с соответствующими периплазматическими белками, а уже эти комплексы взаимодействуют с рецепторами. Кроме того, MCP реагируют на изменения температуры и pH, а также являются рецепторами для различных репеллентов.
Классический рецептор состоит из
• аминоконцевой трансмембранной спирали,
• периплазматического собственно сенсорного домена, сложенного из четырех
α−спиральных участков,
• второй трансмембранной спирали
• большого цитоплазматического сигнального и адаптационного домена.
(Aer – сенсор аэротаксиса: типичный для
MCP цитоплазматический домен, но совершенно другая сенсорная часть, содержащая FAD и похожая на NifL)
Цитоплазматические домены сенсоров содержат 4 или 5 остатков глутамата, доступных для метилирования.
Как внеклеточный стимул транслируется во внутриклеточный сигнал? Две модели
Принцип ножниц:
Связывание лиганда дистальными концами связанных с мембраной спиралей может индуцировать значительное перемещение трансмембранных сегментов (принцип ножниц).
В несвязанном с лигандом состоянии субъединицы рецептора предположительно взаимодействуют между собой только в области первого трансмембранного сегмента.
Связывание с лигандом вызывает сближение сенсорных периплазматических субъединиц, что передается сигнальным субъединицам и обеспечивает их взаимодействие между собой, а в таком виде они уже не могут взаимодействовать с CheA и стимулировать его автокиназную активность. Метилирование создает стерические препятствия для взаимодействия сигнальных доменов между собой, что снова позволяет им стимулировать автокиназную активность CheA.
Принцип пистона:
Сейчас все больще и болще данных
накапливается в пользу другого механизма, основанного на скольжении трансмембранных сегментов (ТМ) друг относительно друга. Самый аминоконцевой ТМ1 закреплен в мембране жестко, тогда как второй более подвижен, и при свявывании лиганда скользит "вниз", т.е. в
Рис. 7.5. Рецептор хемотаксиса Tar Рис. 7.6. Модель трансмембранной передачи сигнала от сенсорного к сигнальному домену рецептора - 39 - сторону цитоплазмы, что и вызывает конформационное изменение цитоплазматического сигнального домена, инактивирующее его. Вариация на эту тему – участие двух амфипатических спиралей линкерного домена в изменении конформации (Рис. 7.6).
Цитоплазматические сигнальные белки и регуляторный механизм хемотаксиса Взаимодействие между рецепторами и переключателем жгутика осуществляется четырьмя белками (Рис. 7.7):
♦ CheA - ГК
♦ CheY - РО
♦ CheW - "адаптор" между рецептором и CheA
♦ CheZ - белок, способствующий дефосфорилированию CheYФ
Пара белков CheA-CheY представляет собой двухкомпонентную регуляторную систему, которая несколько отличается от рассмотренных ранее "классических" примеров. Наиболее существенным отличием является то, что CheY не является транскрипционным фактором и, соответственно, у него отсутствует ДНК- связывающий домен. ГК CheA функционирует в виде димера, с которым связываются два мономера CheW, и уже этот комплекс вступает в ассоциацию с димерным рецептором. В составе такого комплекса автокиназная активность резко возрастает, что усиливает перенос фосфата от CheАФ к CheY. CheYФ связывается с FliM моторно- переключательного комплекса базального тела, что приводит к вращению жгутика по часовой стрелке. CheZ предотвращает накопление
CheYФ, стимулируя автофосфатазную активность CheY.
При отсутствии аттрактанта концентрация CheYФ поддерживается на уровне, способствующем вращению жгутика преимущественно по часовой стрелке и, следовательно, отсутствию упорядоченного движения бактерии. Связывание аттрактанта с рецептором индуцирует конформационное изменение, которое передается четез мембрану и подавляет автокиназную активность CheA.
Концентрация CheYФ падает, и жгутики бактерии более продолжительное время вращаются против часовой стрелки. Поэтому клетки будут дольше двигаться прямолинейно, если они попадают в среду с более высокой концентрацией аттрактанта. Однако этот механизм не объясняет, как клетка может реагировать на постоянно возрастающую концентрацию аттрактанта. Этой цели служит сенсорная адаптация.
Метилазы хемотаксиса и сенсорная адаптация. Адаптация сенсорного аппарата достигается путем обратимого метилирования рецепторов, в котором участвуют два белка – метилтрансфераза CheR и метилэстераза CheB.
Метилирование рецепторов оказывает действие, противоположное связыванию аттрактанта. Интересно, что
Рис. 7.7. Молекулярный механизм хемотаксиса Внешний сигнал
MCP
R
Адаптация
B
?
O
2
/e
- транспорт?
Aer
W
W
A
A
P
P Y
Y
Z
C-кольцо мотор внутренняя мембрана пептидогликан внешняя мембрана крюк нить
- 40 - метилирование стимулируется связыванием аттрактанта с рецептором и в конечном итоге нейтрализует эффект связывания аттрактанта. Однако между связыванием аттрактанта и метилированием рецептора проходит некоторое время, в течение которого бактерии движутся прямолинейно, что и составляет основу молекулярной памяти машины хемотаксиса.
CheR - метилтрансфераза, метилирующая остатки глутамата в цитоплазматических доменах MCP с постоянной скоростью, перенося метил-группу с S-аденозилметионина.
CheB является мишенью для переноса фосфата с CheAФ, и CheBФ является метилэстеразой, деметилирующей MCP.
В отсутствие стимула метилирование MCP, осуществляемое CheR, компенсируется удалением метильных групп фосфорилированным CheB, что поддерживает метилирование MCP на уровне 0.5-1 метильная группа на субъединицу рецептора.
Когда аттрактант связывается с рецептором и ингибирует активность CheA, концентрация
CheBФ падает, хотя и более медленно, чем концентрация CheYФ, поскольку CheBФ не является субстратом для CheZ. Повышение степени метилирования восстанавливает способность рецептора стимулировать CheA. Однако, даже после того как базальные уровни CheYФ и CheBФ восстанавливаются, связанный с аттрактантом рецептор остается метилированным, поскольку метилированный рецептор – более плохой субстрат для метилэстеразы CheBФ.
Таким образом, с учетом метилирования принцип работы молекулярной машины хемотаксиса выглядит следующим образом.
• В отсутствие аттрактанта хеморецептор находится в активированном состоянии и его сигнальный домен активирует киназную активность CheA, что ведет к фосфорилированию CheY, а фосфо-
CheY, взаимодействуя с переключателем мотора, вызывает вращение жгутика по часовой клетке, что вызывает кувыркание бактерии на месте.
• Связывание аттрактанта инактивирует рецептор, и его сигнальный домен уже не может стимулировать киназную активность CheA, концентрация фосфо-CheY быстро падает (что стимулируется белком CheZ), направление вращения жгутика меняется и бактерия движется прямолинейно.
• Прямолинейное движение, однако, может прекратиться по двум причинам. Если бактерия начала двигаться в неблагоприятном направлении, рецептор освобождается, начинается фосфорилирование
CheY, и бактерия снова кувыркается на месте. Кроме того, когда киназа CheA "выключена", одновременно с дефосфорилированием CheYФ происходит дефосфорилирование CheBФ, хотя и с меньшей скоростью (поскольку CheBФ не является субстратом для CheZ), что приводит к повышению степени метилирования рецептора и восстановлению его сигнальной активности.
Поскольку и CheY, и CheB являются свободными цитоплазматическими белками, степень их фосфорилирования будет зависеть от степени метилирования рецепторов и их загруженности лигандами. Это делает возможным вместо ответа "все или ничего" плавно регулировать подвижность бактерий в широком диапазоне концентраций аттрактантов и репеллентов.
Метилирование рецепторов обеспечивает простейшую молекулярную память, позволяющую бактерии контролировать "правильность" направления движения.
Уровень метилирования будет высоким, если концентрация аттрактанта была высокой некоторое время назад. Когда клетка движется, она "сравнивает" сиюмоментную концентрацию аттрактанта (определяемую по степени занятости рецепторов) с концентрацией в недавнем прошлом (как зафиксировано степенью метилирования рецепторов). Если окружающие условия значительно улучшились или ухудшились, активность гистидинкиназы CheA будет соответственно снижена или повышена, изменяя продолжительность прямолинейного движения соответствующим образом.
Литература: 1. M.D. Manson, J.P. Armitage, J.A. Hoch, R.M. Macnab. Bacterial locomotion and signal transduction. J.
Bacteriol 1998. 180:1009-1022
Скачать 2.61 Mb.