ЛЕКЦИИ Регуляция метаболизма Курс лекций. Е.А. Николайчик. Курс лекций Минск 2002 II
 Скачать 2.61 Mb.
|
Эффекторный домен D13 D57 K109 Связывание ДНК D13 D57 K109 D13 D57 K109 D13 D57 K109 D13 D57 K109 АТФаза Метилэстераза/ деградация Класс OmpR CheY FixJ NtrC CheB/SprE (b) Связывание ДНК Связывание ДНК G G C C C - 30 - второй гистидинсодержащий домен, называемый HPt-домен (от His-containing phosphotransfer – гистидинсодержащий фосфатпереносящий) Каталитическое киназное ядро. Унифицирующим структурным свойством семейства ГК является характерное киназное ядро, состоящее из домена димеризации и АТФ/АДФ-связывающего фосфотрансферного или каталитического домена. Киназное ядро имеет размер 350 АК и отвечает за связывание АТФ и осуществление киназной реакции. Консервативный остаток гистидина, являющийся субстратом киназной реакции, располагается в домене димеризации. HPt-домены у прокариот встречаются исключительно в составе гибридных киназ, тогда как у эукариот – как отдельные белки. Эти домены имеют размер около 120 АК и содержат остаток гистидина, способный участвовать в фосфотрансферных реакциях. HPt-домены не имеют ни киназной, ни фосфатазной активности, поэтому они идеально приспособлены для коммуникации между различными белками. Интересно, что при всем разнообразии первичных последовательностей HPt-доменов их третичная структура очень схожа и напоминает таковую домена димеризации киназного ядра, включая расположение консервативного гистидинового остатка. Сенсорный домен Изменения в окружающей среде детектируются непесредственно (или опосредованно) аминоконцевым сенсорным доменом ГК. Между разнообразными мембранными сенсорными доменами практически полностью отсутствует сходство на уровне первичной последовательности, что поддерживает идею о специфичности детектируемых ими взаимодействий. В большинстве случаев специфический стимул и механизм его детекции остаются неизвестными. Информация о трехмерной структуре этих доменов начинает появляться только сейчас, поэтому как сигнал передается к киназному ядру, пока не ясно. Примером цитоплазматических сенсоров являются PAS-домены. Эти универсальные модули "чувствуют" изменения освещенности, окислительно-восстановительного потенциала, концентрации кислорода и небольших лигандов. Имя домена происходит от первых букв названий трех эукариотических белков, в которых он был впервые обнаружен. С доменом обычно связана одна из нескольких простетических групп, которые как раз и определяют распознавание разнообразных сигналов. Такими кофакторами могут быть, например, гем, ФАД, ФМН и т.д. PAS-домены имеют небольшой размер (100 АК) и располагаются перед (ближе к N-концу) киназным ядром, как правило, после одной или нескольких пар трансмембранных сегментов. Таким образом, цитоплазматические сенсоры с PAS-доменами тоже являются мембранными белками. Однако имеются и не связанные с мембраной цитоплазматические сенсоры, например, NtrB, участвующий в регуляции азотного метаболизма. (более подробно о снсорных доменах и механизме работы трансмембранных сенсорных ГК поговорим в разделе о хемотаксисе). Линкерный домен У трансмембранных ГК периплазматический сенсорный домен соединяется с цитоплазматическим киназным ядром при помощи трансмембранной α-спирали и цитоплазматического линкера. Линкерные домены совершенно необходимы для нормального функционирования сенсорных ГК, однако об их функциях известно немного. Размер линкеров варьирует в пределах 40-180 АК. Многие из них имеют характерный α-спиральный coiled coil мотив, в большинстве случаев предшествующий фосфорилируемому гистидиновому остатку киназного ядра. Две наиболее вероятные функции линкерных доменов – правильное расположение мономеров в димере ГК и передача сигнала от сенсорной к киназной части белка. Структура и функции регуляторов ответа Активности и структура У большинства прокариот РО – конечное звено сигнального пути, функционирующее как зависящий от фосфорилирования "выключатель" адаптивного ответа. РО катализирует перенос фосфата от фосфогистидина ГК к консервативному остатку аспартата в своем регуляторном домене. Большинство РО также катализируют автодефосфорилирование, что ограничивает время пребывания - 31 - белка в активированном состоянии. Фосфорилирование РО приводит к его конформационному изменению, затрагивающему значительную часть поверхности РО. Изменение поверхности позволяет происходить новым внутри- и межмолекулярным взаимодействиям, которые и вызывают адаптивный ответ. Такой принцип работы РО делает возможным многообразные регуляторные механизмы, оптимизированные для различных эффекторных функций в различных системах. Большинство РО состоит из двух доменов: консервативного аминоконцевого регуляторного и варьирующего карбоксиконцевого эффекторного. Большинство РО являются транскрипционными факторами с ДНК-связывающими эффекторными доменами (25 из 32 РО у E. coli). ДНК-связывающие домены могут быть разделены на три группы, представленные OmpR, NarL и NtrC (соответственно 14, 7 и 4 члена). Не все РО имеют ДНК-связывающие домены. Карбоксиконцевые домены некоторых РО являются ферментами, как, например, метилтрансфераза CheB, участвующая в хемотаксисе. Некоторые РО вообще лишены эффекторного домена. Примером такого белка является опять же белок хемотаксиса CheY, который функционирует путем взаимодействия с эффекторным белком FliM, компонентом жгутикового мотора. Регуляторный домен. Наиболее консервативная часть белка. содержит кластер остатков аспартата, которые связывают Mg 2+ и формируют активный сайт для переноса фосфата Эффекторный домен Эффекторным доменам сложно дать общую характеристику по причине их большого разнообразия. Большинство эффекторных доменов имеет ДНК-связывающую активность и действиет путем активации или репрессии транскрипции специфических генов. Тем не менее, узнаваемые последовательности ДНК, расположение сайтов связывания и механизм транскрипционной регуляции существенно различаются, даже у РО из одного подсемейства. OmpR, детально охарактеризованный представитель самого большого подсемейства РО, действует и как активатор, и как репрессор, дифференциально регулируя экспрессию генов ompC и ompF, кодирующих порины внешней мембраны. Димеры OmpR последовательно связываются с F и C боксами, предшествующими пориновым генам. Белки-представители этого семейства связываются с ДНК посредством характерного мотива "крылатая спираль", состоящего из распознающей спирали, взаимодействующей с большой бороздкой в ДНК, и двух петель, или крыльев, по обе стороны спирали, которые взаимодействуют с малой бороздкой. Второе подсемейсво РО представляет NarL, – транскрипционный фактор, который и активирует, и репрессирует гены, участвующие в метаболизме нитрита и нитрата. NarL связывается со множественными "NarL гептамерами" – сайтами связывания – путем типичного HTH мотива. Наиболее сложное как структурно, так и функционально подсемейство РО представлено регулятором азотного метаболизма NtrC – энхансером транскрипции, активирующим содержащий σ 54 холофермент РНК-полимеразы. Эффекторная область белков этого подсемейства состоит из двух доменов – АТФазного и ДНК-связывающего HTH домена. Способные связываться с ДНК димеры NtrC после фосфорилирования олигомеризуются в октамеры. Олигомеризация стимулирует гидролиз АТФ что дает энергию для образования открытого комплекса и активации транскрипции. Активация фосфорилированием. Большое разнообразие эффекторных доменов ставит вопрос о том, как консервативный регуляторный домен может изменять активность таких разнообразных эффекторных доменов. Регуляторные домены РО существуют в виде находящейся в состоянии равновесия смеси активной и неактивной форм. Фосфорилирование регуляторного домена сдвигает равновесие в сторону активной формы, которая имеет существенно отличную поверхность. Различные молекулярные поверхности двух форм могут способствовать специфическим белок-белковым (или белок-ДНК) взаимодействиям. Поэтому любой тип регуляции, кототрый может быть осуществлен за счет меж- или внутримолекулярных взаимодействий, может использоваться семейством РО. Соответственно существуют различные механизмы активации РО. Каждый механизм основан на специфических регуляторных взаимодействях присущих фосфорилированному и(или) нефосфорилированному регуляторному домену. В некоторых случаях активация происходит за счет снятия ингибирования. При этом РО обычно можно активировать путем делеции регуляторного домена. В других случаях фосфорилированный регуляторный домен играет активную роль. Фосфорилирование - 32 - может способствовать взаимодействию с другими белками либо ди- или олигомеризации. Так, связывание OmpR с соседними операторными участками усиливается при взаимодействии его субъединиц между собой, которое усиливается при фосфорилировании; фосфорилирование NtrC способствует его олигомеризации в энхансерной области, что активирует транскрипцию. Некоторые белки используют комбинацию этих механизмов. Фосфорилирование обычно соответствует активации, но есть и исключения. Для двух РО с известной структурой известен точный механизм ингибирования эффекторного домена нефосфорилированным регуляторным доменом. В нефосфорилированном состоянии регуляторный домен экранирует активный сайт эффекторного домена, не давая последнему взаимодействовать с субстратом, каковым может являться ДНК (в случае транскрипционного фактора NarL) либо белок (рецептор хемотаксиса в случае метилэстеразы CheB, о которой мы поговорим чуть позже). Для обоих белков активация происходит за счет взаимного перемещения N- и C-концевых доменов в результате индуцированных фосфорилированием конформационных изменений. Недавно определенные структуры фосфорилированных регуляторных доменов нескольких белков подтверждают, что фосфорилирование вызывает протяженные структурные изменения, затрагивающие молекулярмую поверхность регуляторного домена. Фосфорилирование не изменяет общую третичную структуру и не вызывает существенных изменений во вторичной структуре. Единственным результатом фосфорилирования являются незначительные (на пару ангстрем) перемещения элементов вторичной структуры, которые, тем не менее, оказывают существенное влияние на молекулярную поверхность, изменяя ее топологические и электростатические характеристики. Индуцированные фосфорилированием конформационные изменения затрагивают большую поверхность регуляторного домена, которая может быть использована во взаимодействиях со многими мишенями. И действительно, многие РО взаимодействуют с несколькими молекулами – ГК, вспомогательные фосфатазы, эффекторные домены, другие регуляторные домены в составе димеров и, возможно, компоненты транскрипционного аппарата. Архитектура регуляторных систем Элегантность двухкомпонентвых систем заключается в их модулярности. Простейшая сигнальная система может состоять из одной пары ГК-РО. В более сложных случаях домены, входящие в состав ГК и РО, а также HPt-домены могут комбинироваться, образуя уже сигнальную цепочку или даже сеть, известную под назнанием фосфотрансляционная система (система передачи фосфата). Классические двухкомпонентные системы доминируют у прокариот, тогда как фосфотрансляционные системы чаще встречаются у эукариот (хотя прокариотические примеры тоже имеются). Дополнительная сложность фосфотрансляционных систем позволяет ввести дополнительные стадии контроля а также возможность взаимодействия между различными сигнальными путями. Большинство регуляторных систем устроены просто. Трансмембранная сенсорная ГК посредством одной реакции передачи фосфата активирует цитоплазматический РО, который вызывает ссответствующий адаптивный ответ. Типичным примером такой системы, использующей единичный перенос фосфата от His к Asp, является осморегуляторрная пара EnvZ-OmpR, контролирующая экспрессию поринов внешней мембраны OmpF и OmpC. Есть и вариации на эту тему, когда несколько ГК могут фосфорилировать один РО или одна ГК контролирует несколько РО, но в любом случае для таких простых систем имеет место только один акт передачи фосфата в направлении His -> Asp. Например, в системе контроля хемотаксиса одна ГК CheA фосфорилирует два РО, CheB и CheY. Еще более сложная ситуация встречается в системе контроля нитрат/нитрит-реагирующих генов, в которй две ГК, NarX и NarQ, контролируют два РО, NarL и NarP. Фосфотрансляционные системы Еще более усложненные версии двухкомпонентных систем используют более одного акта передачи фосфата. Такие сигнальные пути называют фосфотрансляционными системами (системами передачи фосфата). В простейшем случае фосфотрансляционная система удлиняет цепочку передачи фосфата на два шага, Asp -> His и His -> Asp. Таким образом, базовая фосфотрансляционная система имеет уже четыре фосфорилированных белковых продукта и пять реакций переноса фосфата: 1. Автофосфорилирование ГК: ГК-His 1 + АТФ ГК-His 1 Ф + АДФ - 33 - 2. 1-й перенос фосфата: ГК-His 1 Ф + РО 1 -Asp ГК-His 1 + РО-Asp 1 Ф 3. 2-й перенос фосфата: РО-Asp 1 Ф + HPt-His 2 РО-Asp 1 + HPt-His 2 Ф 4. 3-й перенос фосфата: HPt-His 2 Ф + РО-Asp 2 HPt-His 2 + РО-Asp 2 Ф 5. Дефосфорилирование: РО-Asp 2 Ф + H 2 O РО-Asp 2 + P I В этой схеме в качестве фосфорилируемых субстратов используются домены, содержащие консервативные остатки гистидина и аспартата. Эти домены могут существовать как изолированные белки или же быть соединенными ковалентно, как это имеет место в случае уже описанных гибридных гистидинкиназ. Система контроля споруляции B. subtilis (которую мы еще рассмотрим более подробно позднее) является примером His-Asp-His-Asp цепочки. В этой системе несколько ГК могут быть донорами фосфата для белка Spo0F. С Asp белка Spo0F фосфат затем переносится на HPt белок Spo0B и, наконец, на Asp транскрипционного фактора Spo0А. Множественные фосфорилируемые домены фосфотрансляционных систем создают возможность альтернативных путей передачи фосфата. В гибридной ГК ArcB любой из имеющихся His-содержащих доменов (димеризационный или же HPt) может получить фосфат от АТФ и передать его РО ArcA. Два различных варианта используются в аэробных и анаэробных условиях. Еще более сложная организация может достигаться за счет интеграции различных сигнальных цепочек в сигнальные сети. У B. subtilis практически каждая двухкомпонентная система взаимодействует с как минимум еще одной цепочкой передачи фосфата. В качестве примера такой интеграции можно привести взаимодействие путей, контролирующих утилизацию фосфата (PhoR/PhoP), аэробного и анаэробного дыхания (ResE/ResD) и споруляцию (KinA-B/Spo0A). Дыхание и утилизация фосфата регулируются совместно – фосфо-PhoP активирует экспрессию ResD и наоборот. Однако, когда клетка вступает на путь споруляции, и дыхание, и утилизация фосфата репрессируются, поскольку фосфо-Spo0A негативно регулирует фосфорилированные ResD и PhoP. Регуляторные механизмы Единственной видимой причиной, по которой регуляторные системы являются двух- (и более) – компонентными является сама необходимость контроля – двухступенчатый (или еще более сложный) сигнальный путь просто напросто создает те места, в которых клетка может контролировать поток информации. Различные регуляторные механизмы накладываются поверх базовых путей передачи фосфата, позволяя оптимизировать передачу фосфата для нужд каждой конкретной системы. Результатом работы некоторых систем является "количественный" ответ – так EnvZ-OmpR система обеспечивает различные уровни экспрессии генов поринов ompF и ompC. Другие регуляторные системы, как, например, система контроля споруляции у бацилл, дают качественный ответ типа "все или ничего". Вне зависимости от типа даваемого ответа любая система может иметь несколько уровней регуляции, зачастую с участием дополнительных белковых компонентов. Основными мишенями для такой регуляции являются активности ГК и дефосфорилирование РО. Регуляция активности ГК. ГК могут иметь две активности, способные контролировать уровень фосфорилирования РО: автокиназную и РО-фосфатазную. Не все ГК имеют фосфатазную активность – для некоторых возможна только регуляция автокиназной активности. С другой стороны, во многих системах именно фосфатазная активность подвержена основной регуляции. У типичных трансмембранных ГК сенсорные домены непосредственно связываются с лигандами либо детектируют физические стимулы. В более сложных системах детекция сигналов может происходить через взаимодействие с другими белковыми компонентами. Например, автокиназная активность ГК хемотаксиса CheA, которая образует комплекс с хеморецепторами и адаптерным белком CheW, ингибируется либо активируется сигналами, передаваемыми от хеморецепторов (путем конформационных изменений). РО-фосфатазная активность цитоплазматической ГК NtrB регулируется - 34 - дополнительным белком P II , чья способность взаимодействовать с NtrB зависит от его уридилированности, которая, в свою очередь, связана с концентрацией внутриклеточного азота. Активность ГК может также регулироваться дополнительными доменами. Например, сенсор тургора KdpD содержит дополнительных АТФ-связывающий домен, и связывание (но не гидролиз) АТФ необходимо для проявления фосфатазной активности. Регуляция дефосфорилирования РО Как мы уже обсуждали, многие РО имеют автофосфатазную активность, необходимую для поодержания надлежащих временных параметров системы (времени существования РО в фосфорилированном состоянии). На дефосфорилирование РО также может влиять фосфатазная активность ГК, регулируемая различными механизмами. В дефосфорилировании некоторых РО участвуют вспомогательные белки. Система споруляции бацилл имеет набор строго регулируемых фосфатаз (RapA, RapB, RapE), которые дефосфорилируют Spo0F, и еще одну фосфатазу, которая дефосфорилирует Spo0A. В системе хемотаксиса вспомогательный белок CheZ олигомеризуется с фосфо-CheY и стимулирует его дефосфорилирование. Фосфатазы фосфоаспартата имеют настолько высокую специфичность по отношению к белкам- субстратам, что возникает вопрос – действительно ли они непосредственно катализируют гидролиз или же просто стимулируют присущую РО автофосфатазную активность. Другие способы регуляции Некоторуе системы могут иметь дополнительные и зачастую специфические механизмы контроля. Например, может регулироваться сам перенос фосфата. Так, у гибридной киназы VirA из A. tumefaciens карбоксиконцевой Asp-содержащий домен влияет на автокиназную активность киназного ядра путем физического взаимодействия с сайтом автофосфорилирования. Дополнительная возможность регуляции создается в тех случаях, когда ГК фосфорилирует более одного РО. В этих случаях конкуренция за фосфат может влиять на активацию различных ветвей сигнального пути. Наконец, еще один способ регуляции РО – контроль экспрессии его гена. Многие из двухкомпонентных систем, регулирующих транскрипцию, подвержены авторегуляции. В таких системах фосфо-РО действует как активатор или репрессор оперона, кодирующего ГК и РО. Литература: 1. A.M. Stock, V.L. Robinson and P.N. Goudreau. Two-component signal transduction. Annu. Rev. Biochem. 2000. 69:183-215 |