Рис.2.2. Катаболитная репрессия у Escherichia coli
Рис.2.3. Катаболитная репрессия у Bacillus subtilis
- 14 -
bgl оперон – ФТС и антитерминация.
bgl оперон E. coli (криптический) состоит из трех генов: bglG, кодирующего позитивный регулятор (антитерминатор), bglF, кодирующего ФТС транспортер
β-глюкозидов и bglB, кодирующий фермент, гидролизующий
β-глюкозиды. Контроль экспрессии оперона осуществляется ри помощи двух терминаторов – в лидерной области и между bglG и bglF. BglF фосфорилируется ФТС белками и в присутствии
β-глюкозидов сбрасывает фосфатную группу на эти сахара в процессе их транспорта. BglF также может выступать в роли киназы, перенося свой фосфат на BglG, и в роли фосфатазы, дефосфорилируя BglG.
Терминаторные области bgl оперона содержат по два перекрывающихся участка, способных образовывать альтернативные шпилечные структуры. Связывание BglG с первой шпилькой препятствует образованию второй, являющейся терминатором. BglG активно связывается с РНК (и выполняет антитерминаторную функцию) только в форме димера. Фосфорилирование BglG переводит его в мономерную форму и препятствует связыванию с РНК. В присутствии
β-глюкозидов BglF фосфорилирует их и дефосфорилирует BglG; при отсутствии субстрата BglF фосфорилирует BglG, что блокирует антитерминацию. Этот пример показывает эффективное использование фосфорилирующей способности транспортного белка для детекции сигнала из внешней среды и трансформации его в изменение экспрессии генов через белковые взаимодействия. sac genes of B. subtilis
3. Альтернативные сигма-факторы РНК-полимеразы
Узнавание промотора у бактерий требует ассоциации кор-фермента РНК-полимеразы (
ββ'α
2
) с сигма (
σ) субъединицей, что дает активный холофермент (Рис. 3.1). Все свободноживущие бактерии содержат множественные сигма-факторы (у некоторых бактерий описано до 10-20). К числу таковых относятся основной сигма-фактор, контролирующий гомеостатические функции, и альтернативные сигма-факторы, активируемые специфическими сигналами или стрессовыми условиями (Табл. 3.1). Как правило, только один
σ- фактор обеспечивает транскрипцию всех жизненно важных генов, обеспечивающих гомеостатические клеточные процессы (репликацию ДНК, транскрипцию, трансляцию и т.д.). Этот сигма-фактор называют основным, а все остальные – альтернативными.
Инактивация основного
σ-фактора летальна, альтернативных, как правило, – нет. Названия сигма- факторов соответствуют их молекулярной массе
(например
σ
38
). Все гены, кодирующие
σ-факторы, имеют аббревиатуру rpo (RNA polymerase), поэтому для обозначения сигма-факторов также пользуются четырехбуквенные имена (например RpoS).
Основной
σ-фактор E. coli имеет молекулярную массу около 70 kDa и обозначается
σ
70
или RpoD.
Альтернативный
σ-фактор, контролирующий большинство генов азотного метаболизма, имеет размер 54 kDa, и соответственно обозначается
σ
54 или
RpoN. Эти два белка не похожи друг на друга ни по рервичной последовательности, ни по структуре, и
Рис.3.1. Инициация транскрипции у
прокариот
- 15 - являются прототипами двух больших семейств
σ-факторов. Все основные и большинство альтернативных
σ-факторов принадлежат к семейству σ
70
. Альтернативные
σ-факторы этого семейства, в свою очередь, могут быть сгруппированы в три подсемейства, контролирующих споруляцию, подвижность и разнообразные внецитоплазматические функции (синтез секретируемых белков, транспорт железа, реакция на различные стрессовые воздействия). Представители семейства
σ
54 также присутствуют у многих бактерий и контролируют азотный метаболизм, синтез ряда гидролаз и жгутиковых белков.
Таблица 3.1. Сигма-факторы Escherichia coli
Сигма- фактор
Размер белка,
АК
Контролируемые процессы
Количество подконтрольных генов
RpoD 613 большинство жизненно важных генов
1000
RpoS 330 общий стресс и стационарная фаза 100
RpoH 284 тепловой шок 40
RpoF 239 жгутиковый аппарат и хемотаксис
RpoE 202 внецитоплазматические гены и экстремальный тепловой шок
5
FecI 173 транспорт цитрата железа и внецитоплазматические гены 5
RpoN 477 азотный метаболизм 15
Основной
σ-фактор E. coli имеет молекулярную массу около 70 kDa и обозначается σ
70
или RpoD.
Альтернативный
σ-фактор, контролирующий большинство генов азотного метаболизма, имеет размер
54 kDa, и соответственно обозначается
σ
54 или RpoN. Эти два белка не похожи друг на друга ни по рервичной последовательности, ни по структуре, и являются прототипами двух больших семейств
σ- факторов (Рис. 3.2). Все основные и большинство альтернативных
σ-факторов принадлежат к семейству
σ
70
. Альтернативные
σ-факторы этого семейства, в свою очередь, могут быть сгруппированы в три подсемейства, контролирующих споруляцию, подвижность и разнообразные внецитоплазматические функции
(синтез секретируемых белков, транспорт железа, реакция на различные стрессовые воздействия).
Представители семейства
σ
54 также присутствуют у многих бактерий и контролируют азотный метаболизм, синтез ряда гидролаз и жгутиковых белков.
Последовательности промоторов, опознаваемых альтернативными сигма-факторами, существенно различаются и, как правило, не могут быть распознаны более чем одной сигма-субъединицей.
Исключение – RpoD и RpoS
(схема - промоторы)
Будучи глобальными регуляторами, сигма факторы, как правило, не детектируют изменение условий сами, а полагаются в этом на другие белки. Сигма-факторы обычно
Рис.3.2. Структурно-функциональная организация
сигма-факторов.
- 16 - являются конечным либо (реже) промежуточным звеном какого-либо регуляторного каскада. Именно поэтому сигма-факторы обычно сами подвержены регуляции, причем осуществляться она может на транскрипционном, трансляционном и посттрансляционном уровнях.
σ
-факторы бактериофагов. Каскадная регуляция экспрессии генов. Однако исторически одними из первых были открыты альтернативные сигма-факторы, участвующие в каскадной активации генов при литическом цикле развития некоторых бактериофагов.
Классический пример - бактериофаг SPO1
B. subtilis. Литический цикл бактериофага можно разделить на три стадии. Сразу после инфекции транскрибируются ранние гены бактериофага. Они считываются с типичных бактериальных промоторов бактериальным холоферментом с основной сигма-субъединицей
(
σ
55
у
B. subtilis). Очередность транскрипции средних и поздних генов определяется тремя фаговыми генами, 28, 33 и 34. Продукт гена 28, обозначаемый gp28, является сигма-фактором. Замещая основной сигма-фактор, он позволяет РНК-полимеразе считывать средние гены бактериофага. Продукты средних генов 33 и 34, gp33 и gp34, замещают gp28, снова изменяя промоторную специфичность РНК- полимеразы, которая становится способной считывать теперь уже только промоторы поздних фаговых генов. Таким образом, альтернативные сигма-факторы позволяют бактериофагу полностью переключить транскрипционный аппарат хозяйской клетки на считывание своих собственных генов.
rpoS У
E. coli важнейшим сигма-фактором является
σ
s
, продукт гена
rpoS. Этот сигма-фактор наиболее близок по своей аминокислотной последовательности к основной сигме 70. Промоторы этих сигма- факторов тоже очень похожи, но, несмотря на это, специфичны каждый для своего сигма-фактора
in vivo. Буква S в названии
σ
s
происходит от стационарной фазы роста, на протяжении которой этот фактор был впервые обнаружен. Затем присутствие этого сигма-фактора было обнаружено в других стрессовых условиях, и сейчас считается, что присутствие
σ
s является свидетельством т.н. «общего стрессового ответа». Этот ответ наблюдается, когда клетка сталкивается с рядом стрессовых ситуаций, видимым признаком чего является снижение скорости роста вплоть до вхождения в стационарную фазу.
Голодание, повышение осмолярности среды или понижение pH, неоптимальная температура – эти и другие стрессовые воздействия могут индуцировать общий стрессовый ответ. Физиологические последствия общего стрессового ответа включают устойчивость к многим стрессовым воздействиям, накопление запасных питательных веществ, изменения структуры клеточной стенки (увеличение частоты кросс-сшивок в пептидогликане) и изменение морфологии клетки (уменьшение общего размера и укорачивание клеток – они становятся почти сферическими).
Во время логарифмической фазы роста в лабораторных условиях клетки
E. coli практически не содержат
σ
s
, и потому мутанты по
rpoS не имеют видимых дефектов. В этих условиях большинство молекул РНК-полимеразы экспрессируют гомеостатические гены и имеют в своем составе главный сигма-фактор
σ
70
(продукт гена
rpoD). Эта ситуация меняется, как только клетки подвергаются какому- либо стрессу, то есть попадают в условия, не оптимальные для роста. В этих условиях
σ
s индуцируется до уровня 30% от количества
σ
70
, что приводит к появлению достаточного количества РНК полимеразы в комплексе с
σ
s и индукции большого числа (не менее 100)
σ
s
-зависимых промоторов. Активируемые гены жизненно необходимы для выживания в стрессовых условиях, например, в стационарной фазе.
При адаптации к стрессовой ситуации
σ
s действует как быстро индуцируемый координатор стрессового ответа, а также как основной регулятор долговременной адаптации со сложными физиологическими последствиями. Первая функция
σ
s очевидна при быстрой, но краткосрочной индукции
σ
s при переходе клетки с утилизации глюкозы на лактозу. Как вы помните, при выращивании бактерии на смеси двух углеводов наблюдается феномен диауксии – фаза логарифмического роста, во время которой бактерии используют предпочтительный углевод, затем плато, когда происходит перестройка метаболизма и второй этап логарифмического роста.
Прежде чем клетка начнет утилизацию лактозы, ФТС глюкозы должна полностью освободиться от субстрата, должен накопиться цАМФ, что и приведет к индукции
lac-оперона. Как раз накопление цАМФ и зависит от
σ
s
– кратковременное появление этого
σ-фактора и активация σ
s
-зависимых генов предшествуют накоплению цАМФ и необходимы для этого.
Количество активной
σ
s субъединицы контролируется на уровне транскрипции, трансляции и путем протеолиза. Различные стрессовые условия по-разному влияют на эти уровни регуляции. Даже в
- 17 - условиях быстрого роста, когда белок
σ
s не детектируется, присутствует достаточно много мРНК rpoS.
Формирование вторичной структуры этой мРНК препятствует ее трансляции. Для активации трансляции этой мРНК необходимо действие небольшого РНК-связывающего белка Hfq (HF-I). Кроме того, транскрипция rpoS в стрессовых условиях также возрастает.
Такой механизм регуляции уровня
σ
s используется в тех стрессовых условиях, которые требуют длительной адаптации. В тех же случаях, когда требуется быстрое реагирование на внезапные изменения условий, такие как внезапное голодание, сдвиг pH, повышение температуры и осмолярности среды, увеличение к-ва
σ
s происходит за счет предотвращения ее протеолиза. Протеолиз
σ
s происходит за счет протеазы ClpXP при помощи регуляторного белка RssB. Нестабильность
σ
s определяется короткой последовательностью аминокислотных остатков, которая отсутствует у
σ
70
. RssB узнает эту последовательность и выступает в роли субстрат-узнающего фактора для ClpXP протеазы. Сродство
RssB к
σ
s изменяется в зависимости от его фосфорилирования/дефосфорилирования, которое каким-то образом связано со стрессовыми условиями.
Каковы же гены-мишени, активируемые
σ
s
? Их более сотни, и все они в той или иной степени выполняют функцию адаптации к стрессовым условиям. В качестве примеров можно привести активацию генов клеточного деления ftsQAZ и активацию системы защиты от активного кислорода. В последнюю входят каталазы KatE, KatG и протекторный белок Dps, непосредственно защищающий
ДНК от перекиси водорода.
В клетках, находящихся в стрессовых условиях, две формы РНК полимеразы, E
σ
s и E
σ
70
, сосуществуют и обеспечивают экспрессию различных генов. Тем не менее, промоторные последовательности генов, контролируемых E
σ
s
, очень сходны с таковыми зависящих от E
σ
70
– вплоть до того, что в экспериментах in vitro оба холофермента достаточно хорошо транскрибируют оба типа промоторов. (Хотя E
σ
s все же менее требователен к –35 последовательности)
Как же тогда обеспечивается специфичность
σ
s
-зависимых промоторов? Экспрессия многих генов регулона модулируется глобальными регуляторами H-NS, Lrp, cAMP-CRP, IHF и Fis. Часть из этих факторов является распространенными гистоноподобными белками с не очень ясными функциями.
Зачастую несколько белковых факторов одновременно контролируют транскрипцию с
σ
s
-зависимых промоторов. Также часто встречается ситуация, когда один и тот же ген транскрибируется с двух промоторов, зависящих от разных факторов. В таких случаях транскрипция с
σ
s
–зависимого промотора зачастую зависит от дополнительного белкового регулятора, тогда как транскрипция с
σ
70 промотора конститутивна.
rpoE
Итак, мы разобрали функции и принцип активации
σ
s
, сигма-фактора, наиболее близкого к основному сигма-фактору
σ
70
. Другие сигма-факторы менее сходны с
σ
70
по своей последовательности и опознают промоторы, не имеющие ничего общего со "стандартным" промотором
σ
70
(Таблица с последовательностями промоторов для разных сигм)
Рассмотрим принцип действия другого сигма-фактора E. coli,
σ
E
. Этот белок принадлежит к большому семейству ECF (extracytoplasmic factors) сигма-факторов. Свое название эти сигма-факторы получили в связи с их участием в регуляции экспрессии внецитоплазменных белков
(периплазматических, внешней мембраны и секретируемых во внешнюю среду). Основная функция
σ
E
- обеспечивать синтез белков, ответственных за нормальный фолдинг (сворачивание) белков внешней мембраны, но, кроме того,
σ
E
усиливает транскрипцию генов теплового шока (путем активации еще oдного сигма-фактора,
σ
32
), а у патогенных бактерий родственные сигма-факторы активируют гены вирулентности.
σ
E
реагирует на белки внешней мембраны и периплазматические белки, утратившие нормальную конформацию. Но поскольку сигма-фактор, естественно, является цитоплазматическим, а сигнал для его активации находится в периплазме, должен быть какой-то переносчик сигнала между двумя клеточными компартментами. Эту функцию выполняет мембранный белок RseA. В отсутствие сигнала
σ
E
инактивирован путем связывания с RseA. Эта инактивация усиливается за счет взаимодействия RseA с периплазматическим белком RseB. При нарушениях внешней мембраны, предотвращающих нормальный фолдинг ее белков, RseB связывается с неправильно свернутыми белками, освобождая
RseA. Это ведет к ослабеванию связи RseA с
σ
E
, а дополнительное взаимодействие неправильно
- 18 - свернутых белков с RseA окончательно освобождает
σ
E
, который связывается с РНК-полимеразой и активирует транскрипцию ряда генов (Рис. 3.3). В число этих генов входят:
fkpA, кодирующий периплазматический шаперон (необходимый для нормального фолдинга периплазматических белков и белков внешней мембраны);
degP - периплазматическая протеаза, деградирующая ненормальные или неправильно свернутые белки;
rpoH - сигма-фактор, активирующий транскрипцию генов теплового шока; собственный оперон
rpoE rseABC; гены вирулентности у ряда бактерий.
Поскольку
σ
E
активирует транскрипцию своего собственного оперона, первоначальная индукция по механизму положительной обратной связи резко усиливается за счет дополнительного синтеза
σ
E
. А поскольку одновременно с
σ
E
происходит сверхпродукция негативных регуляторов RseA и
RseB, вся система быстро выключается, как только периплазма оказывается очищенной от неправильно свернутых белков.
У ряда бактерий система
σ
E
была адаптирована для контроля генов вирулентности. Так, у
P. aeruginosa гомолог
σ
E
(AlgU) регулирует экспрессию генов
alg, кодирующих синтез мукоидной капсулы, необходимой для установления хронических инфекций.
Так же, как и у
E. coli, до поступления сигнала сигма-фактор инактивирован взаимодействием с другим белком, MucA. Сигнал для активации AlgU скорее всего продуцируется на начальных этапах инфекции, например, в виде повышенной температуры, мешающей нормальному фолдингу белков оболочки.
Белки RseA и MucA принадлежат к классу регуляторов, известных как анти-сигма факторы.
Принцип работы этих белков прост - связываясь с сигма-факторами, они препятствуют их взаимодействию с РНК-полимеразой. Кроме
σ
E
регулона, анти-сигма факторы участвуют в контроле регулонов, активируемых
σ
28
(биосинтез жгутиков) и
σ
F
(ранние стадии споруляции
B. subtilis).
Наиболее интересный пример действия анти-сигма факторов представляет регуляция процесса биогенеза жгутиков, хорошо изученная у
Salmonella typhimutium. Синтез поздних жгутиковых генов
(кодирующих флагеллин и хемотаксические функции) зависит от альтернативного сигма фактора
σ
28
Во время ранних стадий синтеза жгутиков
σ
28
находится в инактивированном состоянии за счет взаимодействия с анти-сигма фактором FlgM. Как только базальное тело и крюк оказываются собранными, FlgM секретируется через жгутик, высвобождая активный
σ
28
. Высвобождение
σ
28
приводит к началу транскрипции поздних жгутиковых генов, одним из продуктов которых является флагеллин - белок, из субъединиц которого собрана нить жгутика. А поскольку субъединицы флагеллина экспортируются через тот же канал, что и FlgM, создается препятствие для выхода FlgM из клетки, из-за чего его уровень внутри клетки снова возрастает.
Литература: 1. D. Missiakas and S. Raina. The extracytoplasmic function sigma factors: role and regulation. Mol Microbiol
1998 28(6):1059-1066
Скачать 2.61 Mb.