ЛЕКЦИИ Регуляция метаболизма Курс лекций. Е.А. Николайчик. Курс лекций Минск 2002 II
 Скачать 2.61 Mb.
|
|
Секреторный аппарат первого типа. Белки, секретируемые по первому пути, не имеют сигнальных пептидов и не используют т.н. общий секреторный путь (GSP), зависимый от sec генов. Эти белки в процессе секреции полностью - 72 - минуют периплазму и секретируются непосредственно во внешнюю среду. Секреторный аппарат первого типа устроен относительно просто. Во всех случаях он состоит из трех белков. Первый принадлежит к классу АТФаз, называемых ABC транспортерами и обеспечивает энергозависимые стадии процесса транспорта. Этот белок является цитоплазматическим и ассоциированным с димерным белком, обеспечивающим слияние цитоплазматической и наружной мембраны и фактически образующим канал, через который и транспортируется секретируемый белок. И третий белок- швейцар (gatekeeper) локализован во внешней мембране. Его функция - запирать мембранный канал, когда субстрат отсутствует. Как правило, гены, кодирующие все три компонента секреторного аппарата, организованы в оперон, обычно вместе с геном (генами), кодирующим секретируемый белок. Секреторный Специфичность Несколько систем в одной бактерии. Субстраты Сигнал для секреции через аппарат 1-го типа располагается в их C-конце, обычно в пределах последних 60 АК. Секреторный аппарат опознает характерную последовательность вторичной структуры - две альфа-спирали, соединенные между собой гибким линкером. Секреторный аппарат второго типа (GSP). Из всех систем секреции только эта, а точнее, ее часть, ответственная за экспорт белков в периплазму - Sec система, - является необходимой для жизнеспособности клетки; гомологичные экспортные системы были найдены у архей и эукариот. Через секреторный аппарат II типа транспортируются разнообразные белки, такие как пектатлиазы, полигалактуроназы, пектинметилэстеразы и целлюлазы у эрвиний (по нескольку изоферментов каждого класса); полигалактуроназа, целлюлаза, протеаза и амилаза у Xanthomonas campestris; липаза, фосфолипаза, эластаза, энтеротоксин А и щелочная фосфатаза у Pseudomonas aeruginosa; пуллуланаза у Klebsiella oxytoca. Именно в связи с большим числом и разнообразием субстратов, секретируемых через аппарат II типа его зачастую называют "общим секреторным путем" (General Secretory Pathway, GSP). Характерной чертой аппарата второго типа является секреция белков в две стадии. Сначала они экспортируются через цитоплазматическую мембрану, где в случае Грам-положительных бактерий их секреция и заканчивается. В случае Грам-отрицательных бактерий белки оказываются в периплазме, и либо остаются там (и тогда говорят не о секреции, а об экспорте), либо встраиваются во внешнюю мембрану, либо секретируются во внешнюю среду посредством одной из терминальных ветвей GSP. Sec система. В отличие от секреции у эукариот, секреция через бактериальную плазматическую мембрану протекает в основном посттрансляционно. Работу Sec системы можно разделить на три стадии: - направление белка на транспорт - собственно транслокация белка через мембрану - освобождение транспортированного белка на периплазматической стороне мембраны На первой стадии пребелки направляются к точкам секреции в цитоплазматической мембране (местам, где собран транслокационный комплекс). На второй стадии полипептидная цепочка пересекает липидный бислой, скорее всего через транслоказу. На третьей стадии транслоцированный полипептид Рис.13.1. Секреторный аппарат I типа - 73 - освобождается и либо принимает свою нативную конформацию, либо направляется для дальнейшей секреции в одну из терминальных ветвей GSP. Как минимум 10 белков необходимы для работы Sec системы (Рис. 13.2). Первая стадия реакции требует присутствия специфичного для секреции шаперона SecB. Этото шаперон является тетрамером, опознает белки, содержащие сигнальный пептид, и связывается с ними, выполняя фактически функцию молекулярного шаперона, связываясь с областями пресекреторных белков, не принявшими свою окончательную конформацию и поддерживая их в компетентном для транслокации состоянии. Второй функцией SecB является "доставка" предшественников белков к SecA субъединице мембранной транслоказы. В некоторых случаях могут привлекаться гомеостатические шапероны GroEL и DnaK. Вторая стадия реакции катализируется сложным белковым комплексом, расположенным в цитоплазматической мембране - транслоказой. Транслоказа содержит пронизывающий мембрану канал, состоящий из субъединиц трех белков, SecY, SecE и SecG. Эти три белка являются интегральными мембранными белками, составляющими структурную основу транслоказы - каркас или раму. SecY - интегральный мембранный белок (10 НТМ - стр-ра подобная мембр транспортерам, напр, LacY). SecE имеет три трансмембранных сегмента, SecD и SecF - шесть. А «мотором» транслокационный машины служит АТФаза SecA. Этот белок уникален для бактерий - эукариоты используют другую транслокационную АТФазу. SecA - большая вытянутая димерная молекула, содержащая два домена - амино-концевой АТФазный и карбокси-конец, необходимый для димеризации. Карбокси-концевой домен позволяет SecA связаться с SecYEG, что создает функциональную основу транслоказы. Дополнительные субъединицы транслоказы SecD и SecF оптимизируют секреторную реакцию. Источником энергии для секреции служит АТФ и протондвижущая сила (ускоряет транслокацию). Сигналом для секреции служит т.н. лидерная или сигнальная последовательность, отщепляемая после транслокации специфической сигнальной пептидазой. Есть несколько сигнальных пептидаз, каждая из которых отщепляет сигнальные пептиды специфического класса секретируемых белков: Сигнальная последовательность: ++hhhhhhhhhhhhhhhh(PG)NNANAP Oor- (LepB - основная) ++hhhhhhhhhhhhhLNACD Oor- (LspA - для липопептидов) ++QRGFhhhhhhhhhhhh NNNNNN (GspO) ^ Сигнальная последовательность липопротеинов обязательно содержит цистеин, который модифицируется до глицерилцистеина перед отрезанием сигн. пептида, и именно здесь затем присоединяются жирные кислоты. Сигнальные пептиды отрезаются лидерной пептидазой в момент транспорта белка через цитоплазматическую мембрану. SecB направляет связанный белковый предшественник к мембранной транслоказе, связываясь с SecA, ассоциированным с SecYEG. Кроме того, после такого связывания сигнальный пептид связывается с карбокси-концевым доменом SecA, что еще более усиливает взаимодействие SecA-SecB. Это взаимодействие вызывает высвобождение зрелой части белкового предшественника из комплекса с SecB. Пре-белок таким образом переносится от SecB к SecA. Рис.13.2. Sec-система - 74 - SecA (мутанты нежизнеспособны). Димер. АТФаза. Гидрофильный белок, но часто обнаруживается в ассоциации с мембраной и рибосомами. В определенных условиях in vitro присутствия только белка SecA может быть достаточно для транслокации белков через мембрану. Присутствует в клетке в большом избытке по сравнению с другими Sec-белками. Связывается сильно с SecY. Периплазма После экспорта в периплазму Sec-системой некоторые белки могут здесь и задержаться (причем большинство периплазматических белков олажется заякоренным в цитоплазматической мембране). Часть белков, однако, следует дальше и секретируется во внешнюю среду, причем такая секреция может осуществляться как минимум тремя различными способами. Выход белка в периплазму в чем-то похож на его выход с рибосомы. Белок проходит через Sec- аппарат практически в полностью развернутом состоянии, поэтому перед ним вновь возникает проблема фолдинга. И, хоть большинство секретируемых белков способны сами справиться с этой проблемой, в периплазме, так же как и в цитоплазме, присутствуют шапероны. Кроме классических шаперонов фолдингу способствуют еще и белки DsbA и DsbC, являющимися дисульфидизомеразами. Функцией этих белков является образование дисульфидных мостиков между цистеиновыми остатками. Дисульфидные связи присутствуют у многих секретируемых белков. Такие связи обычно стабилизируют третичную структуру белка и совершенно необходимы для его функционирования. Дисульфидные мостики не могут образоваться в восстановительной среде цитоплазмы (к тому же появление таких связей препятствовало бы секреции), поэтому они образуются в периплазме, чему и способствуют ферменты DsbA и DsbC. Если зрелый белок должен содержать дисульфидные связи, без их образования под действием DsbAC секреция за пределы периплазмы, как правило, невозможна. Основная терминальная ветвь GSP JMB659 –GspEL interaction, good intro Секреция во внешнюю среду белков, имеющих периплазматические интермедиаты, может происходить несколькими путями, называемыми "терминальнуми ветвями общего секреторного пути". Мы разберем работу только одного пути, который считают основным (Рис.13.3). Основная терминальная ветвь GSP лучше всего изучена у клебсиелл и эрвиний. У обоих бактерий (впрочем, как и у всех остальных, изученных в этом отношении) все гены, кодирующие компоненты терминальной ветви, собраны в один кластер размером 13-15 т.п.н., в котором локализовано 12-15 генов. По историческим причинам эти гены называются по-разному – pul у клебсиелл, out у эрвиний, но мы будем пользоваться аббревиатурой gsp, принятой у некоторых бактерий и наилучшим образом отражающей функцию этих генов. Мутанты по gsp генам накапливают в норме секретируемые продукты в периплазме, что свидетельствует в пользу того, что первая стадия (экспорт) проходит у таких мутантов нормально, и аппарат gsp нужен только для транспорта через внешнюю мембрану. Поэтому логично было бы предположить, что белки Gsp будут локализованы во внешней мембране или в периплазме. К удивлению исследователей, большая часть этих белков опронизывает цитоплазматическую мембрану, а один (GspE) вообще локализуется в цитоплазме. В большинстве случаев (GspGHIJKMN) белки имеют битопную конформацию с цитоплазматически локализованным N-концом и периплазматическим C-концом, причем Рис.13.3. Основная терминальная ветвь общего секреторного пути - 75 - большая часть белка локализуется все-таки в периплазме. GspL имеет такую же топологию, но с большей частью, расположенной в цитоплазме. GspO и GspF являются политопными мембранными белками с несколькими пронизывающими мембрану доменами. Функции четко известны не для всех Gsp белков. GspO – специфическая пептидаза для N- концевых секреторных сигналов белков GspGHIJ(К?). Мишень, на которую действует пептидаза у каждого из этих четырех белков, такая же, как и у предшественников мономеров пилина, из которых складываются пили IV типа у некоторых бактерий (например, P. aeruginosa). Препилины процессируются пептидазой PilD, оставляющей метилированный остаток Phe на N-конце процессируемого белка. Поскольку белки GspGHIJ имеют типичный сайт разрезания N-MePe- пептидазой и процессируются при помощи GspO, их называют "псевдопилинами", хотя они и не участвуют в образовании пилей. К тому же, в отличие от пилинов, после процессинга псевдопилины не освобождаются, а остаются заякоренными в цитоплазматической мембране своими N-концевыми гидрофобными участками. Поэтому функция процессинга остается не совсем ясной, хотя и очевидно, что процессинг псевдопилинов необходим для нормальной сборки секреторного аппарата, поскольку мутанты по GspO к секреции не способны. Белок GspE является цитоплазматическим и, тем не менее, совершенно необходим для секреции. Этот белок является типичным представителем ABC-транспортеров, и скорее всего является транспортной АТФазой, обеспечивающей энергией какие-то стадии секреторного процесса (скорее всего, сборку псевдопилюса), что осуществляется через белок GspL (показано его взаимодействие с GspE). Только два компонента секреторного аппарата, GspD и GspS локализованы во внешней мембране. GspD принадлежит к крупному классу секретинов, представители которого обязательно присутствуют во всех аппаратах секреции не только II, но и III типа. Гомомультимеры этого белка образуют цилиндрическую пору во внешней мембране, через которую и выходит из клетки секретируемый продукт. Белок имеет два четко выраженных домена. C-концевой необходим для мультимеризации белка во внешней мембране. N-концевой домен является периплазматическим и, скорее всего, именно он отвечает за видоспецифичность аппарата секреции. Липопротеин GspS является специфическим шапероном для GspD, защищая его от протеолиза и способствуя инсерции GspD во внешнюю мембрану. На сегодняшний день нет устоявшегося мнения о том, как работает аппарат GSP. Скорее всего, многочисленные компоненты GSP взаимодействуют друг с другом, образуя трансмембранную структуру, простирающуюся от цитоплазматической стороны внутренней мембраны, через периплазму вплоть до внешней мембраны. Показано, что экспрессия GspE должна предварять синтез остальных белков аппарата термнальной ветви GSP. Возможно, что гидролиз АТФ вызывает у N-концевого домена GspL, ассоциированного с GspE, конформационное изменение, которое передается через мембрану периплазматическому домену GspL, что и вызывает сборку периплазматических компонентов терминальной ветви GSP. Система секреции II типа высоко специфична. Несмотря на то, что белки-компоненты секреторного аппарата очень сходны друг с другом, их субстраты не будут секретироваться даже очень близкородственными бактериями. Так, например, пектатлиазы E. carotovora не будут секретироваться из близкородственного вида E. chrysanthemi, несмотря на то, что сходство белков секреторного аппарата превышает 90%. Это свидетельствует о том, что аппарат секреции содержит какой-то видоспецифический компонент. Наблюдается своеобразный парадокс: с одной стороны, каждая бактерия способна секретировать совершенно структурно несходные белки – пектатлиазы, целлюлазы, полигалактуроназы и т.д., а с другой – неспособна секретировать практически идентичную пектатлиазы из близкородственного вида. Регуляция GSP Как всегда в случае громоздкой белковой системы, клетка заинтересована в том, чтобы энергоемкий синтез большого количества белков происходил только тогда, когда он необходим. Поэтому большинство оперонов, входящих в GSP-кластеры у различных бактерий, четко регулируется, хотя и по-разному у различных видов. Так, pul гены Klebsiella контролируются активатором MalT, а out гены эрвиний - репрессором KdgR. В обоих случаях экспрессия белкового аппарата, необходимого для секреции факторов вирулентности, произойдет при контакте с хозяином и появлении соответствующего индуктора – мальтозы или продуктов метаболизма клеточных стенок растений. Кроме того, экспрессия - 76 - Gsp-белков у многих патогенов (эрвиний, псевдомонад и т.д.) зависит от фазы роста и индуцируется при возрастании плотности популяции. Сходные опероны ряда организмов Фенотип мутантов Реконструкция Out пути в E. coli Секреторный аппарат III типа 1.1.Специфика аппарата секреции III типа и его компоненты. Системы секреции III типа жизненно необходимы для многих патогенов животных и растений, таких как Bordetella bronchiseptica, Burkholderia pseudomallei, Chlamydia pitsitacii, Erwinia amylovora, Erwinia crysanthemi, энтеропатогенные Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas syringae, Ralstonia solanacearum, Rhizobia spp., Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Xanthomonas campestri, и три вида Yersinia. Отличительными чертами этих систем секреции являются доставка факторов вирулентности непосредственно в клетку эукариотического хозяина (хотя часть белков, секретируемых по этому пути, остается связанной с поверхностными структурами бактерии или попадает в среду), а также использование большого количества специфических секреторных шаперонов. Больше всего информации о системе секреции III типа имеется для патогенов животных, где более или менее четко показаны функции нескольких белков. Наиболее хорошо система секреции III типа изучена у иерсиний (Рис. 13.4). Yersinia spp. секретируют как минимум 14 различных Yop белков (Yersinia outer proteins) по этому пути. Гены, кодирующие Yops, так же как и гены, кодирующие секреторный аппарат, (ysc, Yop secretion genes) расположены на плазмиде вирулентности. Повышение температуры до 37°C, происходящее, например, при попадании бактерии в организм человека, индуцирует экспрессию секреторного аппарата III типа. Высокая концентрация кальция во внеклеточной среде тканей человеческого тела ингибирует секреторный аппарат, однако контакт с клеткой хозяина вызывает секрецию Yop-белков, причем в данном случае происходит не только секреция, но и транслокация белков непосредственно в клетки лимфоидных тканей, где иерсинии и размножаются. Секреторный аппарат III типа Yersinia spp. состоит из как минимум 24 Ysc белков, 11 из которых консервативны у всех секреторных систем этого типа (включая таковые патогенов растений). Некоторым Рис.13.4. Секреторный аппарат III типа - 77 - сходством с аппаратом секреции III типа обладает система сборки бактериального жгутика – из 11 консервативных секреторных генов здесь присутствует 10. Не хватает только yscC, кодирующего белок внешней мембраны (секретин), через который Yop белки и попадают во внешнюю среду. Этот секретин является единственным белком системы секреции III типа, имеющим сходство с другими секреторными белками, а именно с секретином GspD из аппарата секреции II типа. Предполагается, что 11 консервативных компонентов (Hrc-белков) формируют белок-проводящий канал, который пронизывает обе клеточные мембраны грамотрицательных бактерий. Такая структура была изолирована и охарактеризована для системы сборки бактериального жгутика (называемой также базальным телом). Секреторный аппарат базального тела транспортирует субъединицы крюка и флагеллин, которые после секреции полимеризутся и образуют длинный филамент, обеспечивающий подвижность бактерий. Секреторный аппарат III типа S. typhimurium, называемый игольчатым комплексом, напоминает по своей структуре базальное тело жгутика (имеет характерные кольца в различных слоях бактериальной клеточной стенки), но в его состав еще дополнительно входит секретин внешней мембраны. В дополнение к интегральным мембранным белкам в состав аппарата секреции III типа входит и несколько цитоплазматических компонентов, которые могут участвовать в доставке субстратов к сайту секреции. Некоторые компоненты секреторного аппарата, очевидно, являются мобильными, поскольку могут быть обнаружены как в цитоплазме бактериальной клетки, так и за ее пределами. При повышении температуры до 37°C в отсутствии кальция иерсинии секретируют полтора десятка белков во внешнюю среду. Система секреции III типа не зависит от sec-белков. Соответственно, секретируемые белки не имеют сигнального пептида, характерного для системы секреции II типа. Тем не менее, сигнал для секреции закодирован в N-концевой части субстратов, с которыми происходит взаимодействие специфических секреторных шаперонов (а в некоторых случаях, возможно, сигналом является непосредственно мРНК). Распознавание субстрата является чрезвычайно специфичным и точным, поскольку в момент секреции бактерия способна специфически доставить конкретный субстрат в одно из трех возможных “мест назначения” – бактериальную оболочку, внешнюю среду или в цитозоль клетки эукариотического хозяина. О структуре аппарата секреции у фитопатогенов известно очень мало, однако для нескольких бактерий показано наличие особенной поверхностной структуры, связанной с аппаратом секреции III типа. Эта структура, длинный тонкий филамент - hrp-пилюс, состоит, скорее всего, из одного белка HrpA и необходима для секреции. Секретируемые белки могут проходить через внутренний канал hrp- пилюса, хотя он и имеет небольшой диаметр 8-10 нм. Необходимыми компонентами аппарата секреции у фитопатогенов являются секретин HrcC (гомолог YscC иерсиний), ассоциированный с наружной мембраной липопротеин HrcJ, пять белков внутренней мембраны HrcR, HrcS, HrcT, HrcU, HrcV (HrpO), и два цитоплазматических белка HrcQ и HrcN, последний из которых является АТФазой. 1.2. Субстраты аппарата секреции III типа. Наиболее хорошо изучены белки, секретируемые посредством аппарата III типа, опять же, у патогенов человека, прежде всего, у иерсиний. Наиболее интересные из этих белков и их функции перечислены ниже. YopN - сенсор контакта, "затыкающий" секреторный канал. Похожей функцией обладает LcrG, но этот белок располагается в цитоплазме. Гомологом YopN у фитопатогенов является HrpJ, однако степень гомологии невысока, а роль этого белка при секреции у фитопатогенов не показана. YopE – цитотоксин. Транслоцируется непосредственно в цитозоль макрофагов, где вызывает коллапс цитоскелета путем разрушения актиновых филаментов. YopH - тирозин фосфатаза (попадая в цитозоль макрофага, дефосфорилирует компоненты сигнальной цепочки, необходимые в фосфорилированной форме для фагоцитоза) YopB и YopD - мембранные транслоказы. Предполагается, что, будучи секретированными за пределы бактериальной клетки, эти белки ассоциируют с мембраной макрофага, образуя канал, через который и происходит транслокация остальных белков внутрь эукариотической клетки. К числу белков, секретируемых посредством аппарата III типа фитопатогенов, относятся прежде всего непосредственные индукторы HR - Avrбелки и харпины. По крайней мере несколько генов, кодирующих эти белки, входит в состав hrp кластеров. При всем отличии этих белков от секретируемых субстратов аппарата III типа у животных можно заметить удивительное сходство функций. Так, по крайней мере часть Avr-белков вызывает нарушение сигнальных каскадов в клетке хозяина, - 78 - контролирующих его защитный ответ (как и фосфатазы, доставляемые в цитозоль макрофагов иерсиниями) либо нарушение регуляции защитного ответа на уровне транскрипции, а харпины, скорее всего, ассоциируют с растительной клеточной стенкой и либо сами формируют транслокационный канал, либо способствуют его формированию (что напоминает работу белков YopB и YopD иерсиний). Харпины – внеклеточные элиситоры реакции гиперчувствительности (быстрой гибели клеток растения в непосредственной близости от сайта внедрения "несовместимого" патогена). Это относительно небольшие (40-45 kDa) термостабильные белки с высоким (порядка 20%) содержанием глицина, низким тирозина и совсем лишенные цистеина. Харпины из различных фитопатогенов по гомологии аминокислотных последовательностей можно разделить на три группы – HrpN, HrpZ и HrpW. При всем сходстве общего аминокислотного состава первичные аминокислотные последовательности представителей разных групп не имеют заметного сходства, а внутри каждой группы это сходство невелико. Поскольку по гомологии аминокислотных последовательностей отнести белок к классу харпинов бывает сложно, единственным критерием является способность вызывать реакцию гиперчувствительности при инокуляции препарата относительно очищенного белка в ткани (как правило, листа) подходящего растения. Однако, несмотря на то, что харпины могут вызвать реакцию гиперчувствительности у растений, их роль в процессе патогенеза неоднозначна, поскольку у большинства проверенных штаммов инактивация харпинов не вызывает заметных фенотипических эффектов. О молекулярной роли харпинов пока известно мало, однако харпин HrpW имеет домен, сходный с пектатлиазами (но не обладающий, тем не менее, пектолитической активностью), что наводит на мысль о возможном взаимодействии этого белка с клеточной стенкой растений. И действительно, такое взаимодействие недавно было продемонстрировано, правда, для другого харпина - HrpZ. Было показано, что HrpZ, скорее всего, образует пору в мембране растительной клетки, что приводит к быстрой потере электролитов и гибели. В отличие от харпинов, секретируемых аппаратом III типа в среду и уже после секреции взаимодействующих с поверхностными структурами растительных клеток, Avr-белки в норме во внешнюю среду не попадают, а доставляются непосредственно в растительные клетки. Хотя до сих пор транспорт Avr-белков в растительные клетки не продемонстрирован непосредственно, тому имеются многочисленные косвенные подтверждения. Прежде всего, часть Avr-белков имеет в своем составе аминокислотные последовательности, имеющие смысл только в эукариотической клетке, такие как сигнал ядерной локализации. Взаимодействие Avr-белков с их партнерскими R-генами растений было продемонстрировано в дрожжевой двухгибридной системе для нескольких Avr-R пар. 1.3. Организация и регуляция генов, кодирующих белки аппарата секреции III типа Несмотря на значительные таксономические различия между бактериями, обладающими системами секреции III типа, различия в образе жизни этих патогенов и принадлежность их хозяев к разным царствам (растений и животных), между всеми системами секреции III типа имеется много общего. Наиболее интересным является то, что все известные системы III типа, как у фитопатогенов, так и у патогенов животных, организованы в крупные кластеры генов, состоящие из нескольких оперонов, полностью кодирующих все компоненты соответствующих секреторных аппаратов. Как правило, в состав этих кластеров входят также и гены, кодирующие секретируемые субстраты. Следует заметить, что во многих случаях эти кластеры ограничены по краям мобильными генетическими элементами и имеют нуклеотидный состав (%GC), существенно отличающийся от остальной части генома бактерии. Такая организация кластеров секреторных генов может свидетельствовать о сравнительно недавнем приобретении их соответствующей бактерией и о том, что такие "острова патогенности" могут относительно свободно перемещаться горизонтально между таксономически весьма удаленными бактериями. У всех изученных фитопатогенных бактерий большинство hrp генов располагается в одном большом кластере размером 20-25 т.н.п. и организовано в 7-8 транскрипционных единиц. Четыре наиболее полно охарактеризованных на сегодняшний день кластера могут быть разделены на две группы на основании сходства между составляющими их генами, структурой оперонов и регуляторными системами. К первой группе можно отнести hrp кластеры P. syringae и E. amylovora, а ко второй - R. solanacearum и X. campestris. - 79 - Интересным является то, что и регулируются гены этих двух групп кластеров по-разному. Основным регулятором у P. syringae и E. amylovora является альтернативный сигма-фактор, а у R. solanacearum и X. campestris семейства (как, кстати, и у иерсиний)– активатор AraC (Рис. 13.5) Наиболее хорошо система регуляции изучена у P. syringae pv. syringae. Для этой бактерии было показано, что HrpR, HrpS, и HrpL являются частью многокомпонентной регуляторной системы, контролирующей экспрессию hrp и avr генов. HrpR и HrpS принадлежат к классу NtrC-подобных σ 54 -зависимых энхансеров транскрипции. HrpR и HrpS отличаются от большинства членов семейства NtrC тем, что они утратили аминоконцевой регуляторный домен, который изменяет регуляторную активность (в связи с чем можно предположить, что в сигнальной цепи, ведущей к активации hrp-генов, обязательно должны присутствовать другие белки), однако они по-прежнему содержат консервативный карбоксиконцевой ДНК-связывающий домен. Действие NtrC-подобных энхансеров транскрипции осуществляется через взаимодействие с альтернативным σ-фактором RpoN (σ 54 ), и было показано, что rpoN ген необходим для экспрессии hrp генов у нескольких патоваров P. syringae. RpoN осуществляет свое действие через контроль экспрессии другого сигма- фактора, HrpL, принадлежащего к ECF семейству (extra cytoplasmic functions) сигма-факторов. А уже HrpL активирует транскрипцию с зависящих от него промоторов, каковыми являются практически все изученные на сегодняшний день промоторы оперонов, кодирующих hrp и avr гены. Показано связывание HrpL с консервативной промоторной последовательностью GGAACCNA-N 14 -CCACNNA, называемой hrp-боксом. Аналогичная схема регуляции имеет место и у E. amylovora. Секреторные шапероны. Для секреции многих субстратов через аппарат 3-го типа необходимо действие специфических цитоплазматических шаперонов. Первыми обнаруженными и наиболее изученными являются Syc шапероны Yersinia, необходимые для секреции Yop белков. Характерной чертой этих шаперонов является специфичность – все Syc белки взаимодействуют только с одним секретируемым белком (только в одном случае с двумя). Утрата одного шаперона блокирует секрецию соответствующего белка, тогда как секреция остальных субстратов данного секреторного аппарата не нарушается. Белок, лишенный шаперона, накапливается в цитоплазме и зачастую быстро деградирует. В то время как взаимодействие между собой и вообще судьба факторов вирулентности после секреции изучена слабо, много информации имеется о взаимодействии между собой жгутиковых белков (использующих фактически такую же систему секреции) после их экспорта из клетки. Эти белки, как правило, полимеризуются с образованием характерных жгутиковых структур. Базальное тело жгутика, |