лекции токса. Лекции по токсикологической химии
 Скачать 5.01 Mb.
|
АНАЛИТИЧЕСКИЙ СКРИНИНГ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ, ИМЕЮЩИХ ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.
Необходимость разработки скрининговых методов анализа вызвана многообразием лекарственных соединений, которые при определенных обстоятельствах могут стать источником отравлений. Круг этих веществ постоянно расширяется по мере синтеза новых соединений. Рост числа отравлений лекарственными препаратами связан с самолечением (бесконтрольный прием лекарственных веществ), в результате чего имеют место случаи передозировки лекарств, проявление их побочного действия и развитие идиосинкразии. Большую долю в общем числе отравлений лекарственными средствами составляют детские отравления. Определенный вклад вносят отравления, связанные с наркоманией и токсикоманией. Клиническая диагностика острых отравлений лекарственными средствами затруднена из-за нехарактерных симптомов. Особенно трудно идентифицируются комбинированные и детские отравления, где природа яда чаще неизвестна. В связи с этим возникает необходимость в разработке «скрининговых» методов анализа, которые позволяли бы за короткое время выбрать из большого числа потенциальных ядов одно или несколько веществ, послуживших причиной отравления. Слово «скрининг» в переводе с английского означает - отсеивание (просеивание). Таким образом, СКРИНИНГ - это научно обоснованная система поиска неизвестного яда, когда в процессе последовательных операций поэтапно «отсеиваются» (или определяются) отдельные группы веществ или индивидуальные соединения. Аналитический скрининг (АС) наиболее удобен и эффективен в случае аналитической диагностики комбинированных отравлений, а также при ненаправленном анализе, когда неизвестна природа искомого вещества. Применение аналитического скрининга позволяет систематизировать исследование и направить его в нужное русло, сократив тем самым время анализа и материальные затраты на его выполнение. К аналитическим скрининговым методам предъявляются определенные требования: -универсальность (возможность подвергнуть исследованию большое количество веществ); - достаточная специфичность (чаще групповая); - высокая чувствительность (мкг и десятые доли мкг); - экспрессность (возможность выполнения серийных анализов); - точность (+_10 %) и воспроизводимость; - простота и доступность; - лабильность (возможность оптимизации и модернизации за счет введения новых соединений, материалов, реагентов и оборудования в существующую систему скрининга);
Перечисленными требованиями удовлетворяют, в основном, современные физико-химические методы анализа, такие как: 1. Хроматографические 2. Спектроскопические 3. Иммунохимические Эти методы могут быть использованы в системе как общего, так и частного скрининга. Общий скрининг - предусматривает химическое исследование веществ, отличающихся по своему строению и принадлежащих к различным фармакологическим группам. В основном здесь применяется групповая идентификация (например, выделяется группа барбитуратов, производных фенотиазина и др.). Частный скрининг - направлен на исследование веществ внутри группы и идентификацию отдельных ее представителей. Примером может служить хроматографическое исследование на производные барбитуровой кислоты, позволяющее идентифицировать конкретного представителя в группе барбитуратов. Хроматографические скрининговые методы В настоящее время в качестве методов хроматографического скрининга наибольшее применение нашли: 1.ТСХ - тонкослойная хроматография (хроматография в тонких слоях сорбента). 2. ВЭТСХ - высокоэффективная тонкослойная хроматография. 3. ГЖХ - газожидкостная хроматография. 4. ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография. Хроматографию можно рассматривать как метод разделения веществ, в основе которого лежит разница в коэффициентах распределения этих веществ между подвижной и неподвижной фазами. Тонкослойная хроматография (ТСХ) В тонкослойной хроматографии роль неподвижной фазы выполняет фиксированный тонкий слой сорбента (0,1-0,5мм), содержащий определенное количество воды, нанесенный на хроматографическую пластинку из стекла, фольги, полимера. В качестве сорбентов чаще используют силикагель и окись алюминия. Для лучшего удерживания на пластинке в сорбент добавляют связующий компонент – гипс, крахмал и др. Роль подвижной фазы выполняет индивидуальный растворитель или их смесь, так называемая « хроматографическая система». В процессе хроматографирования, по мере того как растворитель поднимается вверх по пластинке за счет капиллярных сил, происходит разделение смеси веществ согласно их коэффициентам распределения между подвижной и неподвижной фазами. Детектирование (обнаружение) веществ на хроматограмме проводят, в основном, следующим образом:
- с помошью хромогенных реакций: бесцветные вещества переводят в окрашенные соединения, обрабатывая хроматографическую пластинку соответствующими реагентами. Идентификацию веществ на хроматограммах проводят по коэффициенту Rf - («эр эф», скорость фракционирования). Rf - это величина, численно равная отношению длины пробега анализируемого вещества к длине пробега растворителя. Rf - является константой вещества в заданных хроматографических условиях при строгом их соблюдении. Однако, в практике соблюдение всех условий хроматографирования затруднено. Величина Rf - может колебаться в зависимости от целого ряда факторов: - техники работы, - качества и активности сорбента, - толщины слоя, - чистоты растворителей, - степени насыщения камеры парами растворителей, - температуры, - присутствия балластных веществ и т.д. Таким образом, чаще пользуются не абсолютным, а относительным значением Rf, которое обозначается Rst. Относительный коэффициент Rst численно равен отношению абсолютной величины Rf вешества к величине Rf метчика. Rst = Rf вещества/ Rf метчика В качестве метчика используется вещество, принятое за стандарт. Относительное значение Rf более воспроизводимо, т.к. с изменением хроматографических условий синхронно меняются значения Rf как исследуемого вещества, так и вещества-стандарта, а их отношение остается более или менее постоянным. При совпадении величин Rf исследуемого вещества и вещества, используемого в качестве свидетеля, можно предположить их идентичность. В условиях скрининга Rf исследуемого вещества сравнивают с табличными данными, полученными в аналогичных условиях. Метод ТСХ получил наиболее широкое распространение из перечисленных выше хроматографических методов благодаря своей доступности и простоте выполнения, и в то же время высокой эффективности, чувствительности, экспрессности, достаточной избирательности (специфичности). Тонкослойная хроматография применяется в системе общего и частного скрининга и разработана для многих лекарственных средств, имеющих токсикологическое значение. Хроматографический скрининг на основе ТСХ для большого ряда лекарственных веществ, имеющих токсикологическое значение, был разработан на кафедре токсикологической химии I ММА Гладких Г.М. В качестве неподвижной фазы используется силикагель, подвижной фазы - 7 различных систем растворителей. В общем скрининге чаще используют следующие системы растворителей:
Для обнаружения (детектирования) веществ на хроматогаммах разработана схема последовательного их проявления: Для веществ первой подгруппы: УФ ДФК + HgSO4 FeCl3 р-в Драгендорфа (барбитураты) (производные (N-содержащие вещества пиразолона, слабоосновного характера) салицил.к-та, фенотиазины) Для веществ второй подгруппы: УФ FeCl3 HClO4 + NaNO2 р-в Драгендорфа (пиразолоны, (фенотиазины, (N-содержащие вещества фенотиазины) бензодиазепины, основного характера) тиоксантены) При обнаружении веществ в общих системах переходят к исследованию в частных. Примеры частных систем: Для барбитуратов - хлороформ - н-бутанол - 25% раствор аммиака (70:40:5), детектор – ДФК (дифенилкарбазон) и HgSO4. Для алкалоидов опия - этилацетат-метанол-25% раствор аммиака (17:2:1), детектор - реактив Марки. Разработанная методика проста, универсальна и может быть использована как в клинических лабораториях при экспресс-анализе интоксикаций, так и в БСМЭ при судебно-химических исследованиях. Высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ) ВЭТСХ возникла в начале 70-х годов как новое направление в ТСХ. По сравнению с ТСХ имеет ряд преимуществ: -более высокая эффективность (за один прием можно разделить до 40 веществ) -высокая чувствительность и экспрессность. Высокая эффективность данного метода достигается за счет применения высокодисперсного сорбента, а более высокая чувствительность и экспрессность - более тонкого слоя сорбента (10-15 нм). В ВЭТСХ так же, как и в ТСХ, в качестве сорбентов применяют силикагель, окись алюминия, целлюлозу, метилцеллюлозу, полиамид, инактивированный силикагель и др.) Ввиду более высокой чувствительности метода и малого количества наносимого образца стремятся, чтобы первичная зона адсорбции (размер пятна) на старте не превышала в диаметре 2мм. Методы хроматографирования в ВЭТСХ существенно не отличаются от ТСХ. Методы обнаружения так же идентичны, только должны быть более чувствительными. Количественное определение веществ на хроматограмме проводят методом сканирующей денситометрии, дающей точные результаты и не требующей элюирования вещества с пластинки. ВЭТСХ, так же как и ТСХ, может сочетаться с другими физико-химическими методами анализа – спектральными, ГЖХ, ВЭЖХ, что повышает надежность определения. Газожидкостная хроматография (ГЖХ) Теоретические основы метода и его возможности были рассмотрены ранее в лекции «Группа «летучих» ядов». ГЖХ нашла применение в анализе лекарственных веществ в качестве скринингового метода благодаря своей универсальности. Необходимым условием является переведение исследуемого вещества в летучее состояние. Метод используется в анализе барбитуратов, алкалоидов и других лекарственных веществ в качестве общего и частного скрининга Идентификация веществ проводится по относительным временам удерживания (или по индексам удерживания Ковача). Количественное определение - по высоте или площади пика с использованием метода внутреннего стандарта. Достоверность определения повышается за счет хроматографирования на колонках, обладающих различной полярностью. Комитет по судебной токсикологии предлагает использовать колонки с неподвижными жидкими фазами - SE - 30 и OV 17 и 225. Детектор - пламенно-ионизационный. Подтверждающие исследования лучше проводить методами, отличающимися от скринингового, с равной или большей чувствительностью: тонкослойной хроматографии, масс-спектрометрии. |