лекции токса. Лекции по токсикологической химии
 Скачать 5.01 Mb.
|
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)ВЭЖХ, или жидкостная хроматография высокого давления, является вариантом колоночной жидкостной хроматографии, где элюент подается на колонку под большим давлением, что ускоряет проведение анализа. Разделение веществ проводится на колонках, заполненных мелкодисперсным сорбентом (силикагель, окись алюминия) или полимерным сорбентом. При работе с колонками, заполненными силикагелем, в качестве элюента используются углеводороды, иногда с добавлением небольшого количества спирта или других растворителей (нормальнофазный вариант). В обращеннофазном варианте к силикагелю прививают гидрофобную фазу - обычно это углеводороды с большим числом углеродных атомов, например, С18 (торговые названия сорбента - Сепарон С18, Силасорб С18). В этом случае в качестве элюента используют смеси метанола или ацетонитрила с водой или буферными растворами. В качестве детекторов обычно применяют спектрофотометрический детектор с переменной (от 190 до 900 нм) или с фиксированной (чаще 254 нм) длиной волны. Могут быть использованы и другие детекторы - рефрактометрический, флуорометрический, ионизационно-пламенный, масс-спектрометрический, электрохимический и т.д. Выходящие из колонки вещества регистрируются на хроматограмме в виде ряда хроматографических пиков. Идентификацию веществ проводят по параметрам удерживания и спектрам (при детекторе с переменной длиной волны). Количественное определение - по площади пика, которая пропорциональна количеству вещества в пробе. При этом предварительно строится калибровочный график с использованием методов абсолютной калибровки или внутреннего стандарта. Метод ВЭЖХ может быть использован в качестве общего и частного скрининга. Он позволяет сочетать изолирование и очистку вещества с его идентификацией и количественным определением. Значительным преимуществом этого метода перед ГЖХ является возможность анализа термолабильных нелетучих соединений как с малой, так и с большой молекулярной массой. Особенно удобен метод ВЭЖХ для работы в клинических лабораториях токсикологических центров при исследовании биологических жидкостей. Спектральные скрининговые методы Для скрининга лекарственных веществ могут быть применены:
Из перечисленных методов более доступным и в то же время достаточно информативным и чувствительным является метод абсорбционной спектроскопии в видимой и УФ областях. Абсорбционная спектроскопияС точки зрения квантово-механических представлений поглощение (абсорбция) веществом света, т.е. потока фотонов или электромагнитного излучения, в видимой и ультрафиолетовой областях связано с переходом электронов внешних орбиталей (валентных электронов) из основного состояния (с меньшей энергией) в возбужденное состояние (с большей энергией). При этом энергия поглощенного фотона: Е= Е1-Е0, где Е - энергия поглощенного фотона Е1 - энергия электрона в возбужденном состоянии Е0 - энергия электрона в основном состоянии Е= h* или Е= h*c/, где h -постоянная Планка - частота излучения с - скорость света - длина волны Поскольку h и c величины постоянные, очевидно, что энергия поглощенного излучения будет обратно пропорциональна . Согласно хромофорно-ауксохромной теории избирательным поглощением в видимой и УФ областях спектра обладают вещества, имеющие в своей структуре определенные группы атомов - хромофоры. Хромофоры содержат одну или несколько кратных (двойных) связей, или неподеленные пары электронов. Например: С=С этиленовая группа С=О карбонильная группа N=О нитрозогруппа N=N диазогруппа С=N азометиновая группа С6 Н6 бензольное ядро Иногда в молекуле наряду с хромофорами находятся ауксохромные группы, которые не обладают собственным поглощением, но усиливают поглощение хромофоров. К таким группам относятся:
Идентификацию веществ в условиях скрининга проводят по спектрам поглощения. Кривая зависимости светопоглощения от длины волны () называется спектром поглощения и является качественной характеристикой вещества. Характер спектра может меняться в зависимости от: - природы растворителя (тонкая структура в неполярных растворителях); - рН раствора для веществ, способных к ионизации, если молекулярная и ионизированная формы обладают различным светопоглощением. Получение спектров поглощения в различных условиях повышает информативность метода. Наряду с идентификацией веществ по характеру спектра можно провести их количественное определение, измеряя интенсивность поглощения в области максимума. Расчет концентрации вещества проводят по уравнению Бугера-Ламберта-Бера: Д=Е1%* l * C, где 1 см Д - оптическая плотность, Е - удельный показатель поглощения l - толщина светопоглощающего слоя С - концентрация вещества (в %) Измерение абсорбции (Д) проводят на спектрофотометрах различных марок, дающих монохроматическое излучение, т.к. закон Бера справедлив только для монохроматического излучения. В условиях скрининга сравнивают спектры поглощения исследуемого вещества со спектрами эталонов (стандартов). В настоящее время предложен групповой скрининг для 450 лекарственных веществ. К достоинствам спектральных методов анализа следует отнести: - универсальность, что позволяет анализировать различные классы химических соединений - высокую чувствительность (мкг) - достаточную информативность К недостаткам - необходимость высокой степени чистоты исследуемых веществ, поэтому рекомендуется сочетать спектральные методы анализа с предварительной очисткой веществ, например, с помощью ТСХ или других методов. Иммунохимические методы в скрининге лекарственных веществ. Иммунохимический анализ (ИХА) Современные иммунохимические методы анализа лекарственных средств и наркотических веществ отличаются такими особенностями, как высокая чуствительность, специфичность, экспрессность, простота исполнения. Реакция проводится прямо в биожидкости, поэтому не требуется применять изолирование и дополнительную очистку. Методы ИХА позволяют одновременно анализировать большое число проб, поэтому они очень удобны для скрининг-диагностики. В то же время, широкое применение этих методов сдерживается тем, что для них требуются особые реагенты (особо чистые сыворотки, ферменты), которых отечественная промышленность не производит. В основе всех методов ИХА лежит специфическая реакция «антиген – антитело», где антигеном является определяемое вещество, чужеродное для организма. При введении в живой организм чужеродного соединения (антигена АГ) образуются антитела АТ, которые сразу связываются с антигеном. Образующийся комплекс (АГ+АТ) выпадает в осадок. Реакция взаимодействия (АГ+ АТ) является специфичной и протекает количественно, что и используется в анализе. Для детектирования результатов реакции один из компонентов (антиген или антитело) метят специальной меткой. В зависимости от природы метки испособа ее детектирования выделяются различные виды ИХА:
Существует и ряд других методов. Наибольшее распространение в химико-токсикологическом анализе лекарственных и наркотических веществ получили РИА и ИФА:
В ИФА в качестве метки для антигенов ( т.е.определяемых веществ) используются ферменты. Как правило, это различные оксидазы, способные окислять специальное химическое вещество – хромогенный субстрат- с образованием окрашенных продуктов. По интенсивности окраски и судят о количестве искомого вещества. В РИА используется аналогичный принцип, только в качестве метки используется радиоактивный изотоп. Измеряя радиоактивность выделившегося изотопа, определяют количественное содержание искомого вещества. |