Микробиология Борисов Л.В. Микробиология Борисов Л. Литература для студентов медицинских вузов
 Скачать 27.52 Mb.
|
Патогенез. Ротавирусы являются возбудителями гастроэнтеритов новорожденных и детей более старшего возраста. У взрослых наблюдаются легкие формы заболевания. Первичная репродукция вируса происходит в цитоплазме энтероцитов тонкой кишки. При этом микВсе ретровирусы имеют ряд общих свойств. Их вирионы размерами 90—120 нм имеют сложную структуру. Капсид, построенный по кубическому типу симметрии, снаружи окружен липопротеиновой внешней оболочкой с шиповидными отростками. В составе ретрови русов содержится до 2% РНК, около 65% белков (5-8 различных полипептидов, около 30% липидов и 2% углеводов. Ретровирусы имеют диплоидный геном, представленный двумя идентичными копиями однонитевой РНК, соединенными на одном из концов водородными связями. С вирусным геномом ассоциирована вирусспецифическая обратная транскриптаза, необходимая для образования ДНК-провируса, интегрирующего в клеточный геном. Выход зрелых вирионов из клетки происходит путем почкования от наружной клеточной мембраны. Представители отдельных подсемейств имеют общие нуклеотидные последовательности и перекрестные антигенные связи. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) В 1981 г. в США у мужчин гомосексуалистов впервые была выявлена новая болезнь, названная синдромом приобретенного иммунодефицита человека (СПИД). В 1982 г. американский исследователь Р. Галло высказал предположение, что причиной развития СПИДа является вирус из семейства ретровирусов. К этому времени Р. Галло и его сотрудники уже выделили два Т-лимфотропных ретровируса человека при использовании разработанной ими техники культивирования Т-лимфоцитов in vitro. Один из них является возбудителем редкого, но злокачественного Т-лейкоза человека. Второй вирус, обозначенный HTLV-II, также вызывает Т-кле- точные лейкозы и лимфомы. В 1983 г. из кусочка ткани увеличенного лимфатического узла больного лимфоаденопатией JI. Монтанье, Ф. Барре-Синусси с группой сотрудников Пастеровского института в Париже выделили еще один ретровирус человека с избирательной тропностью к Т4-лимфо- цитам. Дальнейшие исследования показали, что новый ретровирус вызывал деструкцию инфицированных клеток с последующей их гибелью в отличие от вирусов HTLV-I HTLV-II, которые трансформируют Т-клетки, приводя к их бесконтрольной пролиферации. В 1986 г. Международный комитет по таксономии вирусов присвоил новому вирусу название Human immunodeficiency virus (HIV) - вирус иммунодефицита человека. С этого времени длительно протекающее инфекционное заболевание человека, вызванное ВИЧ, стали Рис. 21.4. ВИЧ. а — структура (схема 1 — gpl20; 2— З — липидная двухслойная мембрана 4 — Р 2 4 /2 5 ; 6 — сердцевина — обратная транскриптаза; 8 — р, р 9 — РНК б — ЭМ. Ув. 300 ООО. Видна сердцевина и оболочка называть ВИЧ-инфекцией, а термин СПИД сохранили для обозначения последней, терминальной стадии этого заболевания. Более 90% случаев инфицирования в мире связанны с вирусом иммунодефицита человека первого типа, который является этиологической причиной глобальной пандемии. Вирус иммунодефицита второго типа (ВИЧ) эндемичен для Западной Африки и весьма редко встречается в остальных странах мира. ВИЧ имеет генетическую гомологию с ВИЧ на уровне 50% и вызывает аналогичное заболевание, которое имеет более доброкачественное и продолжительное течение. Структура и химический состав. По структуре ВИЧ и ВИЧ близки к другим лентивирусам. Вирион ВИЧ имеет сферическую форму 100-200 нм в диаметре. Внешняя оболочка вирионов образована двойным липидным слоем, который заимствован вирионом из мембраны клетки хозяина при завершении цикла репликации и выходе из клетки (рис. В оболочке вирионов находится гликопротеиновый комплекс вируса, состоящий из двух субъединиц (gp41, gpl 20) с нековалентной связью между ними. Трансмембранный белок gp41 пронизывает оболочку вируса, второй белок — g p l20 формирует отростки (шипы) на поверхности вирионов. С внутренней стороны липидной оболочки расположен матрикс- ный каркас, образованный белком р. Сердцевина вириона цилиндрической или конусовидной формы, образованна капсидным (HIV-2) vpoc и щ — tet — g™ тдп т і " rev Д €ПУ j | ПЄ* \ vPr и v p u (H IV -1 Рис. 21.5. ВИЧ. Структура генома (схема) белком р. В сердцевине вируса заключены нуклеокапсидный протеин р7/р9, геном вируса — две однонитевые молекулы РНК и три вирусных энзима — обратная транскриптаза, протеаза и интеграза. Геном ВИЧ содержит 104 нуклеотидов и представлен 9 генами рис. Три структурных гена gag, pol u env кодируют компоненты вирусных частиц ген gag — внутренние группоспецифические белки ви риона, входящие в состав сердцевины и капсида (р, р, р 17), ген env — типоспецифические белки, входящие в состав внешней оболочки (gp41 и gpl20), ген ро ї белки вирусных энзимов. В геноме ВИЧ имеется также шесть регуляторных генов, кодирующих небольшие протеины, участвующие в системе регуляции деятельности структурных генов. ВИЧ и ВИЧ имеют гены tat, rev, nef, vif, vpr. Кроме того, ВИЧ имеет также гена ВИЧ — ген В пределах общей длины генома гены частично перекрываются с соседними, два гена tat u rev состоят каждый из двух отрезков, довольно далеко отстоящих друг от друга протеин — трансактиватор транскрипции, необходим для биосинтеза полноразмерного транскрипта вирусной РНК, он увеличивает скорость транскрипции как структурных, таки регуляторных вирусных белков в десятки раз. Rev протеин обеспечивает транспорт из ядра несплайсированной или однократно сплайсированной вирусной РНК в цитоплазму, где с нее транслируются Gag/Pol или Env протеины. В отсутствии продукта гена rev структурные белки вообще не образуются. Важность Nef протеина была очевидна с самого начала его открытия, однако функциональное предназначение продолжает обсуждаться. По одним из последних данных, функция протеинов N ef и Vpu направлена на снижение экспрессии клеточных CD4 рецепторов в инфицированной клетке, Rev и N ef белки не входят в состав вириона , но являются первыми виоусными компонентами, которые синтезируются в процессе цикла репликации вируса. Отличительной чертой ретровирусов вообще, и ВИЧ в частности, является высокая изменчивость по сравнению с диапазоном изменчивости других вирусов. Именно применительно к ретровирусам было введено понятие квази видов, так как даже в пределах одного организма последующие генерации вируса отличаются от родительских. Вероятность мутации для ВИЧ оценивается как 10-4— 10“5 на цикл репликации. В жизненном цикле ВИЧ точечные мутации могут происходить на стадии обратной транскрипции с геномной РНК на «минус»-цепь ДНК, на этапе синтеза «плюс»-цепи ДНК при возникновении провируса и, наконец, при транскрипции РНК с ДНК провируса. Делеции и вставки тоже возможны, однако вероятную частоту их возникновения оценить сложно. Наиболее высокая изменчивость состава нуклеотидов характерна для гена env. Степень изменчивости неодинакова в разных участках молекулы кодируемого оболочечного белка. В молекулах белков оболочки g p l2 0 и gp41 карти ровано более 20 функционально значимых последовательностей (сайтов или эпитопов). С вариабельными участками gp 120 V 1-V 3 связывают фенотипи ческие свойства вируса, а также тропность к хемокиновым рецепторам, с гипервариабельным участком V3 — иммунный ответ и возможность вируса ускользать от прессинга иммунной системы. Для узнавания рецептора CD4 и связывания с ним важны три разные области gpl2 0 . Когда молекула gpl 20 находится в пространственной конфигурации, эти области сближены, образуя полость, соответствующую рецептору Систематизация генетического разнообразия ВИЧ на основании анализа нуклеотидных последовательностей генов env и gag была осуществлена по положению различных штаммов на бескорневом филогенетическом дереве. Циркулирующие в разных регионах мира штаммы ВИЧ сгруппированы в две разные группы. К первой большой группе М (major) принадлежит большинство известных эпидемических штаммов. Внутри М группы классифицировано, по крайне мере 10 генетических субтипов, каждый из которых обозначен буквами английского алфавита от А до J. Различие в нуклеотидной последовательности V3 области генов env изолятов, принадлежащих к одному субтипу, составляет 5-15%, в то время как между разными субтипами — 16-30%. Отличия в геномах вирусов от одного пациента в динамике заболевания, как правило, не превышают 5%, а от разных людей 0,5 -0,4% Большой вклад в изучение эволюции ВИЧ вносят открытые в последние годы рекомбинантные формы вируса, которые явились причиной крупнейшей эпидемии среди гетеросексуальной популяции в Таиланде (Е/А рекомбинант) и локальных эпидемий среди наркоманов в двух провинциях Китая (В/С рекомбинант) ив Калининградской области в России (А/В рекомбинант). Помимо группы М в 1994 г. от пациентов Африканского происхождения была идентифицирована другая небольшая группа высокодивергентных штаммов ВИЧ — группа О (англ. Outliner — в стороне. Различия в последовательности нуклеотидов вирусов группы О в целом по сравнению с группой М составляют около 35%, а по гену env — 56%. Достижения в области исследований генома ВИЧ стимулировали развитие исследований по молекулярной эпидемиологии ВИЧ- инфекции. Антигены. Антигенными свойствами разной степени выраженности обладают белки, кодируемые всеми генами ВИЧ. Антительный ответ к продуктам структурных генов является высокоактивным, особенно к белкам генов env и gag. Высоко антигенным является также протеин. Белки остальных регуляторных генов в антигенном отношении средне- (гены vpr и vpu) или низко- (гены vpx, vif, rev, tat) активны. Антитела к антигенным эпитопам молекул структурных белков ВИЧ в сыворотках серопозитивных пациентов выявляются с неодинаковой частотой. Только к одному эпитопу, который локализован в молекуле gp41 (иммунодоминантный В клеточный эпитоп), антитела имеются практически у всех ВИЧ-инфицированных людей. Ведутся исследования по построению классификационной системы ВИЧ на основе антигенных свойств вируса. Сюда относится определение серо- типа вируса путем выявления антител в сыворотках инфицированных пациентов иммуноферментным методом с помощью многокомпонентных панелей синтетических пептидов, имитирующих эпитопы ВИЧ. Сыворотки от пациентов, инфицированных ВИЧ, с антигенами ВИЧ в серологических реакциях могут давать положительный или неопределенный результат. Выработка наиболее важных нейтрализующих антител связана с так называемой принципиальной детерминантой нейтрализации (PND), расположенной в гипервариабельном домене молекулы g p l20 (V3 петля. К этому эпито пу направлены изолят-специфичные ранние антитела. Однако вследствие высокой генетической изменчивости ВИЧ эти антитела могут не нейтрализовать in vitro варианты вируса оттого же пациента через 6 и более мес. В тоже время эти изоляты могут реагировать с антителами сывороток от других ВИЧ-инфицированных пациентов, если эти сыворотки содержат широкий спектр нейтрализующих антител. Предполагается, что функция нейтрализующих антител заключается в блокировании связывания вирусного g p l20 с хе- мокиновым клеточным рецептором. Однако, как показало изучение пространственных моделей белка g p l2 0 , эти области для антител малодоступны. Определение иммунотипа вируса является важной характеристикой, имеющей отношение к теории и практике разработки вакцины против ВИЧ. Под этим понимается изучение in vitro в культуре клеток способности нейтрализующих антител (гомо/гетеро или моноклональных) угнетать репликацию первичных клинических) вирусных изолятов. В пределах PND также идентифицированы эпитопы, распознаваемые цитотоксическими Т-лимфоцитами эффекторами, а также эпитопы, связанные с антителами, опосредующими антителозависимую клеточную цитоток сичность. Культивирование и репродукция. Стандартная методика изоляции ВИЧ включает 1) получение фракции мононуклеарных клеток из образца периферической крови (МПК) инфицированного пациента в градиенте фикола; 2) сокультивирование полученных МПК с предварительно обработанными фитогемагглютинином МПК доноров при 37° в атмосфере С 0 2; 3) добавление донорских МПК каждые 3-5 дней в зависимости от жизнеспособности культивируемых клеток) определение маркеров репликации вируса с го дня культивирования клеток через каждые 3-4 дня. Опыт, как правило, продолжают до го дня. В случае положительного результата для дальнейшего изучения фенотипа вируса ви руссодержащим супернатантом с МПК (первичная культура вируса) заражают перевиваемые Т-клеточные лимфобластоидные линии, экс прессирующие на своей поверхности рецепторы Для идентификации репликации вируса в МПК и культурах перевиваемых клеток используют определение активности обратной транс- криптазы, р антигена вируса или его РНК, а также выявление цитопатогенного эффекта. Характер проявлений цитопатогенного эффекта может быть различным — дегенерация и гибель клеток, формирование синцития, декластрирование кластерных линий клеток и др. Ученым понадобилось более 10 лет, чтобы доказать, что для связывания gpl20 с клеточной мембраной помимо CD4 рецептора необходимо участие дополнительных ко-рецепторов. Этими ко-рецепто- рами оказались рецепторы к хемокинам. На функциональном уровне штаммы ВИЧ отличаются по тропизму к указанным рецепторами дифференцируются на макрофаготроп- ные и Т-лимфоцитотропные. Имеются вирусы с двойной тропностью. Отношение вируса к хемокиновым рецепторам положено в основу последней классификации вируса иммунодефицита человека первого типа. В культурах мононуклеарных клеток периферической крови М- тропные вирусы имеют низкий уровень репликации, не образуют синцитии (фенотип «slow/low»), Т-тропные вирусы — имеют высокий уровень репликации и образуют синцитии (фенотип «rapid/high»). Исследования первичных изолятов показывают, что по мере прогрес сирования ВИЧ-инфекции происходит шифт от М- к Т-тропным изо- лятам, сопровождающийся сменой фенотипа вируса. Жизненный цикл вируса в Т лимфоцитах начинается со взаимодействия вирусного белка gpl2 0 с клеточным рецептором CD4 риса. После этого полученный комплекс через специфический эпитоп gpl20 взаимодействует с хемокиновым рецептором на клеточной мембране. В процессе образования этого комплекса происходит изменение конформации молекулы g p l2 0 (рис. 21.6 Ь Рис. 21.6. Проникновение ВИЧ в лимфоцит путем слияния мембран. Пояснение в тексте Вирус Пептид CCR5 or CXCR4 льфндная петля К леточная мембрана Вследствие этого оказывается открытой гидрофобная область gp41 пептид слияния, которая взаимодействует с близлежащей частью клеточной мембраны. Этот процесс индуцирует слияние вирусной оболочки с плазматической мембраной клетки, в результате чего сердцевина вируса попадает внутрь клетки. Другой возможный механизм проникновения адсорбированного вируса в клетку — рецепторный эндоцитоз (рис. После освобождения сердцевины вириона запускается сложный механизм обратной транскрипции вирусной РНК при участии вирусного фермента обратной транскриптазы. Сначала синтезируется од ноцепочечная ДНК, комплементарная вирусной РНК, затем — вторая цепь ДНК, используя первую в качестве матрицы. Двухцепочечная вирусная ДНК (провирус) проникает в клеточное ядро и благодаря активности вирусного фермента интегразы, которая разрезает ДНК- клетки хозяина, встраивается в хромосомную ДНК, сохраняясь в ней до конца жизни клетки. Репликация ВИЧ начинается тогда, когда длинные концевые повторы на концах провирусного генома инициируют транскрипцию вирусных генов. Образование РНК-транскрипта на матрице прови- русной ДНК происходит при участии клеточной ДНК-зависимой РНК- полимеразы. Транскрибирующиеся молекулы РНК, содержащие полный геном ВИЧ, переносятся в цитоплазму и служат геномным фондом ВИЧ при формировании зрелых вирионов, а также матрицами для синтеза на клеточных рибосомах вирусных протеинов и энзимов (Gag и Pol). Эти два протеина синтезируются в цитоплазме в виде длинных поли- пептидных цепей белков — предшественников (р) и нарезаются на индивидуальные структурные белки вирусными протеазами. С однократно сплайсированной РНК транслируется Env белок — предшественник (gp 160), который гликозилируется в эндоплазмати- Рис. 21.7. ВИЧ. ЭМ. Ультратонкий срез. Ув. 150 ООО. а — проникновение в лимфоцит б — внутриклеточный вирус в — почкующийся вирус (1) и внеклеточный вирион (2) ческом ретикулеме аппарате Гольджи. Затем молекула g p l60 расщепляется клеточной протеазой на две молекулы g p l20 и Большинство регуляторных протеинов (Tat, Rev, Nef) транслируются с многократно сплайсированных РНК. Сборка вирусной частицы происходит на внутренней стороне клеточной мембраны. Вовремя формирования вируса в него втягиваются две цепи РНК. Вирион отпочковывается от клетки, увлекая участки мембраны клетки-хозяина в том числе антигены главного комплекса гистосовместимости. При активной репликации ВИЧ идет множественное нарушение целостности мембраны, и клетка гибнет Таким образом, ВИЧ в Т4-лимфоцитах активно использует клеточный аппарат для транскрипции своих генов и синтеза белков. |