Методические указания для студентов лечебного факультета под редакцией О. В. Филинюк Томск. 2015 с
 Скачать 11.46 Mb.
|
|
ТЕМА: Эпидемиология туберкулеза. МБТ. Микробиологическая и молекулярно-генетическая диагностика туберкулеза. Туберкулинодиагностика. Диаскинтест. Методы определения индукции гамма-интерферона антигенами МБТ. Теоретические вопросы к занятию
Содержание темы Туберкулез – это инфекционная болезнь, возбудителем которой являются микобактерии туберкулеза, характеризуется гранулематозно-казеозным и некротическо-деструктивным воспалением тканей с клиническим полиморфизмом, проявляет социальную зависимость, влечет временную и стойкую потерю работоспособности и требует длительного комплексного лечения и реабилитации больных. Эпидемиология туберкулеза Эпидемиология изучает: • источники заражения туберкулеза; • пути передачи инфекции; • распространенность туберкулеза как инфекционного заболевания среди населения и групп риска. Источник инфекции: • больной человек (бактериовыделитель), больное животные. Пути выделения: с мокротой (чаще всего), со слюной, мочой, калом, потом, слезой, гноем (при туберкулезе костей, периферических лимфатических узлов). Пути заражения: • аэрогенный (90%): воздушно-пылевой (чаще всего) и воздушно-капельный; • алиментарный (мясо, молоко, сыр, яйца) - 1-2%; • контактный (через поврежденную кожу и слизистые оболочки) - 5-6%; • трансплацентарный (редко). Ежегодно один человек с бактериовыделением может инфицировать 15-20 человек. Риск инфицирования зависит от: – массивности бактериовыделения у больного; – времени контакта с больным; – близости контакта и объема помещения, в котором происходит контакт с бациллярным больным. Наиболее опасными с точки зрения инфицирования окружающих являются пациенты с бактериовыделением, выявляемым методом микроскопии мазков мокроты. Как правило, в условиях нашей страны, заражаются туберкулезом в детстве. Большинство остается здоровыми, но инфицированными. Заражение в большинстве случаев не приводит к заболеванию в связи с наличием у человека высокой степени врожденной резистентности к туберкулезу. При обратном развитии образовавшегося туберкулезного воспаления формируется петрификат. Инфицирование проявляет себя появлением впервые в жизни положительной реакции на туберкулин. При этом в организме формируется приобретенный иммунитет, поддерживаемый пожизненно живой инфекцией. В этом положительная роль инфицирования. Отрицательная роль его заключается в опасности активации инфекции в петрификатах и развитии заболевания. Заболевание, развивающееся в результате первичного инфицирования МБТ, называют первичным туберкулезом. Опасность заболевания первичным туберкулезом сохраняется до завершения обратного развития морфологических туберкулезных изменений с формированием петрификата. От момента заражения до обратного развития изменений проходит не менее 3 лет, иногда этот период затягивается до 5 лет. Считается, что заболевает первичным туберкулезом около 5 % от числа инфицированных. Первичным туберкулезом преимущественно болеют дети. Заболевание, развивающееся в результате активации инфекции в петрификатах или повторного заражения, называется вторичным туберкулезом. Такой туберкулез развивается чаще у взрослых через годы и десятки лет после первичного заражения МБТ. При этом на протяжении оставшейся жизни заболевает еще 5-10 %. В современных неблагоприятных эпидемиологических условиях нередко вторичным туберкулезом заболевают и дети старшего возраста, подростки. Преобладающее большинство заболевающих туберкулезом среди населения в нашей стране составляют больные вторичным туберкулезом. Факторами, увеличивающими вероятность развития заболевания, являются время, прошедшее с момента инфицирования, а также иммунный статус инфицированного, в том числе наличие ВИЧ-инфекции. К другим факторам риска развития заболевания относятся: – возраст; – пол; – недостаточность питания; – сопутствующие заболевания (неспецифические воспалительные процессы в бронхолегочной системе, диабет и др.) – генетическая предрасположенность; – наличие постоянного контакта с бациллярным больным туберкулезом; – отсутствие у инфицированного химиопрофилактики. Вакцинация и/или превентивная химиотерапия не защищают человека от инфицирования, но снижают риск возникновения или тяжесть протекания заболевания. Наличие ВИЧ-инфекции значительно увеличивает риск развития заболевания туберкулезом у человека, инфицированного микобактериями туберкулеза. Если среди ВИЧ-негативных, инфицированных туберкулезом, заболевание развивается в 5–10% случаев на всем протяжении жизни, то у ВИЧ-положительных, инфицированных туберкулезом, этот показатель достигает 60% (в течение жизни) или 5% в год. По некоторым статистическим данным, риск возникновения заболевания туберкулезом у ВИЧ-инфицированных увеличивается, примерно, в 170 раз. К основным эпидемиологическим показателям распространенности туберкулеза относятся инфицированность, заболеваемость, болезненность (или распространенность), смертность. Инфицированность - это процентное отношение количества лиц, которые положительно реагируют на туберкулин к количеству обследованных, за исключением лиц с поствакцинальной аллергией (в процентах). Заболеваемость - количество впервые выявленных больных с активной формой туберкулеза на 100 000 жителей данного региона/района/страны на протяжении года. Болезненность - это общее количество больных с активной формой туберкулеза на 100 000 жителей данного региона/района/страны на конец года. Смертность – количество умерших от туберкулеза на протяжении года на 100 000 население данного региона/района/страны. Летальность - это отношение количества умерших за год от туберкулеза к количеству больных туберкулезом, которые находится в том самом году на учете в диспансере. Смертность от туберкулеза и болезненность в значительной мере зависят от эффективности лечебных мероприятий, инфицированность и заболеваемость - от профилактических мероприятий. Вместе с тем инфицированность, заболеваемость, болезненность и смертность связаны с социально-бытовыми условиями жизни людей. В настоящее время, по определению Всемирной организации здравоохранения, туберкулез представляет собой глобальную угрозу. По прогнозам ВОЗ, в ближайшие 10 лет туберкулез останется одной из 10 ведущих причин заболеваемости и смертности в мире. Всемирная организация здравоохранения зарегистрировала в 201 году более 9 миллионов случаев заражения туберкулезом, 1,1 миллион из них являются также ВИЧ-положительными; ежегодно от туберкулеза (излечимой болезни) умирают 2–3 миллиона человек или 5000 человек ежедневно. Более половины заболевших - 56% - приходится на страны юго-восточной Азии и западной части Тихого океана. Наибольшее количество заражений зарегистрировано в Индии и Китае - 24% и 11% соответственно от общего числа. Новых случаев туберкулеза - 64%. Около трети населения нашей планеты инфицированы микобактериями туберкулеза. Одной из лавной задач противотуберкулезной программы страны должно стать снижение частоты инфицирования туберкулезом. Для снижения уровня инфицированности населения мероприятия противотуберкулезной программы должны быть направлены на то, чтобы: – каждый бактериовыделитель был своевременно выявлен и направлен на лечение; – каждый небациллярный больной туберкулезом также должен быть выявлен и направлен на лечение, пока он не стал заразным. ЭТИОЛОГИЯ ТУБЕРКУЛЕЗА Возбудителем туберкулеза являются микобактерии туберкулеза (МБТ), которые в 1882 г. открыл Роберт Кох. Классификация микобактерий Домен: Baсteria; Отдел: Актиномицеты; Порядок: Actinomycetales; Подпорядок: Corynebacterineae; Семейство: Mycobacteriaceae; Род: Mycobacterium. Основным признаком, по которому микобактерии были отнесены к тому или другому виду, является различная патогенность их для разных видов животных и для человека. По патогенным свойствам род Mycobacterium подразделяют на две группы: 1) патогенные и условно-патогенные (потенциально патогенные). 2) сапрофиты. В настоящее время используется разделение клинически значимых микобактерий на комплексы: комплекс M. tuberculosis – микобактерии туберкулезного комплекса – это ком плекс микобактерий, вызывающих туберкулез (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovisBCG, M. africanum, M. microti, M. canetti), комплекс M. avium (M. avium, M. intracellulare), комплекс M. fortuitum, комплекс M. terrae. Такая классификация позволяет объединить виды микобактерий одинаковой кли нической значимости. Более тонкая характеристика их до видов в большинстве кли нических случаев не требуется. Патогенными для человека является только МБТ человеческого, бычьего и африканского типов. По скорости роста род Mycobacterium подразделяют на 3 группы:
По способности к пигментообразованию микобактерии также делят на 3 группы: 1. Фотохромогенные - образуют пигмент лимонно-желтого цвета при росте на свету. 2. Скотохромогенные - образуют пигмент оранжево-желтого цвета при инкубировании в темноте. 3. Нефотохромогенные - пигмента не образуют (независимо от наличия света), иногда культуры имеют светло-желтоватую окраску. МБТ имеют продолговатый палочковидый вид длиной 1-6 мкм и шириной 0,2-0,5 мкм, неподвижные, имеют большой полиморфизм. Размножение происходит в основном путем простого клеточного деления. Споры и капсулы не образуют. Растут медленно, оптимальная температура роста 37-38°С. Удвоение МБТ наступает через 20-24 часов. При снижении температуры к 29°С, или повышении к 45°С рост МБТ прекращается. За ростовыми свойствами выделяют МБТ, которые растут быстро или медленно и МБТ, что находятся в латентном состоянии. Электронно-микроскопическое исследование МБТ позволило дифференцировать в них микрокапсулу, многослойную клеточную мембрану, цитоплазму с органеллами (гранулы, вакуоли, рибосомы) и ядерную субстанцию (нуклеотид). Отличительным свойством МБТ является химическая устойчивость, которая проявляется в способности сохранять окраску даже при интенсивном обесцвечивании кислотами, щелочами и спиртом, что обусловлено высоким содержанием в клеточных стенках МБТ миколевой кислоты (С88Н17604), липидов и белков. Микрокапсула состоит из полисахаридов и играет важную роль в жизнедеятельности МБТ, в том числе придает им устойчивость к неблагоприятным воздействиям внешней среды. Толстая клеточная стенка, насыщенная липидами, ограничивает клетку снаружи, обеспечивая механическую и осмотическую защиту. Стенка МБТ состоит из четырех слоев. Первый, внутренний, слой образован пептидогликаном; последующие слои включают в себя миколевые кислоты, гликолипиды, воск и корд-фактор, связывающий отдельные клетки в косы и оказывающий токсическое действие на макрофаги при фагоцитозе. Такой состав клеточной стенки определяет устойчивость МБТ к воздействию кислот и щелочей, а также высокую гидрофобность клетки в целом. Согласно современным представлениям, в состав цитоплазматической мембраны, расположенной под клеточной стенкой, входят липопротеидные комплексы. С мембраной связаны ферментные системы. В цитоплазматической мембране осуществляются процессы, ответственные за специфичность реакций МБТ клетки на факторы окружающей среды. Цитоплазма МБТ состоит из гранул и вакуолей различной величины. Основная часть мелкогранулярных включений представлена рибосомами, на которых синтезируется специфический белок. Ядерная субстанция М БТ определяет специфические свойства клетки, важнейшими из которых являются синтез белка и передача наследственных признаков потомству. Для нормального развития МБТ нуждаются в кислороде, поэтому их относят к аэробам. Потребление кислорода микробной клеткой связано с окислительно-восстановительным и процессами в тканях макроорганизма. При формировании гранулем размножение МБТ из-за снижения в них парциального давления кислорода (Р02) замедляется, однако имеются сведения, что некоторые виды МБТ можно рассматривать, как факультативные анаэробы. В настоящее время полностью расшифрован геном МБТ. Он имеет длину 4 411 529 пар нуклеотидов, которые почти в 70% представлены гуанином и цитозином. Нуклеотид содержит 4000 генов, из которых 60 кодируют компоненты РНК. Для МБТ имеются уникальные гены, в частности гены mtp40n mpb 70, которые применяются для выявления МБТ в полимеразно-цепной реакции (ПЦР). В естественных условиях МБТ устойчивые к факторам внешней среды и сохраняют жизнеспособность в течение нескольких месяцев. В жидкой среде МБТ погибают при кипячении через 5 минут, а в сухой мокроте при температуре 100° С – через 45 минут. Под воздействием солнечных лучей они погибают через 1-2 минуты, а в мокроте – через 4 часа. Под воздействием дезинфицирующих средств (хлорамин, пюржавель, жавелион, дезоксон-1 и 4, клорсепт и т.д.) МБТ погибают через 3-5 часов. Под воздействием неблагоприятных условий и противотуберкулезных препаратов МБТ способные к изменчивости: они трансформируются в более стойкие, не чувствительные к этим условиям формы (фильтрующиеся, L- формы) – персистенция МБТ, но при благоприятных условиях они способны к реверсии – приобретать классическую форму МБТ с патогенными свойствами. При этом у них может формироваться резистентность к противотуберкулезным препаратам (ПТП). Патогенность – основной видовой признак МБТ - возможность МБТ вызвать заболевание. Главный фактор патогенности - токсичный гликолипид - корд-фактор. Корд-фактор обусловливает токсическое действие на ткани и защищает МБТ от элиминации. Вирулентность - степень патогенности; возможность роста и размножения микобактерий в определенном макроорганизме и способность вызвать специфические патологические изменения в органах. Вирулентным считают штамм микобактерий, если он в дозе 0,1- 0,01 мг вызывает заболевание туберкулезом, а через 2 месяца - смерть морской свинки массой 250-300 г. Если после введения этой дозы животные умирает через 5-6 месяцев, то этот штамм считают слабовирулентным. У МБТ не выявлено каких-либо эндотоксинов, экзотокси нов или гистолитических ферментов. Их патогенное действие связано, главным образом, со способностью избегать губительного влияния макро фагов и вызывать реакции гиперчувствительности замедленного типа. Это обеспечивается 5 компонентами клеточной стенки МБТ. Первым таким компонентом является корд-фактор (фактор жгутообразования), «вынуждающий» МБТ расти in vitro в виде извитых жгу тов. Вирулентные штаммы возбудителя имеют этот фактор на поверхно сти бактериальной клетки, а авирулентные штаммы им не обладают. Доказано, что вве дение очищенного корд-фактора подопытным мышам вызывает у них формирование типичных туберкулезных гранулем. Вторым компонентом считаются сульфамиды, представляющие собой серосодержащие гликолипиды бактериальной поверхности и присущие тоже только вирулентным штаммам. Они предупреждают слияние фагосом макрофагов, содержа щих фагоцированные МБТ, с лизосомами. Третий компонент клеточной стенки — фактор, подав ляющий активацию макрофагов - липоарабиноманнан (LAM-фактор). Он представляет собой главный гетерополисахарид, по строению сходный с эндотоксином грамотрицательных микробов и выполняющий функцию подавления ИФН-γ. LAM обеспечивает также выработку макрофагами ФНО-а, вызывающего лихорадку, снижение массы тела и по вреждение тканей, а также выработку интерлейкина-10, тормозящего пролиферацию Т-лимфоцитов. Четвертым компонен том является высокоиммуногенный белок теплового шока с молекуляр ной массой 65 кДа. Этот белок возбудителей туберкулеза, по строению сходный с белками теплового шока человека, возможно, играет опреде ленную роль в развитии аутоиммунных реакций, вызываемых микобактериями. Пятый компонент — комплемент, активированный на поверхно сти микобактерии и способный опсонизировать возбудителей и облег чать их поглощение посредством макрофагального комплементного ре цептора CR3 (интегрина МАС-1). Микобактерии выделяются в различных странах мира от людей, теплокровных и холоднокровных животных, страдающих заболеваниями легких, кожи, мягких тканей и лимфатических узлов. Эти заболевания получили название микобактериозов, которые вызываются представителями рода нетуберкулезными микобактериями (НТМБ), по клинической картине иногда очень схожи с туберкулезом. В среднем распространенность НТМБ в ряде территорий России составила от 0,5 до 6,2%. Наиболее часто встречаемые виды – M.avium-intracellularae, вызывающий до 60% случаев микобактериозов легких, M.kansasii, M.xenopii и другие. Микобактериозы часто встречаются у больных с ВИЧ-инфекцией, являясь своеобразным маркером иммунодефицита человека. Другие виды микобактерий, такие как M.smegmatis, могут обнаруживаться на внешних тканях и органах в качестве сапрофитов. Отдельную группу составляют возбудители проказы M.leprae. Различают три типа микобактериозов, зависящих от вида МБТ и иммуннитета: I. Генерализованные инфекции с развитием видимых невооруженным глазом патологических изменений, внешне напоминающих туберкулезные, но гистологически несколько отличающиеся от них. II. Локализованные инфекции, характеризующиеся наличием макро - и микроскопических поражений, выявляемых в определенных участках тела. III. Инфекции, протекающие без развития видимых поражений; возбудитель обнаруживается в лимфатических узлах внутриклеточно или внеклеточно. Методы выявления МБТ Большое значение в правильности выполнения лабораторных поисков МБТ имеет забор патологического материала. Посуда, в которую собирают патологический материал, должна быть стерильной. Наиболее часто исследуется мокрота. Собранные образцы должны быть немедленно отосланы в соответствующую лабораторию. Если такой возможности нет, материал сохраняют в холодильнике при температуре воздуха 4-10о С. Если лаборатория расположена в отдалении от учреждения здравоохранения, доставку материала для исследований осуществляют 1 или 2 раза в неделю. Для этого должны использоваться специальные контейнеры. Контейнеры должны быть прочными, устойчивыми к разрушению, иметь широкую горловину с герметически завинчивающейся пробкой, чтобы предотвратить случайное вытекание из нее содержимого. При сборе образцов риск инфекции очень большой, особенно когда больной выкашливает мокроту, в связи с этим процедуру необходимо проводить как можно дальше от посторонних лиц и в специальном помещении/кабине. Мокроту на МБТ в амбулаторных условиях собирают трижды, после соответствующего туалета полости рта: 1. Первая проба – в поликлинике или стационаре, в присутствии медицинского работника, через 1-2 часа после сна. 2. Вторая проба – в тот же день через несколько часов (3-4 часа). 3. Третья проба – на следующий день пациент приносит мокроту сам. У нетранспортабельных пациентов забор мокроты производит участковая медсестра поликлиники на дому в стерильную посуду и доставляет в бактериологическую лабораторию. Таблица 2 Методы этиологической диагностики туберкулеза
Рис. 2. Алгоритм этиологической диагностики туберкулеза Цель этиологической диагностики туберкулеза: • выявление эпидемиологически опасных больных туберкулезом – бактериовыделителей (с МБТ+); • верификация диагноза туберкулеза; • определение лечебной тактики; • оценка эффективности лечения и прогноза; • для эпидемического контроля за туберкулезом. Бактериоскопический метод выявления МБТ наиболее простой, дешевый, специфический, доступный по сравнению со всеми другими методами диагностики туберкулеза. Бактериоскопический метод имеет свои разновидности: простая бактериоскопия и LED или люминесцентной микроскопии (рис. 3). При простой бактериоскопии мазок красят по Цилю-Нильсону: стеклянной палочкой гнойные комочки мокроты наносят равномерно на предметное стекло, и фиксируют в пламени горелки. Далее красят карболовым фуксином, который после нанесения подогревают в пламени, чтобы краситель лучше проник в МБТ, после промывания мазка обесцвечивают в 25 % растворе серной кислоты или в 3 % соляно-кислом спирте. Обесцвеченные элементы мазка докрашивают 0,3 % раствором метиленового синего. Микобактерии не воспринимают обычные анилиновые красители, в результате чего кислотоустойчивые микобактерии окрашиваются в малиново-красный цвет, а другие микробы и клеточные элементы – в голубой цвет. МБТ под микроскопом имеют вид продолговатых палочек, розового цвета на синем фоне. На окрашивание затрачивается 20-30 минут. Метод простой и дешевый, но мало информативный, чтобы обнаружить МБТ в 1 см3 мокроты должно быть около 50-100 тыс. МБТ, если же будет меньше, то МБТ не будут найдены. В основу метода люминесцентной микроскопии включена окраска МБТ флюорохромами (аурамин, родамин и др.), которые также связываются с воскоподобными структурами микробной клетки и светятся в ультрафиолетовых лучах. LED (light emitted diode – светоизлучающие диоды) технологии позволяют конвертировать обычный световой микроскоп во флюоресцентный, увеличивая и улучшая технические возможности люминесцентной микроскопии. При бактериологическом исследовании патологический материал культивируют на питательных средах, и выделяют культуру МБТ в чистом виде. Наиболее часто используют следующие питательные среды: Левенштейна-Йенсена, Финн-2. Перед посевом на питательные среды проводят обработку патологического материала для уничтожения сопутствующей флоры, разжижения, деконтаминации. В зависимости от материала, степени его гомогенности и загрязнённости для предпосевной обработки используют различные деконтаминанты. Для мокроты в основном используют 10 % раствор трёхзамещённого фосфорно-кислого натрия. После предварительной обработки материал центрифугируют, за счёт этого осаждают микобактерии, и повышают их содержание в осадке («обогащение осадка»). Полученный осадок подвергают нейтрализации, и засевают им (инокулируют) поверхность плотных питательных сред или пробирки с жидкими (полужидкими) средами. Из оставшейся части осадка готовят мазки для микроскопического исследования, так как микроскопическое и культуральное исследования нужно производить параллельно из одной и той же пробы диагностического материала (рис. 2). При использовании плотных сред инокулированные пробирки помещают в термостат при температуре 37 С на 2 суток в горизонтальном положении. Это обеспечивает более равномерное всасывание материала в питательную среду. Через 2 суток пробирки переводят в вертикальное положение, и герметично закрывают резиновыми или силиконовыми пробками во избежание подсыхания засеянных сред. Посевы выдерживают в термостате при 37оС в течение 10-12 недель при регулярном еженедельном просмотре.
Рис. 3 Вид МБТ под микроскопом и в культуре Длительность получения результатов исследований на основе классических метод выявления/культивирования микобактерий туберкулеза (в течение 1-3 месяцев) неблагоприятно сказывается на эффективности химиотерапии, особенно в связи с вероятностью неправильного выбора схемы химиотерапии при наличии ЛУ у возбудителя и риском расширения спектра устойчивости МБТ. Культивирование на жидкой питательной среде в автоматизированной системе учета роста микроорганизмов – ускоренный культуральный диагностический метод (10- 14 дней) Культивирование на жидкой среде повышает выявление МБТ примерно на 10% по сравнению с твердыми средами. В настоящее время широко используются системы с автоматической детекцией учета роста МБТ, которые позволяют значительно ускорить получение результат. В бактериологических лабораториях медицинских организаций фтизиатрического профиля РФ преобладающей является автоматизированная система BACTEC MGIT 960/320.
Рис. 3. Автоматизированная система культивирования микобактерий: MGIT-BACTEC-960 Преимущества автоматизированной системы культивирования BACTEC MGIT 960/320 перед культуральными исследованиями на плотных питательных средах обеспечиваются высокой эффективностью стандартизованных и сертифицированных по ISO9001 производств реагентов и сред, а также поддержанием стандартных протоколов исследований. В основе методики лежит изобретение индикаторной пробирки MGIT (mycobacteria growth indicating tube). Содержимое пробирки MGIT – это питательный бульон, благодаря которому достигается более эффективное выделение микобактерий и их ускоренный рост. Пробирка содержит 7 мл стерильного питательного бульона Мидлбрук 7Н9, в которую перед использованием вносится обогатительная добавка для стимуляции роста МБТ. На дне пробирки содержится кислородзависимый флюорохромный краситель. Во время бактериального роста внутри пробирки происходит поглощение свободного кислорода и его замещение углекислым газом. По мере расходования свободного кислорода возникает флюоресценция. Флюоресценция становится видимой при облучении пробирки ультрафиолетовым светом и автоматически регистрируется фотодатчиками, встроенными в прибор BACTEC MGIT 960/320 (рис. 4). Один раз в час флуоресцентный сенсор считывает результаты тестирования. Интенсивность свечения прямо пропорциональна уровню расходования кислорода и регистрируется в единицах роста (GU –growth units). В среднем появление роста МБТ сокращается до 11 дней. Прибор оценивает пробу как отрицательную при отсутствии роста в течение шести недель (42 дня).
Рис. 4. Результаты индикаторной пробирки MGIT на выделения культуры МБТ Молекулярно-генетические методы Основное преимущество исследований на основе молекулярно-генетических методов в том, что они являются «быстрыми» методами, позволяющими получить результаты в относительно короткий временной период. Заключение о наличии МБТ в диагностическом материале делается на основании выявления видоспецифичного генетического маркера (ДНК) МБТ или видоспецифичных белков-антигенов, а вывод о ЛУ - на основании выявления мутаций в целевых участках генов МБТ, ассоциированных с ЛУ. Из всех молекулярно-генетических подходов базовым методом, применяемым для выявления M.tuberculosis complex является полимеразная цепная реакция (ПЦР). Проведение ПЦР-анализа происходит в три этапа:
Выделение ДНК — это первоначальный этап проведения ПЦР-диагностики, суть которого заключается в следующем: врач забирает у пациента материал для исследования и подвергает его специальной обработке. В процессе обработки происходит расщепление двойной спирали ДНК на отдельные нити. В материал пациента добавляется специальная жидкость, растворяющая органические вещества, мешающие «чистоте» проведения реакции (табл. 3). Таблица 3. Варианты проведения амплификации и визуализации результатов ПЦР
Выделение ДНК из диагностического материала, полученного от больных туберкулезом – сложный многоэтапный процесс, который может производится вручную или с использованием автоматов для выделения. Амплификация ДНК. Для осуществления амплификации ДНК используются так называемые ДНК-матрицы — молекулы ДНК МБТ, на которые впоследствии будет происходить «клонирование» ДНК. Для проведения этого этапа достаточно небольшого кусочка молекулы ДНК, который присущ только МБТ. В большинстве тест-систем избран фрагмент ДНК IS6110, который в многочисленных штаммах МБТ имеет в геноме значительное число (10-20) повторов, что обеспечивает, наряду со специфичностью, высокую чувствительность анализа. Все многочисленно повторяющиеся этапы амплификации происходят при различных температурах. Для проведения ПЦР-анализа используется специально программируемое оборудование – ПЦР–термостат или амплификатор, которое автоматически осуществляет смену температур. Амплификация проводится по заданной программе и составляет 2 часа. В процессе детекции продуктов амплификации проходит разделение полученной смеси продуктов амплификации. К смеси добавляется специальные растворы, которые наделяют фрагменты ДНК способностью флюоресцировать — отражаться оранжево-красными светящимися полосами. Образующееся свечение выдает присутствие ДНК МБТв забранном у пациента на ПЦР-анализ материале. Одной из инновационных технологий, основанных на ПЦР в режиме реального времени, является использование анализатора Xpert MTB/RIF (Cepheid, США). Этим оборудованием оснащены многие противотуберкулезные учреждения РФ. Она упрощает молекулярное тестирование, обеспечивая полную интеграцию и автоматизацию трех процессов (подготовка образца, амплификация и детекция), необходимых для молекулярного тестирования. Тест Xpert MTB/RIF имеет аналитическую чувствительность пяти геномных копий очищенных ДНК M. tuberculosis. Молекулярные маяки, которые нацелены на ген «rpoB», охватывают все мутации, обнаруженные в >99,5 % штаммов, устойчивых к рифампицину. Перекрестная реактивность с нетуберкулезными микобактериями отсутствует. ДНК МБТ, устойчивая к рифампицину выявляется в присутствии, как нетуберкулезных ДНК, так и в смешанных чувствительных и устойчивых штаммах. Образцы материала человека в основном могут быть взяты из мокроты, промывных вод бронхов, мочи, плеврального экссудата, ликвора. Итоговые результаты тестов предоставляются в графическом и табличном форматах (рис. 5). Xpert MTB/RIF позволяет сразу при подозрении у пациента туберкулеза взять у него мокроту и в течение двух часов определить есть ли у него МБТ и устойчивые ли они к самому эффективному противотуберкулезному препарату (рифампицин). Данная методика позволяет с первых дней назначить адекватную химиотерапию, и распределить потки поступающих больных в противотуберкулезный диспансер и направить в специализированные отделения (с лекарственно-устойчивым туберкулезом).
Рис. 5 Анализатора Xpert MTB/RIF . Подготовка образцов к проведению теста При работе системы GeneXpert необходимы минимальное число ручных операций и специализированных знаний. Пользователь просто добавляет биологический образец для тестирования в картридж, ставит его на борт прибора, и система GeneXpert автоматически запускает цикл реакций (рис. 5). Прибор GeneXpert компактен и удобен, может быть установлен вне лаборатории. Малые размеры прибора и незначительные потребности в энергии позволяют системе работать практически в любом помещении. Настольный ПК или ноутбук используется для выполнения программного обеспечения и хранения базы данных, содержащей результаты работы системы GeneXpert. Программное обеспечение позволяет выбирать описания тестов, контролировать процесс тестирования, просматривать результаты теста и экспортировать данные для анализа в приложениях сторонних разработчиков. Программное обеспечение также используется для архивирования результатов, извлечения данных из архива и управления базой данных. Сканер штрих-кодов ускоряет ввод данных, а также снижает вероятность возникновения ошибки при вводе данных. Дифференциация (типирование) микобактерий туберкулеза Необходимо отличать микобактерии туберкулеза от сапрофитных микобактерий, которые определяются в 0,3-3% культур. Кислотоустойчивые сапрофитные микобактерии можно выделить как из внешней среды, так и из материала здорового человека, а также и из патологического материала. Присутствие сапрофитных микобактерий в мокроте, слюне, промывных водах желудка и бронхов, моче, кале и т. д. может быть не связано с наличием заболевания и служить источником серьезных диагностических ошибок. Обнаружение кислотоустойчивых сапрофитов в мокроте больных может привести к ошибочному диагнозу туберкулеза. Идентификация микобактерий по культуральным свойствам. При посеве на плотные питательные среды на основании скорости роста бактерий, морфологии и окраски колоний (пигментообразование) можно сделать предварительное заключение о принадлежности культуры либо к комплексу МБТ, либо к нетуберкулезных микобактерий (НТМБ). При культивировании МБТ на жидких питательных средах проводится тестирование на контаминацию (микроскопия культуры с окраской по Цилю-Нильсену и посев на кровяной агар) и затем молекулярно-генетическими методами подтверждается принадлежность к микобактериям туберкулезного комплекса; Идентификация микобактерий с помощью биохимических тестов Дифференциация микобактерий туберкулезного комплекса и нетуберкулезными видами микобактерий основана на их культуральных свойствах и способности к росту на дифференциально-диагностических средах. Наиболее часто применяемыми и общепринятыми тестами являются способность к росту на среде, содержащей 1000 мкг/мл натрия салициловокислого; к росту на среде, содержащей 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты; к росту на среде, содержащей 5% хлорида натрия. Виды микобактерий туберкулезного комплекса не способны к росту на указанных питательных средах. Для дифференциации вида M.bovis от других видов туберкулезных микобактерий используют культуральный тест на способность к росту на среде, содержащей 2 мкг/мл гидразида тиофен-2 карбоксиловой кислоты. Среди всех представителей этой группы только указанный вид не дает роста на этой питательной среде. Для контроля контаминации при культивировании на жидкой/плотной питательной среде проводят посев культур на чашки Петри с кровяным агаром. Наличие роста микроорганизмов через 24-72 часа инкубации при +37°С свидетельствует о контаминации материала посторонней микрофлорой. Эти исследования являются достаточно длительными, трудоемкими и требуют дополнительных капиталовложений, материально-технической базы, надлежащих условий, обеспечивающих биологическую безопасность. Идентификация микобактерий с помощью молекулярно-биологических методов Методы видовой идентификации, основанные на выявлении генетических маркеров МБТ с помощью ПЦР, имеют преимущество в специфичности и быстроте анализа по сравнению с культуральными и биохимическими методами. Молекулярные методы дифференциации МБТ от нетуберкулезных микобактерий основаны на выявлении видоспецифических структур в геноме или белковом спектре возбудителя. Одни методы направлены только на дифференцировку микобактерий туберкулезного комплекса от нетуберкулезных микобактерий, другие - пригодны для точной видовой идентификации возбудителя. К методам, дифференцирующим микобактерий туберкулезного комплекса от нетуберкулезных микобактерий, относится ПЦР, выявляющая вставочную последовательность ДНК IS6110, присутствующую только у микобактерий туберкулезного комплекса. Иммунохроматографический метод идентификации выросших культур микроорганизмов (метод поддержан ВОЗ), основанный на определении наличия специфического антигена МБТ МРТ64, отличается простотой выполнения и позволяет получить результат идентификации МБТ за 15 минут. Данный метод может быть рекомендован в качестве основного при проведении идентификации культур, выросших на жидких и/или плотных питательных средах, а также в контаминированных культуральных образцах. Методики, обеспечивающие точную видовую идентификацию нетуберкулезных микобактрий, более трудоемки и требуют больших материальных затрат. К ним относится гибридизационные технологии на нейлоновых мембранах (ДНК-стрипы), позволяющие идентифицировать следующие виды нетуберкулезных микобактерий: M.avium ssp., M.chelonae, M.abscessus, M.fortuitum, M.gordonae, M.intracellular e, M.scrofulaceum, M.interjection, M.kansasii, M.malmoense, M.peregrinum, M.marinum, M.ulcerans, M.xenopi и M.simiae, M.mucogenicum, M.goodii, M.celatum, M.smegmatis, M.genavense, M.lentiflavum, M.heckeshornense, M.szulgai, M.intermedium, M.phlei, M.haemophilum, M.kansasii, M.ulcerans, M.gastri, M.asiaticumvL M.shimoidei. Этим методом можно исследовать культуры с плотной и жидкой питательных сред и получить результат в течение 1 -2 дней. Идентификация МБ до вида может проводиться также с помощью секвенирования, MALDI-ToF масс-спектрометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), тонкослойной хроматографии, результаты которых основаны на выявлении уникальных для каждого вида МБ структур. Определения лекарственной чувствительности МБТ к ПТП Цель микробиологических методов исследования лекарственной чувствительности МБТ к ПТП состоит в том, чтобы определить отличается ли клинический изолят от «дикого» штамма МБТ по степени чувствительности к соответствующему антимикробному агенту. При оценке результата микробиологического исследования культура МБТ признаётся устойчивой, если микобактерии дают рост на питательной среде в присутствии критической концентрации заключённого в неё противотуберкулёзного препарата. Таблица 4. Методы определения лекарственной чувствительности МБТ к ПТП
Метод абсолютных концентраций на плотной питательной среде Левенштейна-Йенсена, основанный на добавлении в культуральную среду определенных стандартных концентраций противотуберкулезных препаратов, которые принято называть критическими при расчете на мкг/мл. Критическая концентрация – это самая низкая концентрация, которая подавляет рост 95% «диких» штаммов МБТ. Для каждой среды или системы культивирования подобраны соответствующие критические концентрации препаратов. Культура МБТ считается чувствительной к той или иной концентрации противотуберкулезного препарата, которая содержится в среде, если число колоний МБТ, выросших в одной пробирке с тем или иным ПТП, не превышает 20, а посевная доза соответствует 107 микробных тел. Модифицированный метод пропорций в жидкой питательной среде в системе с автоматизированным учетом роста микроорганизмов типа BACTEC MGIT 960. В процессе определения происходит сравнение скорости роста МБТ - в контрольной пробирке и в пробирках с лекарственными препаратами. В первую пробирку не вносится лекарственный препарат - контрольную, в остальные пробирки добавляются известные концентрации тестируемых лекарственных препаратов, рост в которых сравнивается с ростом в контрольной пробирке. Если тестируемый лекарственный препарат активен по отношению к выделенным МБТ, он будет ингибировать рост и подавлять флюоресценцию, при этом в контрольной пробирке рост не ингибируется и, соответственно, уровень флюоресцентности в данной пробирке будет выраженный. Мониторинг роста осуществляется при помощи прибора BACTEC MGIT 960/320, который автоматический интерпретирует результаты на наличие чувствительности или резистентности МБТ к препарату. На плотной питательной среде Левенштейна-Йенсена проводят определение ЛЧ МБТ методом абсолютных концентраций к ПТП первого ряда (стрептомицин, изониазид, рифампицин, этамбутол) и к ПТП второго ряда (канамицин, капреомицин, циклосерин, офлоксацин, этионамид, аминосалициловая кислота, амикацин). На жидких питательных средах проводят определение ЛЧ МБТ к ПТП первого ряда (изониазид, рифампицин, этамбутол, стрептомицин, пиразинамид) и к ПТП второго ряда (амикацин, канамицин, офлоксацин, левофлоксацин, моксифлоксацин, этионамид, протионамид, капреомицин, аминосалициловая кислота, линезолид). Молекулярно-генетические методы определения лекарственной чувствительности/устойчивости МБТ Генотипические методы определения лекарственной чувствительности/устойчивости МБТ основаны на изучении специфических участков генома МБТ и выявлении наличия или отсутствия определенных мутаций в генах, связанных с резистентностью к конкретным ПТП. При этом исследованию могут подвергаться как диагностический материал, так и выросшие культуры микроорганизмов. Основным достоинством молекулярно-генетических является быстрое и достоверное выявление больных МЛУ ТБ, так как они позволяют выявить ЛУ МБТ к рифампицину и изониазиду, а также к важнейшим препаратам второго ряда, позволяя использовать разделение потоков больных и включать в режим лечения наиболее эффективные препараты. Молекулярно-генетические тест-системы определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза представлены тремя основными технологиями: Гибридизационные технологии, основанные на гибридизации продуктов ПЦР со специфическими олигонуклеотидами, иммобилизированными на матрице, которая может представлять собой биологический микрочип, или ДНК-стрип. Гибридизационные технологии позволяют в культуре с плотной или жидкой среды или непосредственно в мокроте, положительной по результатам микроскопического исследования, в течение 1-2 дней выявлять наиболее распространенные мутации в генах МБТ, связанных с устойчивостью к основным ПТП первого ряда - изониазиду и рифампицину и некоторым ПТП второго ряда (в зависимости от тест-системы). Данная группа методов основана на том, что амплифицированные в результате ПЦР целевые последовательности гибридизуются с зондами, нанесенными на соответствующую матрицу. По результатам гибридизации делается вывод о наличии мутаций, влекущих устойчивость к ПТП. Мультиплексная ПЦР в режиме реального времени. Метод ПЦР в режиме реального времени позволяет определять мутации, ассоциированные с ЛУ к рифампицину, изониазиду. Преимуществом данного метода перед описанными выше является отсутствие этапа гибридизации и оценка результатов в режиме реального времени, что позволяет снизить возможность кросс-контаминации образцов. Однако, для получения информации, сравнимой с гибридизационными технологиями, необходимо проведение большего числа циклов анализа. Использование зарегистрированных наборов позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью (94 % и 99 %, соответственно) выявлять мутации в генах rpoB, katG и inhA, ассоциирующиеся с устойчивостью к рифампицину и изониазиду. «Картриджная» технология (выделение ДНК и амплификация идут автоматически в специальном картридже в системе GeneXpert). Использование этой системы позволяет непосредственно из нативной мокроты в очень короткие сроки (в течение 2,5 часов) одновременно проводить выявление ДНК МБТ и с высокой достоверностью определять устойчивость к рифампицину. Классификация лекарственной устойчивости МБТ Первичная лекарственная резистентность – это устойчивость МБТ к ПТП, которая обнаружена у впервые выявленных больных, которые никогда не принимали противотуберкулезную терапию. Вторичная лекарственная устойчивость (приобретенная) – резистентность МБТ, которая обнаружена у больных, которые принимали ПТП больше 4 недель. Лекарственная устойчивость классифицируется как: Монорезистентность – устойчивость только к одному ПТП. Полирезистентность – устойчивость к двум и ПТП, но не к сочетанию изониазида и рифампицина. Устойчивость к рифампицину – лекарственная устойчивость МБТ к рифампицину независимо от лекарственной устойчивости к другим противотуберкулезным препаратам, определенная любым методом тестирования лекарственной чувствительности. Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) – устойчивость к сочетанию изониазида и рифампицина независимо от наличия устойчивости к другим противотуберкулезным препаратам. Широкая лекарственная устойчивость (ШЛУ) – сочетанная устойчивость к изониазиду, рифампицину, фторхинолону и канамицину и/или амикацину и/или капреомицину независимо от наличия устойчивости к другим противотуберкулезным препаратам. Причины лекарственной устойчивости: 1) биологические – недостаточная концентрация препарата в очаге туберкулезной инфекции, индивидуальные особенности организма пациента (быстрая скорость инактивации препаратов); 2) причины, обусловленные пациентом – контакт с больными резистентным туберкулезом, отсутствие приверженности лечению (нерегулярный прием препаратов, неосознания важности лечения, преждевременное прекращение приема ПТП), неудовлетворительная переносимость препаратов, в том числе и сопутствующая патология, требующая приостановления (коррекция) противотуберкулезной терапии; 3) факторы, обусловленные течением заболевания – распространенный, быстропрогрессирующий деструктивный процесс; 4) факторы, обусловленные назначенным лечением – неадекватная схема лечения, лечение одним препаратом (монотерапия), недостаточная доза или длительность лечения, использования препаратов с перекрестной стойкостью, использование ПТП низкого качества, где доза препарата не соответствует заявленной. |