Тиф. брюшной тиф. Методические указания по диагностике, лечению и профилактике в вооруженных силах российской федерации министерство обороны РФ

• Название: Методические указания по диагностике, лечению и профилактике в вооруженных силах российской федерации министерство обороны РФ
• Дата: 29.10.2019
• Размер: 433.5 Kb.
• Имя файла: брюшной тиф.doc
• Тип: Методические указания; #92444
• страница: 8 из 9

Желчный бульон. а) 20% желчный бульон. Состав: бульон мясопептонный (МПБ) или Хоттингера - 800 мл, желчь бычья нативная - 200 мл, рН 7,6. Разливают в стерильные флаконы по 100 мл. Стерилизуют при 110 С 30 мин. б) 10% желчный бульон. Состав: бульон мясопептонный или Хоттингера - 900 мл, желчь бычья нативная - 100 мл, рН 7,6. Стерилизуют при 110 С 30 мин. При отсутствии нативной желчи ее можно приготовить из сухой, для чего 80 г порошка сухой желчи добавляют к 1000 мл дистиллированной воды, кипятят до полного растворения, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, стерилизуют текучим паром 3 дня подряд в течение 30 мин. Для приготовления желчного бульона добавляют к МПБ в указанных выше количествах

Среда Рапопорт. К 1 л МПБ добавляют 100 мл. желчи, 20 г глюкозы или 10 г маннита и 10 мл индикатора Андреде.

Приготовленную среду разливают во флаконы по 100 мл с опущенными в них трубочками-поплавками, которые на 2-2,5 см должны возвышаться над уровнем жидкости. Среду стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин. Во время стерилизации среда заполняет поплавки доверху.

Селенитовая среда. Основным действующим началом является кислый селенистокислый натрий, который стимулирует рост патогенных бактерий и тормозит размножение сопутствующей микрофлоры. Готовят из сухого препарата "Селенитовый бульон Лейфсона" по инструкции на этикетке. При отсутствии сухого препарата среду готовят как указано ниже.

Состав среды: натрий кислый селенистокислый без примеси теллура (NaHSeO₃) - 4 г, пептон - 5 г, натрия гидрофосфат (Na₂HPO₄) - 7 г, натрия дигидрофосфат (NaH₂РО₄) - 3 г, лактоза (х.ч.) - 4 г, дистиллированная вода - 1000 мл.

Среду готовят из 2-х основных растворов. Сначала экспериментально определяют точную пропорцию Na₂HPO₄ и NaH₂PO₄, которая с использованными навесками пептона и NaHS₂O₃ давала бы рН в пределах 6,9-7,1. Точную предварительную проверку необходимо делать всякий раз, когда меняется серия любого из входящего в среду основных ингредиентов (пептон, фосфаты, NaHS₂O₃).

Когда такое соотношение установлено, к приготовленному раствору фосфата добавляют пептон и лактозу. Разливают во флаконы по 50 мл и стерилизуют текучим паром в течение 2-х дней по 30 мин. Можно хранить при 4 С в течение 2-х месяцев. Отдельно на стерильной дистиллированной воде готовят 10% раствор кислого селенистокислого натрия. Перед началом работы в каждый флакон с 50 мл основного раствора добавляют 2 мл раствора кислого селенистокислого натрия, сразу разливают в стерильные пробирки по 5-7 мл и закрывают плотно пригнанными пробками.

Готовая среда хранению не подлежит. Стерилизация в автоклаве готовой среды не допускается, так как при этом происходит редукция селенита натрия, выпадает осадок красного цвета и среда становится непригодной.

Испражнения вносят в пробирки со средой в таком количестве, чтобы по отношению к оъему среды они составляли 1/3, перемешивают и помещают в термостат на 10-16 часов, а затем делают высев на чашки с плотными средами. При использовании селенитовой среды для исследования воды, мочи, рвотных масс и промывных вод следует готовить среду с удвоенной концентрацией составных частей и исследуемый материал засевать в соотношении 1:1.

Для приготовления среды предпочтительны особые виды пептона: чешский - фирмы Спофа, венгерский - фирмы Рихтер. Раствор селенистокислого натрия готовят ex tempore.

Магниевая среда (среда М). Предназначена для выделения сальмонелл (за исключением S.typhi, S.dublin, S.pullorum) из испражнений и объектов внешней среды. Среда может быть приготовлена в обычной концентрации (для исследования материала малых объемов - испражнений, пищевых продуктов, сточных жидкостей), в двойной концентрации (для исследования больших объемов - вода открытых водоемов), а также в виде навесок солей и концентрированных растворов (“экспедиционная” модификация).

Для приготовления 100 мл среды обычной концентрации составляют растворы А, Б, В по следующей прописи:

раствор А - пептон семипалатинский - 0,42 г, натрия хлорид (NaCl) - 0,7 г, калий дигидрофосфат (КН₂РО₄) - 0,15 г, дрожжевой диализат - 2 мл, вода дистиллированная - 89 мл;

раствор Б - хлорид магния кристаллический - 3,6 г (MgCl₂^.6H₂O) вода дистиллированная - 9 мл;

раствор В - 0,1% водный раствор бриллиантового зеленого - 0,5 мл.

Ингредиенты растворяют, кипятят в течение 10 мин, затем растворы А, Б, В сливают в одну колбу и по потребности разливают в стерильные пробирки. Исследуемые фекалии 0,5-1,0 г вносят в пробирку с 5 мл среды и инкубируют при +37 С⁰ в течение 18-24 ч, а затем высевают на висмут-сульфит агар.

Среда Мюллера. В стерильные флаконы вносят по 4,5 г карбоната кальция, стерилизуют сухим жаром. Наливают в каждый флакон 90 мл МПБ и стерилизуют при 1 атм в течение 20 мин. В асептических условиях ex tempore добавляют 2 мл раствора Люголя и 10 мл раствора тиосульфата натрия (Na₂S₂O₃) и разливают в стерильные пробирки.

Для приготовления среды используют бульон из перевара Хоттингера, содержащий 0,13-0,15% азота аминных групп. Важное значение имеет рН среды. В связи с тем, что некоторые сорта мела вызывают значительные изменения рН бульона после автоклавирования, следует обязательно проверять реакцию каждой серии среды и устанавливать рН 7,2-7,4.

Состав раствора Люголя: 20 г йодида калия, 25 г йода, дистиллированной воды до 100 мл. Для приготовления раствора серноватистокислого натрия следует взять 50 г соли и добавить до 100 мл дистиллированной воды. Стерилизуют текучим паром.

Среды Эндо, Левина, Ресселя, Клиглера, висмут-сульфитный агар, питательный агар - готовят из сухих рецептур по прописи, указанной на этикетке. Пригодность каждой новой серии среды подлежит предварительной проверке.

Среда Олькеницкого из сухих питательных сред. Расплавляют 2,5 г сухого питательного агара в 100 мл дистиллированной воды и охлаждают до 50 градусов. Затем прибавляют 1 г лактозы, 0,02 г соли Мора, 0,05 г гипосульфита, 1 г сахарозы, 0,1 г глюкозы, 1 г мочевины, 0,4 мл фенолового красного (0,4% раствор). Соль Мора и гипосульфит предварительно растворяют в дистиллированной воде в пробирках. Углеводы и мочевину также растворяют в небольшом количестве дистиллированной водя на водяной бане.

Все ингредиенты хорошо перемешивают с агаром, а затем фильтруют через стерильную марлю и устанавливают рН 7,2-7,4. Добавляют индикатор и разливают в стерильные пробирки, стерилизуют текучим паром 3 дня по 20 мин, а затем скашивают высоким столбиком. Готовая среда должна быть бледно-розового цвета. Ферментация глюкозы изменяет цвет среды в столбике на желтый, если ферментируется лактоза и сахароза - желтеет вся среда; газообразование приводит к разрыву среды в столбике; почернение свидетельствует о наличии сероводорода, восстановление цвета до первичной окраски указывает на расщепление мочевины. Использование модификации среды без сахарозы уточняет учет ( ферментируется только лактоза).

Жидкие среды Гисса. В дистиллированную воду прибавляют 1% пептона и 0,5% хлорида натрия. Растворяют на огне, прибавляют 1% индикатора Андреде или 0,1% спиртового раствора бромтимолового синего, нагревают до 80⁰ С и устанавливают рН 7,2. Затем среду кипятят 5 мин, фильтруют и доводят до первоначального объема дистиллированной водой. Добавляют 0,5-1% одного из углеводов, разливают по пробиркам с поплавком только в среде с глюкозой (длина 25 мм, диаметр 3 мм). Разлитая среда сразу не заполняет всего поплавка, это достигается при последующем кипении во время стерилизации. При изготовлении полужидких сред Гисса следует добавлять 1% углеводов и 0,4% агар-агара. Стерилизуют среду 3 дня подряд текучим паром по 30 мин.

Сухие среды Гисса. Готовят согласно указаниям на этикетке. Индикатор ВР, входящий в среду, в кислой зоне имеет синюю окраску, в щелочной - красную, при нейтральной реакции - бесцветную. Газообразование регистрируется по пузырькам газа или разрывам среды. Стерилизацию среды проводят так же, как жидких сред Гисса.

Среда Кларка. К 80 мл дистиллированной воды добавляют 0,5 г пептона, 0,5 г глюкозы, 0,5 г К₂НРО₄ и подогревают, помешивая в течение 20 мин. Фильтруют через бумажный фильтр, охлаждают до 20⁰ С и доводят объем до 100 мл дистиллированной водой. Разливают по 5 мл в пробирки и стерилизуют 3 дня подряд по 30 мин.

Для определение интенсивности кислотообразования (реакция с метиловым красным) к 1- 4 суточной культуре прибавляют 3-5 капель 0,04% метилового красного (1 мл 1,6% спиртового раствора метилового красного и 39 мл спирта; раствор сохраняется неограниченное время). При сильном кислотообразовании получается красное окрашивание, при слабом - желтое.

Для определения ацетоина (ацетилметилкарбинола) к 2 мл суточной культуры добавляют 1 мл 6% спиртового раствора aльфа-нафтола и 0,4 мл 40% водного раствора едкого кали, помещают на 1 час в термостат при 37⁰ С. Окрашивание реактива в красный цвет свидетельствует о наличии ацетоина.

Среда Симмонса. На 1 литр дистиллированной воды берут аммония гидрофосфата 1,5 г , нейтрального натрия цитрата 3 г, магния сульфата 0,2 г, агар-агара 20 г. Устанавливают рН 7,2, добавляют 10 мл 1,5% спиртового раствора бромтимолового синего, фильтруют, разливают по пробиркам по 5 мл, стерилизуют при температуре 120⁰ С 15 мин и скашивают. Микробы, не утилизирующие цитрат, на среде не растут. Цитратассимилирующие бактерии растут, подщелачивая среду, окраска переходит в синий цвет.

Среда Клиглера. На 1 л дистиллированной воды берут панкреатического гидролизата казеина - 20 г, экстракта дрожжей - 6 г, натрия хлорида 5 г, натрия тиосульфата - 0,3 г, лактозы 10 г, глюкозы 1 г, натрия метабисульфита 0,5 г, натрия карбоната 0,8 г, железа окисного цитрата 0,3 г, фенолового красного 0,05 г, агар-агара 11 г. Устанавливают рН 7,4. Среда выпускается в виде сухого порошка. На 1 л дистиллированной вода берут 55 г порошка, нагревают 3-5 мин, доводят до кипения и разливают в пробирки по 6 мл, стерилизуют при 0,6 атм в течение 30 мин, скашивают так, чтобы в нижней части пробирки был столбик высотой 2,5-3 см. Готовая среда имеет темно-красный (бурый) цвет.

При росте ферментирующих лактозу микроорганизмов скошенная часть агара желтеет. Если наступает ферментация глюкозы, среда желтеет в столбике. Газообразование определяется по разрыву агара в столбике среды. В случае добавления к среде мочевины можно определять фермент уреазу, наличие которой ведет к смещению рН в щелочную сторону и среда остается красного цвета.

Среда для определения декарбоксилаз лизина, орнитина, дигидролазы аргинина. По прописи кафедры микробиологии Военно-медицинской академии: пептон -1г, мясная вода -50 мл, глюкоза -1 г, натрия хлорид -3 г, магния сульфат- 0,1 г, калия дигидрофосфат -1,5 г, никотиновая кислота- 0,2 г, витамин В₆ - 0,05 г; 1,6% спиртовой раствор бромтимолового синего - 5 мл; вода дистиллированная до 1 литра. Разделить среду на 4 равные объема. Добавить в каждую колбу, кроме четвертой, по 0,5% одной из аминокислот (L-лизин, L-орнитин, L-аргинин). DL-аминокислоты добавляют в двойном количестве. Установить рН 6-6,2. Среда в четвертой колбе без аминокислот служит контролем.

Разлить среду в стерильные пробирки по 2-3 мл. Стерилизовать при 0,5 атм 20 мин. Исходный цвет среды желтый. При наличии у исследуемых микробов декарбоксилаз указанных аминокислот цвет среды изменяется через 24-48 ч до зеленой или синей окраски, цвет контрольной среды остается без изменений.

Среда по Фалькоу. (модификация): пептон -5 г, дрожжевой экстракт сухой (ЭКД)- 3 г, глюкоза (х.ч.) -1 г, бромтимоловый синий 1,6% спиртовой раствор- 5 мл, дистиллированная вода -1 л. Основа среды делится на 4 части. К каждой из них добавляется по 1% одной из указанных выше аминокислот, чистые или их соли: L-лизин дигидрохлорид, L-аргинин моногидрохлорид, L-орнитин дигидрохлорид или по 2% DL-аминокислот. Четвертая часть (без аминокислот) - контрольная. Устанавливают рН 6-6,2. Все порции разливают по 2-3 мл в серологические пробирки. Стерилизуют при 0,5 атм 20 мин. Готовая среда имеет светло-зеленый цвет. При положительном результате среда синеет, при отрицательном - желтеет.

Среды с аминокислотами после внесения в них взвеси изучаемых культур заливают слоем стерильного вазелинового масла 1-2 мм.

Среда с триптофаном. К 100 мл дистиллированной воды добавляют 1 г пептона, хлорида натрия - 0,5 г, DL-триптофана -1 г, агар-агара -2 г. Стерилизуют паром при 0,5 атм в течение 30 мин. Разливают в стерильные пробирки по 0,5 мл и хранят в холодильнике. Перед использованием среду расплавляют в водяной бане.

Исследуемую культуру снимают петлей с плотной среды и эмульгируют в чашке Петри в капле стерильного 0,8% изотонического раствора натрия хлорида. В нее вносят каплю расплавленного и остуженного до +50⁰ С агара с триптофаном. На внутреннюю поверхность крышки помещают комок влажной ваты для создания влажной камеры. Чашку закрывают и переворачивают. Результат реакции учитывают через 4 ч после инкубации при +37⁰ С. При наличии триптофандезаминазы застывшая агаровая капля приобретает коричневый цвет.

Среда для выявления дезаминазы фенилаланина: дрожжевой экстракт сухой (ЭКД)-3 г, L-фенилаланин -1 г, натрия гидрофосфат (Na₂HPO₄) - 1 г, натрия хлорид -5 г, агар-агар -12 г, дистиллированная вода -1 л. Вместо L-фенилаланина можно использовать DL-фенилаланин в двойном количестве. Среду разливают по 3 - 4 мл в серологические пробирки, стерилизуют при 1 атм 10 мин и скашивают. Посев делают массивной дозой. Инкубация при температуре 37⁰ С 20-24 часа. Для оценки результата на поверхность выросшей культуры наносят 4-5 капель 10% раствора хлорида железа (FeCl₃). Положительные реакции вызывают окрашивание косяка и конденсата от интенсивно-зеленого до светло-зеленого цвета. При отрицательной реакции окрашивания нет.

Ацетатная среда. Растворяют при нагревании в 1 л дистиллированной воды 20 г агар-агара, добавляют натрия хлорида -5 г, MgSO₄^. 7H₂O - 0,2 г, NH₄H₂PO₄ ^- 1г, K₂HPO₄ -1 г, ацетат натрия или калия -2 г, устанавливают рН 7,2-7,4. Добавляют индикатор -2 мл 1,6% спиртового раствора бромтимолового синего. Среду разливают в колбы или пробирки, стерилизуют при температуре 115⁰ С 20 мин, разливают в чашки или скашивают в пробирках. Цвет готовой среды зеленый. При росте бактерий среда приобретает синий цвет.

Приготовление индикаторных бумажек на индол. Смешивают параметил-амидобензальдегид 3-5 г, спирт 96⁰ 50 мл и фосфорную кислоту (очищенную, концентрированную) 10 мл. Затем дают раствориться порошку. Полученной тепловатой жидкостью смачивают листы фильтровальной бумаги, высушивают и нарезают узкими полосками. Цвет бумаги желтый. При наличии индола цвет от сиренево-розоватого до интенсивно-малинового.

Реактив Ковача для определения индола. В 75 мл амилового или изоамилового спирта растворить 5 г пара-диметиламинобензальдегида и добавить 25 мл концентрированной хлористоводородной кислоты. Хранить в темном месте с притертой пробкой.

В пробирку суточной бульонной культуры наслоить 0,5 мл реактива. При наличии индола через несколько минут реактив окрасится в ярко-красный цвет.

Индикатор Андреде: кислого фуксина -1 г, дистиллированной воды -200 мл и нормального раствора едкого натра -32 мл. Смесь настаивают при комнатной температуре в течение 3-х суток или в течение суток при температуре 37⁰ С и затем фильтруют. Сохраняют в темной посуде. В кислой среде - красный цвет, а в щелочной - бесцветный.

Индикатор ВР. Смесь водного голубого и розоловой кислоты. В кислой среде - синий цвет, в щелочной - красный, в нейтральной - бесцветный.

Индикатор бромтимоловый синий: в кислой среде - желтый, в щелочной - синий.
ПРИЛОЖЕНИЕ 3
МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАГОВАРИАНТОВ КУЛЬТУР

БРЮШНОГО ТИФА, ПАРАТИФА В
Определение фаговариантов культур брюшного тифа возможно только в том случае, когда культура содержит Vi-антиген, агглютинируется Vi-сывороткой и не агглютинируется О-сывороткой.

Исследовать необходимо 2-3-х часовые бульонные культуры. Взять 1,3% прозрачный МПА рН 7,2-7,4. Чашки с агаром хорошо подсушить и на поверхность среды нанести испытуемую культуру в виде полоски шириной 5-6 мм, чашку поместить в термостат на 30 мин. На полоску нанести Vi-фаги 2-го серологического варианта в критическом тест-разведении, указанном в наставлении к набору фагов. Чашки поместить в термостат на 2-3 часа при 37⁰ С, а затем на ночь в холодильник при 2-6⁰ С. На следующий день чашки поместить в термостат на 5-6 часов и учесть результаты исследования.

Фаговар культуры определяют по фагу, который полностью лизирует культуру.

Фаговарианты сальмонелл паратифа В технически определяются также. Отличие состоит только в том, что выдерживание чашек в холодильнике продолжается 24 ч. Фаговар определяется литическим действием набора определенных фагов. Таблица по учету прилагается к набору фагов.
приложение 4
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ОБЪЕКТОВ

ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ НА НАЛИЧИЕ САЛЬМОНЕЛЛ
При обследовании очагов для выявления факторов и путей передачи сальмонелл - возбудителей брюшного тифа и паратифов лабораторному бактериологическому исследованию подвергают воду, смывы с различных предметов, пищевые продукты, реже - почву.

Питьевую воду для этого исследования отбирают в количестве 3 л, а воду открытых водоемов - 1 л. Питьевую воду засевают на среду обогащения после предварительной концентрации. Для этого 500 мл исследуемой воды фильтруют через мембранный фильтр № 3. Фильтры помещают на поверхность среды Эндо и подращивают в течение 18-20 ч. После подсчета колоний бактерий группы кишечной палочки и определения коли-индекса фильтры, на которых отмечен рост бесцветных колоний, помещают в 10 мл селенитовой среды и инкубируют при 37