Общая микробиология
 Скачать 1.12 Mb.
|
|
— метод определения минимальных ингибирующих (МИК) и бактерицидных (МБК) концентраций, т.е. минимальный уровень антибиотика, который позволяетinvitro предотвратить видимый рост микробов в питательной среде или полностью ее стерилизует. Это количественные методы, которые позволяют рассчитать дозу препарата, так как при лечении концентрация антибиотика в крови должна быть значительно выше МИК для возбудителя инфекции. Введение адекватных доз препарата необходимо для эффективного лечения и профилактики формирования устойчивых микробов. Существуют ускоренные способы с применением автоматических анализаторов. Метод серийных разведений Методом серийных разведений МИК определяют по минимальной концентрации антибиотика, задерживающей видимый рост микроорганизма в пробирках (макрометод), лунках планшета (микрометод) или на чашках с питательной средой, содержащих убывающие концентрации антибиотика. Например, для определения МИК тетрациклина в отношении культуры Staphylococcusaureus, выделенной от больного, готовят двукратно убывающие концентрации этого антибиотика в стандартном питательном бульоне (Бульон Мюллера-Хинтона). Контролями культуры и антибиотика являются, соответственно, бульон без антибиотика и бульон с первым разведением антибиотика. В опытные и контрольные пробирки вносят стандартизованную суспензию молодой агаровой культуры S. aureus и после суточной инкубации учитываютрезультат. Учетным признаком является наличие или отсутствие мутности бульона (роста культуры) в пробирках. В контроле культуры должна быть мутность, в контроле антибиотика - нет. Величина МИК соответствует той минимальной концентрации тетрациклина, при которой отсутствует мутность (бульон в пробирке прозрачен). Допустим, бульон будет мутным в опытных пробирках с концентрациями 1, 2, 4 и 8 мкг/мл, а в пробирках с концентрациями 16, 32 и 64 мкг/мл прозрачным. В этом случае МИК тетрациклина = 16 мкг/мл. Известно, что величина К тетрациклина при введении среднетерапевтических доз - 4 мкг/мл (при использовании максимальных доз - 10 мкг/мл). Следовательно, в данном случае терапевтический индекс будет равен Т = 16:4 = 4 (> 0,3), т.е. возбудитель устойчив к антибиотику и лечение тетрациклином не даст антимикробного эффекта в отношении S. aureus у данного больного, даже при введении максимальных доз (Т = 16:10 = 1,6). Серийные разведения в плотных средах (Агар Мюллера-Хинтона, М173) чаще используют для одновременного тестирования большого количества микробных штаммов (для посева можно использовать специальный штамп-репликатор). Учетным признаком в этом случае является наличие или отсутствие роста на поверхностиагара. Метод серийных разведений нередко считают наиболее точным, хотя и относительно трудоемким, дорогим. В действительности, при правильной постановке и соответствующих контролях диффузионные методы в ряде случаев не уступают ему по точности. Вместе с тем методом серийных разведений можно тестировать чувствительность более широкого круга микроорганизмов (включая анаэробные, медленно-растущие и прихотливые). Диско-диффузионный метод При определении чувствительности методом диффузии в агар чистую культуру возбудителя засевают «газоном» на питательный агар в чашке, например, тампоном, смоченном в стандартизованной (108 КОЕ/мл) суспензии микроорганизма. Затем на поверхность агара укладывают стандартные бумажные диски, пропитанные антибиотиками, которые диффундируют в агар, создавая градиент концентрации. На чашку диаметром 90 мм равномерно укладывают 6-7 дисков. После инкубирования в термостате измеряют диаметры зон задержки роста вокруг дисков и по специальным таблицам определяют степень чувствительности к тому или иному антибиотику Существует линейная связь между логарифмом МИК, измеренной при использовании метода серийных разведений, и диаметром зоны задержки роста при использовании диско-диффузионного метода Поскольку для получения результатов методом диффузии в агаре используют стандартизованные условия (состав и количество среды, количество засеваемых микробов, температура и сроки инкубирования, стандартные диски и др.), каждому значению диаметра зоны вокруг диска с антибиотиком соответствует определенное значение МИК. Исходя из значения МИК, можно определить терапевтический индекс: Т=МИК/К (см. выше). Следовательно, по диаметру зоны можно определить степень чувствительности к тому или иному антибиотику: чувствительные (S), умеренно-устойчивые (I) и устойчивые(R). К категории S (от англ. sensitive, чувствительный) относят те, для которых использование средних терапевтических доз будет достаточным для трехкратного превышения МИК. В категорию I (от англ. intermediate, промежуточный) относят те микробы, для подавления которых потребуются максимальные терапевтические дозы. Категорию R (от англ. resistant, устойчивый) составляют те микроорганизмы, в отношении которых данный антибиотик будет неэффективным invivo (см. выше). Таким образом, определение антибиотико-чувствительности методом серийных разведений и диско- диффузионным методом основаны на одном принципе - сравнении величины МИК для данного микроба со средней концентрацией антибиотика в сыворотке крови. Различие в том, что в первом случае МИК определяют непосредственно в опыте, а во втором случае определяют величину зоны задержки роста, как эквивалент МИК, поэтому цепочка расчетов несколько длиннее: диаметр- МИК-Т-категория чувствительности. Диско-диффузионный метод более прост, дешев и гибок в работе, хотя и имеет свои ограничения (см.ниже). Другие методы Промежуточное положение между двумя вышеописанными методами занимает метод определения чувствительности с помощью Е-тестов (E-test). Последние представляют собой бумажные полоски, пропитанные не одной, а рядом убывающих концентраций определенного антибиотика (128, 64, 32, 16, 8, 4, ...мкг/мл). Е-тесты, подобно дискам при диско-диффузионном методе, укладывают на поверхность стандартного питательного агара, засеянного испытуемой культурой в виде «газона». Врезультате диффузии антибиотик формирует в агаре эллипсовидную зону градиента концентраций:более широкую в области высоких концентраций и более узкую — в области низких. После инкубирования вокруг полоски формируется эллипсовидная зона задержки роста, которая, сужается в области малых концентраций и «пересекает» полоску на уровне, соответствующем величине МИК. Тот же принцип используется при определении чувствительности методом стрипов ХайКомб (см. ниже). При массовых исследованиях используют автоматизированные методы определения чувствительности к антибиотикам. Это позволяет упростить и ускорить проведение исследования. Наиболее часто применяют метод серийных разведений в планшетах и метод пограничных концентраций (микрометоды). В первом случае, как правило, используют готовые стерильные полистироловые 96-луночные планшеты, в лунки которых внесены лиофильно высушенные в бульоне убывающие концентрации антибиотиков. После вскрытия планшета стандартизованную суспензию испытуемой культуры в одинаковой дозе (например, 0,1 мл) асептически вносят в соответствующие ряды лунок, закрывают крышкой и инкубируют при оптимальной температуре. После инкубирования отмечают рост (помутнение бульона) в тех лунках планшета, где антибиотик не действует. При наличии помутнения бульона в контроле культуры и опытных лунках определяют величину МИК. Учет можно вести как визуально, так и с помощью специальных микробиологических анализаторов. В этих приборах имеется возможность автоматизации основных действий: внесения культуры, инкубирования, встряхивания, определения оптической плотности (степени мутности) жидкости в каждой лунке, графическое отображение результатов (в том числе в динамике), определение степени чувствительности и печать протоколаисследования. Метод пограничных концентраций можно считать усеченным методом серийных разведений. В соответствии с ним испытуемую культуру вносят только в две лунки (пробирки), где находятся высокая (С) и низкая (с) концентрации антибиотика. Концентрация «С» соответствует границе между устойчивыми и умеренно-устойчивыми штаммами, а концентрация «с»- границе между умеренно-устойчивыми и чувствительными штаммами. Если после инкубирования рост отсутствует в обеих лунках, штамм относят к чувствительным, если только в лунке с концентрацией «С»-к умеренно-устойчивыми штаммам, а если в обеих лунках имеется рост, штамм относят к устойчивым. Результат этого исследования имеет качественное (полуколичественное) выражение, но само исследование отличается простотой и экономичностью. Иногда вместо 2 концентраций используют одну или более 2 (неполный рядразведений). Многие модификации метода серийных разведений сводятся к способу учета результата: колориметрическое, турбидиметрическое, флюорометрическое исследование и др. Оригинальный диско-диффузионный метод, описанный в 1966 г., хорошо стандартизован и широко используется для количественной оценки. Он рекомендован Всемирной Организацией Здравоохранения (с незначительными модификациями) в качестве референс-теста, которым следует пользоваться при рутинной работе в клинической лаборатории. |