Общая микробиология
 Скачать 1.12 Mb.
|
84.Биологический метод микробиологической диагностики, назначение и принцип метода.Биологический метод осуществляют путем выделения возбудителя заболевания или его токсина при заражении лабораторных животных, восприимчивых к данному заболеванию. Диагноз устанавливают по воспроизведению у животного типичной картины заболевания и по выделению чистой культуры возбудителя из различных органов путем посева на питательные среды в случае заражения животного микробными ассоциациями. Идентификацию выделенного возбудителя проводят до вида (типа), используя бактериологический метод. Биологический метод используют также при определении вирулентности возбудителей. На примере вирусов: - Лабораторных животных (взрослых или новорожденных белых мышей, хомяков, кроликов, обезьян и др.) заражают исследуемым вируссодержащим материалом различными способами (подкожно, внутримыщечно, интраназально, интрацеребрально и т. д.) в зависимости от тропизма вирусов. Использование животных для культивирования вирусов в диагностических целях весьма ограничено из-за видовой невосприимчивости животных ко многим вирусам человека, контаминации животных посторонними микробами, а также по экономическим и этическим соображениям. О репродукции вирусов в организме животных судят по развитию у них видимых клинических проявлений заболевания, патоморфологическим изменениям органов и тканей, а также на основании реакции гемагглютинации (РГА) с суспензией из органов, содержащих вирусы. РГА основана на способности многих вирусов вызывать склеивание (агглютинацию) эритроцитов человека, птиц и млекопитающих в результате взаимодействия вирусных белков (гемагглютининов) с рецепторами эритроцитов. - Куриные эмбрионы (5-12-дневные) заражают путем введения исследуемого материала в различные полости и ткани зародыща. Таким образом можно культивировать вирусы гриппа, герпеса, натуральной оспы и др. Достоинствами модели являются: возможность накопления вирусов в больщих количествах; отсутствие скрытых вирусных инфекций; доступность для любой лаборатории. О репродукции вирусов в куриных эмбрионах свидетельствуют: специфические поражения оболочек и тела эмбриона (оспины, кровоизлияния); гибель эмбриона; положительная РГА с вируссодержащей жидкостью, полученной из полостей зараженного зародыща. Методику культивирования вирусов в развивающихся эмбрионах птиц используют при промышленном выращивании вирусов. Однако многие вирусы не размножаются в эмбрионах птиц. Почти неограниченные возможности для культивирования вирусов появились после открытия метода культур клеток. - Культуру клеток (тканей) наиболее часто применяют для культивирования вирусов. Метод культур клеток разработан в 50-х годах XX века Дж. Эндерсом и соавт., получившими за это открытие Нобелевскую премию. Клетки, полученные из различных органов и тканей человека, животных, птиц и других биологических объектов, размножают вне организма на искусственных питательных средах в специальной лабораторной посуде. Большое распространение получили культуры клеток из эмбриональных и опухолевых (злокачественно перерожденных) тканей, обладающих, по сравнению с нормальными клетками взрослого организма, более активной способностью к росту и размножению. Культуры клеток: однослойные культуры клеток- развиваются на поверхности в виде монослоя, суспензионные культуры клеток- клетки размножаются во всем объеме питательной среды (используют для получения большого количества клеток, например, при промышленном получении вирусных вакцин), органные культуры- цельные кусочки органов, первичные культуры- способны размножаться только в первых генерациях, т. е. выдерживают не более 5—10 пассажей после выделения из тканей, перевиваемые, или стабильные, культуры клеток - способны размножаться в лабораторных условиях неопределенно длительный срок (десятки лет), т. е. выдерживают многочисленные пассажи, полуперевиваемые культуры клеток- имеют ограниченную продолжительность жизни и выдерживают 40-50 пассажей. О репродукции вирусов в культуре клеток, зараженных вируссодержащим материалом, можно судить на основании следующих феноменов: цитопатогенного действия (ЦПД) вирусов, или цитопатического эффекта, образования внутриклеточных включений-, образования «бляшек»; реакций гемадсорбции и гемагглютинации, «цветной» реакции Антигены бактерий. В структуре бактериальной клетки различают жгутиковые, соматические, капсульные и некоторые другие антигены. Жгутиковые, или Н-антигены, локализуются в их жгутиках и представляют собой эпитопы сократительного белка флагеллина. При нагревании флагеллин денатурирует и Н-антиген теряет свою специфичность. Фенол не действует на этот антиген. Соматический, или О-антиген, связан с клеточной стенкой бактерий. Его основу составляют липополисахариды. О-антиген термостабилен и не разрушается при длительном кипячении. Однако альдегиды (например, формалин) и спирты нарушают его структуру. Если проиммунизировать животное живыми бактериями, имеющими жгутики, то будут вырабатываться антитела одновременнок О и Н-антигенам. Введение животному прокипяченной культуры стимулирует биосинтез антител к соматическому антигену. Культура бактерий, обработанная фенолом, вызовет образование антител к жгутиковым антигенам. Капсульные, или К-антигены, встречаются у бактерий, образующих капсулу. Как правило, К-антигены состоят из кислых полисахаридов (уроновые кислоты). В то же время у бацилл сибирской язвы этот антиген построен из полипептидных цепей. По чувствительности к нагреванию различают три типа К-антигена: А, В и L. Наибольшая термостабильность характерна длягруппы А — они не денатурируют даже при длительном кипячении. Группа В выдерживает непродолжительное нагревание (около 1 ч) д 60 "С. ГруппаL быстро разрушается при этой температуре. Поэтому частичное удаление К-антигена возможно путем длительного кипячения бактериальной культуры. На поверхности возбудителя брюшного тифа и других энтеробактерий, которын обладают высокой вирулентностью, можно обнаружить особый вариант капсульного антигена. Он получил название антигена вирулентности, илиVi-антигена. Обнаружение этого антигена или специфичных к нему антител имеет большое диагностическое значение. Антигенными свойствами обладают также бактериальные белковые токсины, ферменты и некоторые другие вещества, которые секретируются бактериями в окружающую среду (например, туберкулин). Столбнячный, дифтерийный и ботулинический токсины относятся к числу сильных полноценных антигенов, поэтому их используют для получения молекулярных вакцин — анатоксинов. В антигенном составе некоторых бактерий выделяется группа антигенов с сильно выраженной иммуногенностью, чья биологическая активность играет ключевую роль в формировании патогенности возбудителя — связывание таких антигенов специфическими антителами практически полностью инактивирует вирулентные свойства микроорганизма и обеспечивает к нему иммунитет. Эти антигены получили название протективных. Антигены вирусов. В структуре вирусной частицыразличают ядерные (или коровые), капсидные (или оболочечные) и суперкапсидные антигены. На поверхности некоторых вирусных частиц встречаются особыеV-антигены — гемагглютинин и фермент нейраминидаза. Антигены вирусов различаются по происхождению. Часть из них вирусоспецифические, кодируются в нуклеиновой кислоте вируса. Другие, являющиеся компонентами клетки хозяина (углеводы, липиды), формируют суперкапсид вируса при его рождении путем почкования. Антигенный состав вириона зависит от строения самой вирусной частицы. В просторганизованных вирусах антигены ассоциированы с нуклеопротеидами. Эти вещества хорошо растворяютсяа воде и поэтому обозначаются какS-антигены (от лат. solutio — раствор). У сложноорганизованных вирусов часть антигенов связана с нуклеокапсидом, а другая находится во внешней оболочке, или суперкапсиде. Антигены многих вирусов отличаются высокой степенью изменчивости, что связано с постоянными мутациями в генетическом материале вирусов. Примером могут служить вирус гриппа, ВИЧ и др. Антигенна интервенци — этото процесс, протекающий поэтапно с определенной динамикой во времени. При этом на каждом зтапе появления и распространения в макроорганизме антиген сталкивается с с мощным противодействием развито сет разнообразных факторов иммунитета Особенности противовирусного иммунитета. Особенности иммунной защиты макроорганизма при вирусных инфекциях обусловлены двумя формами существования вируса: внеклеточной и внутриклеточной. Основными факторами, обеспечивающими противовирусный иммунитет, являются специфические антитела, Т-киллеры, естественные киллеры, интерферон и сывороточный ингибитор вирусных частиц. Специфические противовирусные антитела способны взаимодействовать только с внеклеточным вирусом, так как у них нет доступа внутрь живой клетки. Антитела нейтрализуют вирусные адгезины и нейраминидазы, препятствуют адсорбции вирусов на клетках-мишенях и их инфицированию. Они также связывают вирусные белки и нуклеиновые кислоты, образовавшиеся после разрушения зараженных вирусами клеток. Сформировавшиеся иммунные комплексы элиминируются путем иммунного фагоцитоза. Специфическое связывание антител с вирусными белками, экспрессированными на цитоплазматической мембране инфициронанных клеток, индуцирует естественные киллеры к АЗКЦТ (антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность). Клетки, инфицированные вирусом и приступившие к его репликации, экспрессируют вирусные белки на цитоплазматической мембране в составе молекул антигенов гистосовместимости — МНС I класс. Измененная структура МНС I класса этих антигенов гистосовместимости является маркером для Т-киллеров, которые распознают зараженные вирусом клетки и уничтожают их. Мощным противовирусным свойством обладает интерферон. Он не действует непосредственно на внутриклеточный вирус, а связывается с рецептором на мембране клетки и подавляет в ней все биосинтетические процессы. Сывороточные ингибиторы неспецифически связываются с вирусной частицей и нейтрализуют ее, препятствуя тем самым адсорбции вируса на клетках-мишенях. Напряженность противовирусного иммунитета оценивают преимущественно в серологических тестах по нарастанию титра специфических антител в парных сыворотках в процессе болезни. Определяют также концентрацию интерферона в сыворотки крови. Особенности антибактериального иммунитета. Иммунная реакция макроорганизма в ответ на бактериальную инфекцию в значительной степени определяется факторами патогенности микроба и в первую очередь его способностью к токсинообразованию. Различают иммунитет антибактериальный — против структурных компонентов бактериальной клетки и антитоксический — против белковых токсинов. Основными факторами антибактериальной защиты являются антитела и фагоциты. Антитела эффективно инактивируют биологически активные молекулы бактериальной клетки (токсины, ферменты агрессии и др.), маркируют их, запускают антителозависимый бактериолиз и иммунный фагоцитоз. Фагоциты непосредственно осуществляют фагоцитоз, в том числе иммунный, антителозависимый бактериолиз и внеклеточный киллинг патогена при помощи ион-радикалов и ферментов. Важная роль в борьбе с грамположительными микробами принадлежит лизоциму, а с грамотрицательным — комплементу (альтернативны путь активации), кроме того, существенное значение имеют белки острой фазы (С-реактивный и маннозосвязывающий протеин). Ряд бактерий, относящихся к факультативным внутриклеточным паразитам, отличается повышенной устойчивостью к действию комплемента, лизоциму и фагоцитозу (незавершенный фагоцитоз). К их числу относятся микобактерии, йерсинии, бруцеллы, сальмонеллы и некоторые другие. В такой ситуации макроорганизм вынужден переключать нагрузку на клеточное звено иммунитета, что ведет к аллергизации организма по механизму ГЗТ. Особое значение приобретают активированные макрофаги и естественные киллеры, осуществляющие АЗКЦТ (антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность), а также гамма дельта Т-лимфоциты. Напряженность специфического антибактериального иммунитета оценивают в серологических тестах по титру или динамике титра специфических антител, а также по состоянию клеточной иммунореактивности (например, по результатам кожно-аллергической пробы). Особенности антитоксического иммунитета. Антитоксический иммунитет формируется при заболеваниях, возбудители которых продуцируют и выделяют в окружающую среду экзотоксины (возбудители дифтерии, ботулизма, столбняка, газовой раневой инфекции, стафилококки, стрептококки). В процессе эволюции макроорганизм при заражении токсигенными микробами выработал способность обезвреживать не только микробные клетки, но и их токсины. Обезвреживание экзотоксинов обуславливается антитоксинами в результате реакции нейтрализации. Антитоксичские сыворотки (дифтерийная, столбнячная, ботулиновая, газовогангренозная) применяются с лечебной целью при токсикоинфекциях. При введении антитоксических сывороток создается искусственный пассивный приобретенный иммунитет. Ведущую роль в иммунитете к бактериям, образующим экзотоксин, играют антитоксины, нейтрализующие его и препятствующие повреждению тканей. Антитоксический иммунитет развивается при столбняке, ботулизме, дифтерии, газовой гангрене и др. Различают 3 способа действия антитоксина: 1. Прямая реакция антител с группами, ответственными за токсичность бактерийного продукта; 2. Взаимодействие антитоксина с рецепторными участками токсина, что препятствует фиксации токсина на специфических рецепторах клеток-мишеней; 3. Образование иммунных комплексов, их активный фагоцитоз и, следовательно, ограничение проникновения токсина в ткани. И тем не менее, напряженный антитоксический иммунитет сам по себе еще не обеспечивает полную защиту и не предотвращает размножение возбудителя в организме реконвалесцента или здорового носителя. Необходимо действие антибактериального иммунитета (копируем ответ выше!!!) Принципы и методы микробиологической диагностики инфекционных заболеваний. В бактериологии ( если развилась бактериальная инфекция) для обнаружения возбудителя в исследуемом материале используют бактериоскопический, бактериологический, биологический методы. Достоинствами бактериоскопического метода являются его простота, быстрота, экономичность. Однако он находит ограниченное применение, так как может быть использован лишь при наличии каких-либо морфологических или тинкториальных особенностей возбудителя и при достаточном его содержании в исследуемом материале. Как правило, этот метод является ориентировочным. Основной, самый точный метод диагностики бактериальных инфекций — бактериологический, который используют почти при всех заболеваниях, несмотря на такие его недостатки, как длительность исследования (от 4—5 дней до 2 месяцев), опасность (так как накапливается чистая культура возбудителя), сравнительная дороговизна. В том случае, если в исследуемом материале предполагается содержание возбудителя в достаточном количестве, посев материала производят на плотные питательные среды для получения изолированных колоний. При незначительном содержании микробов исследуемый материал прежде засевают на жидкие питательные среды — среды обогашения. Идентификацию выделенной чистой культуры производят по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, антигенным и токсигенным свойствам (в зависимости от вида возбудителя). Определение перечисленных свойств позволяет установить вид возбудителя. С целью эпидемиологического маркирования производят внутривидовую идентификацию выделенной культуры: определяют ее фаговар, биовар и др. Кроме того, и назначения рационального лечения, как правило, определяют чувствительность выделенной культуры к антибиотикам. При микробиологической диагностике заболеваний, вызванных условно-патогенными микробами, представителями нормальной микрофлоры, обязательным является определение количества возбудителей в исследуемом материале. Биологический метод не экономичен, не гуманен и поэтому находит ограниченное применение. В качестве экспериментальных животных используют белых мышей, морских свинок, кроликов, обезьян и других животных. Постановка диагноза инфекционного заболевания возможна также с помощью серологического метода, направленного на обнаружение либо специфических антител в сыворотке больного, либо специфических антигенов непосредственно в исследуемом материале. Антитела к возбудителю заболевания появляются, как правило, к концу первой недеи болезни. Невозможность обнаружить их в первые дни заболевания является самым большими недостатком метода, особенно в тех случаях, когда заболевание протекает остро. Кроме того, при многих болезнях требуется изучение антителообразования в динамике и выявление увеличения количества антител, что так же не разрешает быстро поставить диагноз Недостатком метода является и то, что он н позволяет точно идентифицировать возбуди теля и определить его антибиотикограмму. Но в то же время это совершенно безопасный, относительно недорогой метод, позволяющий за несколько часов поставить диагноз. В настоящее время при ряде болезней определяют не только количество иммуноглобулинов, но и их принадлежность к различным классам. В вирусологии методы лабораторной диагностики вирусных инфекций имеют свою специфику, учитывая особенности биологии вирусов. В вирусологии используются три метода лабораторной диагностики: • вирусоскопический, • вирусологический, • серологический. Вирусоскопический метод заключается в обнаружении вируса в исследуемом материале под микроскопом. Чаще всего используют электронный микроскоп, реже — люминесцентный. Световая микроскопия из-за ничтожно малых размеров вирусов практически не применяется. И лишь для обнаружения крупных вирусов, применяя методы «сверхокраски», можно использовать световой микроскоп. Кроме того, с помощью светового микроскопа можно выявить внутриклеточные включения, которые образуются в пораженных клетках при некоторых инфекциях. Вирусологический метод заключается в заражении исследуемым материалом чувствительной биологической модели (лабораторные животные, куриные эмбрионы или культуры клеток), индикации вируса и его последующей идентификации. При заражении лабораторных животных индикация вирусов производится, как правило, по клинической картине болезни, патолого-анатомическим изменениям ориентировочно и окончательно, например, с помощью реакции гемагглютинации. Эта же реакция позволяет выявить вирусы в курином эмбрионе, видимых изменений при вскрытии которого, как правило, не наблюдается. В культуре клеток наличие вируса определяют по цитопатическому действию (в том числе образованию внутриклеточных включений), гемадсорбции, феномену бляшкообразования, реакции гемагглютинации, отсутствию изменения окраски индикатора. Идентификация вируса осуществляется с помощью серологических реакций (РИГА, РТГА, PH, РСК, ИФА и др.). Вирусологический метод позволяет точно определить природу возбудителя, но он требует достаточного много времени (5—7 дней и более), значительных материальных затрат и небезопасен. Особенностью серологического метода в вирусологии является исследование парных сывороток. Первую сыворотку берут у больного в острый период в начале болезни, хранят при температуре +4... +8 °С, а вторую сыворотку берут через 10—14 дней. Сыворотки исследуют одномоментно. О болезни свидетельствует сероконверсия, т. е. нарастание титра антител во второй сыворотке по отношению к первой. Диагностической является сероконверсия в 4 раза и выше. Так как многие вирусные болезни протекают остро, этот вариант серологического метода обычно применяют для ретроспективной диагностики. Ведушим методом лабораторной диагностики вирусных инфекций является вирусологический. Ускоренная и экспресс-диагностика вирусных болезней производятся так же, как при бактериальных инфекциях. Идентификация микроорганизмов по антигенной структуре. Антигенная структура бактериальной клетки. Виды специфических микробных антигенов: родовая, групповая, видовая, типовая. Антиген – это биополимер органической природы, генетически чужеродный для макроорганизма, который при попадании в последний распознаётся его иммунной системой и вызывает иммунные реакции, направленные на его устранение. Антигены обладают рядом характерных свойств: антигенностью, специфичностью и иммуногенностью. Антигенность. Под антигенностью понимают потенциальную способность молекулы антигена активировать компоненты иммунной системы и специфически взаимодействовать с факторами иммунитета (антитела, клон эффекторных лимфоцитов). Иными словами, антиген должен выступать специфическим раздражителем по отношению к иммунокомпетентным клеткам. При этом взаимодействие компоненты иммунной системы происходит не со всей молекулой одновременно, а только с ее небольшим участком, который получил название «антигенная детерминанта», или «эпитоп». Чужеродность является обязательным условием для реализации антигенности. По этому критерию система приобретенного иммунитета дифференцирует потенциально опасные объекты биологического мира, синтезированные с чужеродной генетической матрицы. Понятие «чужеродность» относительное, так как имму-нокомпетентные клетки не способны напрямую анализировать чужеродный генетический код. Они воспринимают лишь опосредованную информацию, которая, как в зеркале, отражена в молекулярной структуре вещества. Иммуногенность — потенциальная способность антигена вызывать по отношению к себе в макроорганизме специфическую защитную реакцию. Степень иммуногенности зависит от ряда факторов, которые можно объединить в три группы: 1. Молекулярные особенности антигена; 2. Клиренс антигена в организме; 3. Реактивность макроорганизма. К первой группе факторов отнесены природа, химический состав, молекулярный вес, структура и некоторые другие характеристики. Иммуногенность в значительной степени зависит от природы антигена. Важна также оптическая изомерия аминокислот, составляющих молекулу белка. Большое значение имеет размер и молекулярная масса антигена. На степень иммуногенности также оказывает влияние пространственная структура антигена. Оказалась также существенной стерическая стабильность молекулы антигена. Еще одним важным условием иммуногенности является растворимость антигена. Вторая группа факторов связана с динамикой поступления антигена в организм и его выведения. Так, хорошо известна зависимость иммуногенности антигена от способа его введения. На иммунный ответ влияет количество поступающего антигена: чем его больше, тем более выражен иммунныйответ. Третья группа объединяет факторы, определяющие зависимость иммуногенности от состояния макроорганизма. В этой связи на первый план выступают наследственныефакторы. Специфичностью называют способность антигена индуцировать иммунный ответ к строго определенному эпитопу. Это свойство обусловлено особенностями формирования иммунного ответа — необходима комплементарность рецепторного аппарата иммунокомпетентных клеток к конкретной антигенной детерминанте. Поэтому специфичность антигена во многом определяется свойствами составляющих его эпитопов. Однако при этом следует учитывать условность границ эпитопов, их структурное разнообразие и гетерогенность клонов антигенреактивных лимфоцитовой специфичности. В результате этого организм на антигенное раздражение всегда отвечает поликлональными иммуннымответом. Антигены бактериальной клетки. В структуре бактериальной клетки различают жгутиковые, соматические, капсульные и некоторые другие антигены. Жгутиковые, или Н-антигены, локализуются в локомоторном аппарате бактерий — их жгутиках. Они представляют собой эпитопы сократительного белка флагеллина. При нагревании флагеллин денатурирует, и Н-антиген теряет свою специфичность. Фенол не действует на этот антиген. Соматический, или О-антиген, связан с клеточной стенкой бактерий. Его основу составляют ЛПС. О-антиген проявляет термостабильные свойства — он не разрушается при длительном кипячении. Однако соматический антиген подвержен действию альдегидов (например, формалина) и спиртов, которые нарушают его структуру. Капсулъные, или К-антигены, располагаются на поверхности клеточной стенки. Встречаются у бактерий, образующих капсулу. Как правило, К-антигены состоят из кислых полисахаридов (уроновые кислоты). В то же время у бациллы сибирской язвыэтотантигенпостроенизполипептидныхцепей.ПочувствительностикнагреваниюразличаюттритипаК-антигена:А,В,и L. Наибольшая термостабильность характерна для типа А, он не денатурирует даже при длительном кипячении. Тип В выдержи- вает непродолжительное нагревание (около 1 часа) до 60 "С. Тип L быстро разрушается при этой температуре. Поэтому частичное удаление К-антигена возможно путем длительного кипячения бактериальной культуры. На поверхности возбудителя брюшного тифа и других энтеробактерий, которые обладают высокой вирулентностью, можно обнаружить особый вариант капсульного антигена. Он получил название антигена вирулентности, или Vi-антигена. Обнаружение этого антигена или специфичных к нему антител имеет большое диагностическое значение. Антигенными свойствами обладают также бактериальные белковые токсины, ферменты и некоторые другие белки, которые секретируются бактериями в окружающую среду (например, туберкулин). При взаимодействии со специфическими антителами токсины, ферменты и другие биологически активные молекулы бактериального происхождения теряют свою активность. Столбнячный, дифтерийный и ботулинический токсины относятся к числу сильных полноценных антигенов, поэтому их используют для получения анатоксинов для вакцинации людей. В антигенном составе некоторых бактерий выделяется группа антигенов с сильно выраженной иммуногенностью, чья биологическая активность играет ключевую роль в формировании патогенности возбудителя. Связывание таких антигенов специфическими антителами практически полностью инактивирует вирулентные свойства микроорганизма и обеспечивает иммунитет к нему. Описываемые антигены получили название протективных. Впервые протективный антиген был обнаружен в гнойном отделяемом карбункула, вызванного бациллой сибирской язвы. Это вещество является субъединицей белкового токсина, которая ответственна за активацию других, собственно вирулентных субъединиц — так называемого отечного и летального факторов. Аллергический метод диагностики инфекционных заболеваний. Фазы, защитная и патогенетическая роль инфекционной аллергии (ГЧЗТ). Диагностические препараты для постановки кожно- аллергических проб (корпускулярные и растворимые). Аллергические диагностические пробы применяют также при диагностике некоторых инфекционных и паразитарных заболеваний, сопровождающихся аллергической сенсибилизацией организма. При диагностике туберкулеза применяют скарификационную пробу Пирке (При постановке пробы Пирке на очищенную 70% спиртом кожу предплечья наносится капля раствора PPD и на ее месте делается насечка-скарификация кожи оспенным перышком, после чего капле дают высохнуть. Реакцию следует считать положительной при наличии инфильтрата размером не менее 5 мм в направлении, поперечном к кожной насечке) и внутрикожную пробу Манту. В качестве аллергена применяют разведения сухого очищенного туберкулина. При диагностике бруцеллеза(При помощи однограммового шприца 0,1 мл бруцеллина вводят в кожу предплечья. Результаты пробы читают через 24 часа после ее постановки. У больных бруцеллёзом образуется гиперемия, отек мягких тканей, а иногда лимфангит. Положительной проба считается при гиперемии кожи размером 3,5x3 см. Прогноз. В последнее время реже стали встречаться тяжелые формы заболевания, чаше наступает выздоровление. Летальность при бруцеллёзе раньше составляла 1 — 6%, сейчас почти отсутствует. Прогноз в отношении трудоспособности может быть неблагоприятным.) применяют внутрикожную пробу Бюрне. Аллергеном служит раствор бруцеллина, содержащий антигенный набор трех различных возбудителей бруцеллеза. При диагностике эхинококкоза применяют внутри-кожную пробу Касони. Аллергеном служит вытяжка из содержимого пузыря эхинококка. При диагностике туляремии применяют внутрикожную пробу с тулярином — убитой нагреванием взвесью бактерий. При диагностике дизентерии применяют пробу с дизентерином Цуверкалова. Гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ). ГЗТ развивается ко всем видам возбудителей инфекционных заболеваний независимо от их патогенносги. Живые возбудители вызывают более выраженную ГЗТ. ГЗТ характерна прежде всего для хронических инфекций и инфекций с внутриклеточным паразитированием возбудителя. Особое значение она имеет при туберкулезе, бруцеллезе, лепре, сальмонеллезе, вирусных инфекциях, токсоплазмозе, листериозе, гистоплазмозе, лейшманиозе, кандидамикозе и гельминтозе. ГЗТ вызывают преимущественно белки и гликопротеины. Клеточная стенка микроба обладает более сильной сенсибилизирующей активностью по сравнению с внутриклеточными компонентами. Основным методом диагностики ГЗТ invivo в клинике являются внутрикожные пробы. Аллерген в объеме 0,1 мл вводят строго внут- рикожно. Реакция начинается не ранее чем через 6 ч после инъекции и достигает максимума через 24-48 ч, сопровождаясь гиперемией, уплотнением, а иногда кровоизлияниями и некрозом кожи. Большую роль в механизмах повреждения ткани играют нарушения кровообращения и проницаемости сосудистойстенки. В редких случаях при высокой степени ГЗТ и поступлении большого количества антигена в общий кровоток возникает общая реакция, так называемый туберкулиновый шок. Реакция появляется через несколько часов и продолжается не более суток, сопровождается частым поверхностным дыханием, головной болью, ознобом. Появляются тошнота, рвота, иногда крапивница. В печени, селезенке, надпочечниках, кишечнике возникают застой и кровоизлияния, в некоторых случаях наблюдается поражение суставов. Изменение температуры зависит от тяжести шока. При шоке средней тяжести температура повышается на 2-3 °С и остается на таком уровне в течение нескольких часов. В некоторых случаях температура сначала повышается, а затем снижается. При тяжелых шоках происходит только снижение температуры (на несколько градусов), появляются осложнения со стороны почек и центральной нервнойсистемы. При местных реакциях ГЗТ моноциты крови и макрофаги местного происхождения составляют 10% от общего числа клеток инфильтрата. Макрофаги инактивируют, перерабатывают корпускулярный антиген и представляют его клеткам-эффекторам. Макрофаги являются основными клетками-мишенями для лимфокинов и сами способны продуцировать медиаторы. Кроме лимфоцитов и макрофагов, в состав клеточного инфильтрата входят базофилы, эози- нофилы и нейтрофилы. Для лабораторной диагностики ГЗТ очень часто используют клеточные реакции invitro, в частности реакцию бласттрансфор- мации лимфоцитов и реакцию торможения миграции лейкоцитов. Реакции возникают под влиянием специфических антигенов (аллергенов), которые могут иметь не только растворимую, но и корпускулярную форму. Бласт трансформацию лимфоцитов вызывают митогенные факторы, выделяющиеся из эффекторных лимфоцитов при действии аллергена. Реакция носит каскадный характер и зависит от последовательного действия аллергена и митогенных факторов. Следует иметь в виду, что многие микробные продукты (эндотоксины, ли- заты микробов) могут быть естественными митогенами для лимфоцитов и вызывают реакцию бласттрансформации клеток без предшествующей сенсибилизации. Для диагностики ГЗТ в клинике часто используют реакцию торможения миграции лейкоцитов, в эксперименте — реакцию торможения миграции макрофагов. В качестве клеточных реакций, характеризующих ГЗТ, используют также реакцию хемотаксиса различных клеток (фибробластов, нейтрофилов, эозинофилов) и цитотоксические реакции. Гипосенсибилизация специфическим антигеном на фоне развившейся ГЗТ недостаточно эффективна и вызывает лишь вре- менное ослабление ГЗТ. Снижение интенсивности ГЗТ связано с подавлением клонов Т-клеток, принимающих участие в формировании или проявлениях ГЗТ. ГЗТ значительно труднее поддается супрессии по сравнению с немедленной аллергией. Несмотря на длинный список биологи- ческих препаратов и химических веществ, подавляющих в той или иной мере развитие ГЗТ, достаточно эффективных средств суп- рессии этого вида чувствительности не существует. Специфичность ГЗТ и специфичность ПЧНТ различаются. Т-клет- ки при ГЗТ и В-клетки при образовании антител распознают не одни и те же антигенные детерминанты. Предполагается, что специфичность ГЗТ шире, чем специфичность процесса образованияантител. Основными клетками-регуляторами ГЗТ, как и клеточного иммунитета, являются Тх1 (рис. 14). Генетическая регуляция ГЗТ может осуществляться на уровне отдельных субпопуляций имму- нокомпетентных клеток (Т-эффекторов, Е-хелперов, клеток па- мяти, макрофагов). В связи с этим генетический дефект развития ГЗТ может проявляться на любой стадии иммунного ответа (ста- дии антигенного распознавания, стадии образования регулятор- ных факторов и их действия на клетки-мишени, эффекторной ста- дии и др.). Конкретным материалом, обеспечивающим генетическую рестрикцию клеточного взаимодействия при ГЗТ, являются продукты генов гистосовместимости I и II классов. 93. Стафилококки. Таксономия. Свойства. Характеристика токсинов, ферментов и факторов персистенции. Вызываемые заболевания, источники инфекции, пути передачи, патогенез, особенности иммунитета. Принципы и методы лабораторной диагностики. Препараты специфического лечения ипрофилактики. Таксономия: относятся к отделу Firmicutes, семейству Мicrococcacae, роду Staphylococcus. Примеры видов: S.aureus, S.epidermidis и S.saprophyticus. Морфологические свойства: Все виды стафилококков представляют собой округлые клетки. В мазке располагаются не- симметричными гроздьями. Клеточная стенка содержит большое количество пептидогликана, связанных с ним тейхоевых кислот, протеин А. Грамположительны. Спор не образуют, жгутиков не имеют. У некоторых штаммов можно обнаружить капсулу. Могутобразовывать L-формы. Культуральные свойства: Стафилококки — факультативные анаэробы. Хорошо растут на простых средах. На плотных средах образуют гладкие, выпуклые колонии с различным пигментом, не имеющим таксономического значения. Могут расти на агаре с высоким содержанием NaCl. Обладают сахаролитическими и протеолитическими ферментами. Стафилококки могут вырабатывать гемолизины, фибринолизин, фосфатазу, лактамазу, бактериоцины, энтеротоксины, коагулазу. Стафилококки пластичны, быстро приобретают устойчивость к антибактериальным препаратам. Существенную роль в этом играют плазмиды, передающиеся с помощью трансдуцирующих фагов от одной клетки к другой. R-плазмиды детерминируют устойчивость к одному или нескольким антибиотикам, за счет продукции в-лактамазы. Антигенная структура. Около 30 антигенов, представляющих собой белки, полисахариды и тейхоевые кислоты. В составе клеточной стенки стафилококка содержится протеин А, который может прочно связываться с Fc-фрагментом молекулы иммуноглобулина, при этом Fab-фрагмент остается свободным и может соединяться со специфическим антигеном. Чувствительность к бактериофагам (фаготип) обусловлена поверхностными рецепторами. Многие штаммы стафилококков явля- ются лизогенными(образование некоторых токсинов происходит с участием профага). ТОКСИНЫ А) Экзотоксины: 1) Мембранотоксины а) Гемолизины (только Staph. aureus) - -гемолизин – действуют на эритроциты, нервные клетки, кардиомиоциты - -токсин - угнетение хемотаксиса - -токсин - на эритроциты, лейкоциты, угнетение хемотаксиса - -токсин – действует на любые клетки человека токсический шок - -гемолизин б) Лейкоцидин – действует на лейкоциты, нервные клетки 2) Эксфолиативный токсин - вызывает поражение гранулярных клеток кожи и ожог (у новорожденных) 3) Токсин 1 или токсин токсического шока - обладает опосредованной вирулентностью и вызывает токсический шок. 4) Энтеротоксины. - действуют на слизистую кишечника. Б) Помимо экзотоксинов факторами патогенности являются эндотоксины, характерные для Гр (+) микробов. ФЕРМЕНТЫ 1) Плазмокоагулаза (только Staph. aureus) - фактор агрессии, так как обеспечивает микроорганизму устойчивость к фагоцитозу. Фермент инактивирует катионные белки и блокирует лизосомальные ферменты. 2) Лецитиназа (только Staph. aureus). Разрушает лецитин мембран, угнетает полиморфно-ядерные лейкоциты. 3) Гиалуронидаза. Обеспечивает распространение микробов в тканях. 4) ДНКаза 5) Муромидаза 6) Протеаза 7) Фосфатаза III. Кроме токсинов и ферментов фактором патогенности (агрессии) является белок А, который способен связывать иммуноглобулины G. Факторы патогенности: Условно – патогенные. Микрокапсула защищает от фагоцитоза, способствует адгезии микробов; компоненты клеточной стенки – стимулируют развитие воспалительных процессов. Ферменты агрессии: каталаза – защищает бактерии от действия фагоцитов, в-лактамаза – разрушает молекулы антибиотиков. Резистентность. Устойчивость в окружающей среде и чувствительность к дезинфектантам обычная. Патогенез. Источником инфекции стафилококков - человек и некоторые виды животных (больные или носители). Механизмы передачи — респираторный, контактно-бытовой, алиментарный. Иммунитет: Постинфекционный – клеточно-гуморальный, нестойкий, ненажряженный. Клиника. Около 120 клинических форм проявления, которые имеют местный, системный или генерализованный характер. К ним относятся гнойно-воспалительные болезни кожи и мягких тканей (фурункулы, абсцессы), поражения глаз, уха, носоглотки, урогенитального тракта, пищеварительной системы (интоксикации). Микробиологическая диагностика. Материал для исследования – гной, кровь, моча, мокрота, испражнения. Бактериоскопический метод: из исследуемого материала (кроме крови) готовят мазки, окрашивают по Граму. Наличие грамм «+» гроздевидных кокков, располагающихся в виде скоплений. Бактериологический метод: Материал засевают петлей на чашки с кровяным и желточно-солевым агаром для получения изолированных колоний. Посевы инкубируют при 37С в течении суток. На следующий день исследуют выросшие колонии на обеих средах. На кровяном агаре отмечают наличие или отсутствие гемолиза. На ЖСА S. aureus образует золотистые круглые выпуклые непрозрачные колонии. Вокруг колоний стафилококков, обладающих лецитиназной активностью, образуются зоны помутнения с перламутровым оттенком. Для окончательного установления вида стафилококка 2—3 колонии пересевают в пробирки со скошенным питательным агаром для получения чистых культур с последующим определением их дифференциальных признаков. S.aureus – «+»: образование плазмокоагулазы, летициназы. Ферментация:глк, миннита, образованиеа-токсина. Для установления источника госпитальной инфекции выделяют чистые культуры стафилококка от больных и бактерионо- сителей, после чего проводят их фаготипирование с помощью набора типовых стафилофагов. Фаги разводят до титра, указанного на этикетке. Каждую из исследуемых культур засевают на питательный агар в чашку Петри газоном, высушивают, а затем петлей каплю соответствующего фага наносят на квадраты (по числу фагов, входящих в набор), предварительно размеченные карандашом на дне чашки Петри. Посевы инкубируют при 37 °С. Результаты оценивают на следующий день по наличию лизиса культуры. Серологический метод: в случаях хронической инфекции, определяют титр анти-а-токсина в сыворотке крови больных. Определяют титр АТ к риботейхоевой кислоте( компонент клеточной стенки). Лечение и профилактика. Антибиотики широкого спектра действия (пенициллины, устойчивые к в-лактамазе). В случае тяжелых стафилококковых инфекций, не поддающихся лечению антибиотиками, может быть использована антитоксическая противостафилококковая плазма или иммуноглобулин, иммунизированный адсорбированным стафилококковым анатоксином. Выявление, лечение больных; проведение планового обследования медперсонала, вакцинация стафилококковым анатоксином. Стафилококковый анатоксин: получают из нативного анатоксина путем осаждения трихлоруксусной кислотой и адсорбцией на гидрате оксида алюминия. Стафилококковая вакцина: взвесь коагулазоположительных стафилококков, инактивированных нагреванием. Применяют для лечения длительно текущих заболеваний. Иммуноглобулин человеческий противостафилококковый: гамма-глобулиновая фракция сыворотки крови, содержит стафилококковый анатоксин. Готовят из человеч. крови, с высоким содержанием антител. Применяется для специфического лечения. 94.. Стрептококки. Таксономия. Свойства и классификация по антигенной структуре. Характеристика токсинов и ферментов. Отличия пневмококков от других стрептококков. Вызываемые заболевания, иммунитет, принципы и методы лабораторнойдиагностики. |