Лаб. практикум. Практикум по биологической химии методические указания к проведению лабораторных работ по биологической химии для студентов второго курса
 Скачать 1.02 Mb.
|
Количественное определение содержания билирубина и его фракций в сыворотке кровиВ крови билирубин содержится в небольших, но постоянных количествах: 8-20 мкмоль/л. В сыворотке крови содержатся две формы билирубина – связанный, или билирубинглюкуронид, хорошо растворимый в воде, и несвязанный, или свободный билирубин, плохо растворимый в воде. Свободная форма его циркулирует в крови в виде комплекса с альбумином. У здоровых людей 75% общего билирубина сыворотки крови составляет свободный билирубин. В клинической практике чаще всего приходится встречаться с гипербилирубинемиями различного происхождения. Повышение уровня свободного билирубина в крови встречается при гемолитических желтухах, некоторых анемиях, желтухе новорожденных и др. Желтухи, связанные с затруднением оттока желчи (механические), сопровождаются повышением уровня глюкуронида билирубина («прямой»). При паренхиматозных желтухах наблюдается также повышение содержания глюкуронида билирубина, с преобладанием однако моноглюкуронида. Принцип метода. При добавлении к сыворотке крови кофеинового реактива свободный билирубин переходит в растворимое диссоциированное состояние, благодаря чему он вызывает розово-фиолетовое окрашивание раствора со смесью диазореактивов. По интенсивности окрашивания последнего фотометрически определяют концентрацию общего билирубина. По разнице между содержанием общего и связанного билирубина находят количество свободного. Исследуемый материал и реактивы 1. Сыворотка крови. 2. Диазореактив I. 3. Диазореактив II. 4. Кофеиновый реактив. 5. Физиологический раствор хлорида натрия. Ход работы Перед работой готовят диазосмесь: смешивают 10 мл диазореактива I и 0,3 мл диазореактива II. В три пробирки (1 – для определения уровня общего билирубина, 2 – связанного билирубина и 3 – контрольной пробы на цвет сыворотки) вводят реактивы согласно схеме:
При определении уровня общего билирубина пробу оставляют при комнатной температуре на 20 мин для развития окраски. В дальнейшем окраска пробы не изменяется. Для установления содержания коньюгированного (связанного) билирубина колориметрирование осуществляют спустя 5–10 мин после добавления диазосмеси, так как при длительном стоянии пробы в реакцию вступает свободный билирубин. Колориметрируют опытные пробы против контроля при зеленом светофильтре (500–560 нм) в кювете шириной 5мм. Оценку результатов производят по калибровочному графику. В норме концентрация общего билирубина в плазме (сыворотке) крови составляет 8,55-20,52 мкмоль/л, 75% его количества приходится на долю свободного билирубина. Калибровочный график для определения билирубина крови  Указания к оформлению лабораторной работы В таблицу показателей норм основных клинико-биохимических исследований впишите нормальные значения концентрации билирубина в крови. В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, полученные результаты – концентрации общего и конъюгированного билирубина и сделайте выводы о причинах возможного отклонения этих показателей от нормы в исследуемом материале. Контрольные вопросы
|