Лаб. практикум. Практикум по биологической химии методические указания к проведению лабораторных работ по биологической химии для студентов второго курса
 Скачать 1.02 Mb.
|
Лабораторная работа №23Определение мочевины в крови по реакции с диацетилмонооксимом (набором реагентов)Одним из главных продуктов азотистого обмена в организме является мочевина. Синтезируется она в печени, оттуда поступает в кровь и выделяется с мочой. Мочевина составляет около 50% остаточного азота крови. В норме в сыворотке крови содержание мочевины колеблется от 2,5-8,3 ммоль/л. У детей от 1 года до 14 лет – 1,63-6,64 ммоль/л. С мочой взрослого человека за сутки выводится 20-35г, а в возрасте от 1 года до 14 лет – 4,0-16,0г мочевины. В клинической лабораторной практике определение мочевины необходимо для оценки белкового обмена; своевременной диагностики и лечения врожденных нарушений орнитинового цикла реакций синтеза мочевины; помощи в оценке работы выделительной функции почек, степени почечной и печеночной недостаточности. Повышение концентрации мочевины в крови (азотемия) отмечается при заболеваниях почек (нарушение их выделительной функции), при усиленном распаде белков, избыточном белковом питании, в случае обезвоживания организма (относительная азотемия), при отравлении фосфором. Пониженное содержание мочевины в крови и выделение её с мочой наблюдается при заболеваниях печени (дистрофия печени, цирроз, паренхиматозная желтуха), что связано с нарушением её мочевинообразовательной функции; при нефрите, ацидозе, уремии. Принцип метода. В кислой среде в присутсвии тисемикарбазида и ионов трехвалентного железа мочевина образует с диацетилмонооксимом комплексное соединение красного цвета, оптическая плотность которого при 510нм пропорциональна концентрации мочевины. Исследуемый материал и реактивы 1. Сыворотка (плазма) крови без гемолиза. 2. Вата. 3. Спирт. 4. Скарификатор. 5. Реакционная смесь сухая (4 пробирки). 6. Раствор соли железа трехвалентного (5 ммоль/л). 7. Калибровочный раствор мочевины (8 ммоль/л). 8. Кислота серная, концентрированная (96%), х.ч. 9. Кислота трихлоруксусная, ч Ход работы А. Приготовление раствора серной кислоты. В мерную колбу вместимостью 500 мл помещают около 300 мл дистиллированной воды и при постоянном помешивании добавляют 50 мл серной кислоты. После охлаждения доливают водой до метки. Раствор устойчив. Б. Приготовление раствора реакционной смеси. В мерную колбу вместимостью 100 мл количественно переносят содержимое пробирки сухой реакционной смеси и растворяют его примерно в 60 мл дистиллированной воды при нагревании 40-500С. После охлаждения добавляют 1 мл раствора соли железа трехвалентного и доливают водой до метки. Раствор стабилен при комнатной температуре в течение 2 недель. Наличие небольшого количества нерастворимого осадка не мешает определению. В. Приготовление рабочего раствора. Приготовляют смешением 1 доли раствора реакционной смеси с 1 долей раствора серной кислоты. Ежедневно готовят свежий рабочий раствор. Г. Приготовление раствора ТХУ 50 г/л (для депротеинирования). 10г ТХУ растворяют в 200 мл дистиллированной воды. Раствор устойчив. Д. Определение концентрации мочевины в сыворотке крови (без депротеинирования). Образцы: сыворотка (плазма) крови. В пробирки внести реактивы по следующей схеме:
Содержимое пробирок тщательно перемешивают, отверстия закрывают алюминиевой фольгой и пробирки помещают точно на 10 минут в кипящую водяную баню. Затем пробирки быстро охлаждают в потоке холодной воды и измеряют оптическую плотность при 510нм (490-540нм, зеленый светофильтр) против холостой пробы в кювете с толщиной поглощающего слоя 1,0 или 0,5см. Параллельно обрабатывают калибровочный раствор. Окраска устойчива в течение 15 минут. Е. Определение концентрации мочевины в сыворотке крови (с депротеинированием). Образцы: сыворотка (плазма) крови липимическая или гемолизированная, цельная кровь. В пробирки внести реактивы по следующей схеме:
Далее проводят определение, как при анализе без депротеинирования. Содержания мочевины производят по формуле:  ,где: С – содержание мочевины в опытной пробе, ммоль/л; D0– оптическая плотность опытной пробы; DК – оптическая плотность калибровочной пробы; 8,0 – содержание мочевины в калибровочном раствора, ммоль/л. Примечания: при содержании мочевины в крови свыше 17 ммоль/л пробу следует развести дистиллированной водой и анализ провести повторно. Результат умножить на разведение. При использовании кюветы другого объема расход реактивов может быть пропорционально изменен при сохранении соотношения проба/рабочий раствор 1:100. Указания к оформлению лабораторной работы В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, полученные результаты (концентрацию мочевины в сыворотке крови, ммоль/л) и сделайте выводы о состоянии белкового обмена, работе печени и почек исследуемого. Контрольные вопросы
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||