Лаб. практикум. Практикум по биологической химии методические указания к проведению лабораторных работ по биологической химии для студентов второго курса
 Скачать 1.02 Mb.
|
ВитаминыВитамины – жизненно необходимые низкомолекулярные органические вещества. Они требуются организму в очень малых количествах, поступают с пищей, частично синтезируются микрофлорой кишечника или клетками. Все витамины делят на жирорастворимые и водорастворимые. Активно вмешиваясь в обмен веществ в качестве коферментов в составе сложных ферментов, витамины могут оказывать положительный эффект при различных нарушениях метаболических процессов. Дефицит любого витамина ведет к появлению специфических нарушений реакций обмена с характерными клиническими проявлениями. Знание коферментных функций витаминов в организме позволяет понять механизмы развития и профилактики гипо- и авитаминозов и использовать витамины с профилактической и лечебной целью. Качественные реакции на витамины позволяют обнаружить их наличие в лекарственных препаратах, продуктах питания, в лекарственных растениях. Принципы, положенные в основу качественных реакций на витамины, используются и при разработке количественного их определения. Определение концентрации витаминов в различных органах и тканях имеет практическое значение при установлении гипервитаминозов. Лабораторная работа №27Качественные реакции на витаминыЖирорастворимые витамины
Ретинол – циклический непредельный спирт, состоящий из шестичленного кольца и боковой цепочки, состоящее из двух остатков изопрена и первичной спиртовой группы в конце. Ретинолы включают витамины группы А (антиксерофтальмические): А1 получен из печени морских рыб, А2 – из печени пресноводных рыб, а также их каротина, содержащегося в овощах и фруктах – предшественника витамина А2. Витамин А входит в состав зрительного пурпура – родопсина, накапливается в печени. Принцип метода. Реакция основана на водоотнимающем действии хлорида сурьмы (III). При добавлении к ретинолу раствора хлорида сурьмы (III) образуется продукт присоединения, окрашенный в интенсивно синий цвет с максимумом поглощения света в области 620 нм. Эту реакцию используют для количественного определения ретинола спектрофотометрическим или фотоколориметрическим методом. Исследуемый материал и реактивы 1. Рыбий жир или масляный раствор ретинола в хлороформе (0,05%). 2. Раствор хлорида сурьмы в хлороформе (33%). Ход работы В сухую пробирку (или на часовое стекло) вносят 1 каплю свежего рыбьего жира или 0,05% масляного раствора ретинола и добавляют 4-5 капель 33% хлороформного раствора хлорида сурьмы (III). При смешивании содержимое пробирки окрашивается в синий цвет.
Кальциферолы или витамины D (антирахитические) существуют в виде нескольких изомеров. Различные кальциферолы отличаются друг от друга биологической активностью. Наиболее распространены эргокальциферол (витамин D2) и холекальциферол (витамин D3). В организме человека и животных образуется витамин D3 из 7-дегидрохолестерола после воздействия ультрафиолетовых лучей. Принцип метода. Витамин D, содержащийся в рыбьем жире, при взаимодействии с раствором брома в хлороформе приобретает зеленовато-голубую окраску. Исследуемый материал и реактивы 1. Рыбий жир 2. Раствор брома в хлороформе (1:60). Ход работы В сухую пробирку (или на часовое стекло) вносят 2-3 капли рыбьего жира и 2-4 капли раствора брома в хлороформе. Перемешивают. В присутствии витамина D постепенно появляется зеленовато-голубое окрашивание.
Витамины К (антигеморрагические) относятся к группе хинонов. В их основе лежит кольцо 1,4-нафтохинона с боковыми цепями – изопреноидными звеньями. Известны два природных витамина: К1 – филлохинон, желтоватая маслянистая жидкость и К2 – менахинон, представляет собой желтые кристаллы. У здорового человека витамин К постоянно синтезируется микрофлорой кишечника. Витамин К входит в состав простетической группы фермента, участвующего в биосинтезе протромбина, необходимого компонента в процессе свертывания крови. В лечебной практике широкое применение получил водорастворимый, синтетический препарат витамина К – «викасол». Принцип метода. Викасол в присутствии цистеина в щелочной среде окрашивается в лимонно-желтый цвет, переходящий при стоянии в оранжевый. Исследуемый материал и реактивы 1. Раствор викасола (0,05%). 2. Раствор цистеина (0,025%). 3. Раствор гидроксида натрия (10%). Ход работы На сухое часовое стекло наносят 5 капель 0,05% раствора викасола, добавляют 5 капель 0,025% раствора цистеина и 1 каплю 10% раствора гидроксида натрия. Появляется лимонно-желтое окрашивание.
К витамину Е (антистерильный) относятся производные токола и токотриенола. В их структуре имеется ароматический спирт токол и боковая изопреноидная цепь. Известно несклько изомеров витамина Е, которые отличаются расположением метильных групп в бензольном кольце. Наибольшей биологической активностью обладает α-токоферол. Полагают, что некоторые производные витамина Е наряду с убихиноном участвуют в окислительно-восстановительных реакциях, связанных с окислительным фосфорилированием. Запасы витамина Е могут откладываться в жировой ткани человека. Принцип метода. Характерным свойством токоферолов является способность их к окислению за счет фенольного гидроксила. Химическая структура продуктов окисления и их окраска зависят от характера окислителя. При действии слабых окислителей – хлорида железа (III), сульфата церия (IV) – образуется n-токоферилхинон желтого цвета. При действии на токоферол сильных окислителей, например, концентрированной азотной кислоты, образуется о-токоферилхинон красного цвета. Исследуемый материал и реактивы 1. Раствор токоферола спиртовой (0,1%). 2. Азотная кислота (концентрированная). Ход работы В сухую пробирку вносят 5 капель 0,1% спиртового раствора α-токоферола и добавляют 10 капель концентрированной азотной кислоты. Встряхивают пробирку. Наблюдают за развитием красной окраски. Водорастворимые витамины
Витамин В1 (антиневритный) состоит из пиримидинового и тиазолового колец. Витамин В1 получил название тиамина поскольку содержит серу и азот. Коферментная форма витамина – тиаминпирофосфат (ТПФ) входит в состав пируватдегидрогеназного и α-кетоглутаратдегидрогеназного комплексов, катализирующих окислительное декарбоксилирование пировиноградной и других кетокислот, а также является коферментом транскетолазы пентозо-фосфатного пути (ПФП). Принцип метода. В щелочной среде тиамин с диазореактивом образует сложное комплексное соединение оранжевого цвета. Исследуемый материал и реактивы 1. Раствор тиамина или поливитаминов. 2. Диазореактив (5 капель 1% раствора сульфониловой кислоты и 5 капель 5% раствора нитрита натрия). 3. Раствор бикарбоната натрия (10%). Ход работы К диазореактиву, состоящему из 5 капель 1% раствора сульфаниловой кислоты и 5 капель 5% раствора нитрата натрия, добавляют 1–2 капли 5% раствора тиамина (или поливитаминов) и затем по стенке, наклонив пробирку, осторожно добавляют 5–7 капель 10% раствора бикарбоната натрия. На границе двух жидкостей появляется кольцо оранжевого цвета.
Витамин В2 (антисеборейный) – рибофлавин – состоит из изоаллоксазинового ядра и спирта рибитола. Коферментной формой витамина являются: флавинмононуклеотид (ФМН) и флавинадениндинуклеотид (ФАД), входящие в состав флавиновых ферментов и принимающие участие в биологическом окислении. Небольшое количество витамина В2 образуется в кишечнике человека под действием микрофлоры. Принцип метода. Метод основан на способности рибофлавина легко восстанавливаться, при этом раствор рибофлавина, обладающий желтой окраской, приобретает сначала розовый цвет за счет образования промежуточного продукта (родофлавин), а затем обесцвечивается, так как восстановленная форма рибофлавина бесцветна. Исследуемый материал и реактивы 1. Раствор рибофлавина (0,025%) или поливитаминов. 2. Соляная кислота (концентрированная). 3. Цинк металлический (зерна). Ход работы В пробирку наливают 10 капель раствора витамина В2 (или поливитаминов), добавляют 5 капель концентрированной соляной кислоты и опускают зернышко металлического цинка. Начинается выделение пузырьков водорода, жидкость постепенно розовеет, затем обесцвечивается.
Витамин В6 (антидерматитный) носит название пиридоксина, этим термином обычно обозначается группа веществ, обладающих активностью витамина В6. К ним принадлежат пиридоксол, пиридоксаль, пиридоксамин, являющиеся производными пиридина. Кофермнтная форма витамина В6 – фосфопиридоксаль (ФП) – участвует в ферментативных реакциях белкового обмена: трансаминирования, декарбоксилирования, десульфирования аминокислот и др. небольшое количество этого витамина синтезируется в организме человека кишечной микрофлорой. Принцип метода. Витамин В6 при взаимодействии с раствором хлорного железа образует комплексную соль типа фенолята железа красного цвета. Исследуемый материал и реактивы 1. Раствор витамина В6 (1%) или поливитаминов. 2. Раствор хлорного железа (III) (1%). Ход работы К 5 каплям 1% раствора витамина В6 приливают равное количество 1% раствора хлорного железа и перемешивают. Наблюдают за появлением красного окрашивания.
Фолиевая кислота была выделена из зеленых листьев растений, в связи с чем получила свое название (от лат. Folium – лист). Она состоит из трех структурных единиц: остатка птеридина (конденсированного бицикла, состоящего из пиримидинового и пиразинового колец), парааминобензойной кислоты (ПАБК) и глутаминовой кислоты. Фолиевая кислота ограничено растворима в воде. Коферментная форма витамина Вс – тетрагидрофолиевая кислота (ТГФК) – участвует в переносе одноуглеродных фрагментов (формильных, метенильных, метиленовых, метильных и др.). Входит в составферментов, участвующих в синтезе пуринов и пиримидинов, некоторых аминокислот (глицина из серина, метионина из гомоцистеина). Поэтому фолиевая кислота (фолацин) играет исключительную роль в биосинтезе нуклеиновых кислот и процессах деления клеток. Синтезируется микрофлорой кишечника человека и животных. Принцип метода. Наличие в птеридиновой части молекулы фолиевой кислоты гидроксильных групп и третичных атомов азота позволяет получать нерастворимые внутримолекулярные соли с катионами тяжелых металлов. При этом образуются окрашенные осадки: с ацетатом свинца – лимонно-желтый, сульфатом меди (II) – зеленый, нитратом серебра – желто-оранжевый, нитратом кобальта – темно желтый, хлоридом железа (III) – красно-желтый. Исследуемый материал и реактивы 1. Фолиевая кислота. 2. Раствор гидроксида натрия (0,1н). 3. Растворы металлов (1%): ацетата свинца, сульфата меди (II), нитрата серебра, нитрата кобальта, хлорида железа (III). Ход работы 0,01 г фолиевой кислоты взбалтывают с 1,0-1,5 мл 0,1н раствора гидроксида натрия (важно не допустить избытка щелочи во избежание образования гидроксидов металлов) в течение 2-3 минут и фильтруют. Затем по 1-2 капли фильтрата переносят на часовое или предметное стекло и прибавляют 1 каплю 1% раствора вышеуказанных солей металлов. Наблюдают за появлением окраски.
Витамин РР (антипеллагрический) – производный пиридинового ядра. Антипеллагрической активностью, помимо никотиновой кислоты, обладает и ее амид. Коферментные формы витамина РР – никатинамидадениндинуклеотид (НАД) и никатинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ) – входят в состав дегидрогеназ, участвующих в окислительно-восстановительных реакциях (переносят протоны и электроны от окисляемых субстратов). Принцип метода. Витамин РР при нагревании с раствором ацетата меди образует плохо растворимый синий осадок медной соли никотиновой кислоты. Исследуемый материал и реактивы 1. Раствор витамина РР (3%) или поливитаминов. 2. Раствор ацетата меди (5%). Ход работы Наливают в пробирку 20 капель 3% раствора витамина РР (перед определением раствор обязательно следует взболтать) и нагревают до кипения; при этом мутный раствор становится прозрачным. Взболтав 5% раствор ацетата меди, приливают 20 капель его к нагретому раствору витамина РР. Содержимое пробирки доводят до кипения и сразу охлаждают под струей холодной воды. На дне пробирки выпадает синий осадок медной соли никотиновой кислоты.
Витамин С (антискорбутный, антицинготный) является ненасыщенным соединением, кислый характер её обусловлен наличием двух енольных гидроксильных групп, способных к диссоциации с отщеплением водородных ионов. Аскорбиновая кислота участвует в окислительно-восстановительных реакциях, являясь донором водорода; в реакциях гидроксилирования: при превращении триптофана в серотонин; пролина и лизина в оксипролин и оксилизин соответственно при синтезе коллагена; стероидов при синтезе гормонов коры надпочечников; при биосинтезе карнитина; при образовании норадреналина и др. С аскорбиновой кислотой связано освобождение железа из трансферрина, восстановление ионов Fe3+ до Fe2+; превращение фолиевой кислоты в её коферментные формы. А. Восстановление раствора гексацианоферрата (III) калия витамином С. Принцип метода. Аскорбиновая кислота восстанавливает K3[Fe(CN)6] в K4[Fe(CN)6], который с хлоридом железа (III) образует синее окрашивание или осадок – берлинскую лазурь. Исследуемый материал и реактивы 1. Раствор витамина С или поливитаминов. 2. Раствор гексацианоферрата (III) калия (5%). 3. Раствор хлорида железа (III) (1%). 4. Вода. Ход работы В две пробирки наливают по 1 капле 5% раствора гексацианоферрата (III) калия и по 1 капле 1% раствора хлорида железа (III). В первую пробирку к зеленовато-бурой жидкости добавляют 5-10 капель раствора витамина С; во вторую – столько же воды. Жидкость в первой пробирке приобретает зеленовато-синюю окраску и выпадает синий осадок берлинской лазури. Во второй пробирке зеленовато-бурая окраска остается без изменения. Б. Йодная проба на аскорбиновую кислоту. Принцип метода. Раствор йода в йодите калия при добавлении к нему раствора витамина С обесцвечивается за счет восстановления аскорбиновой кислотой молекулярного йода. Исследуемый материал и реактивы 1. Раствор витамина С или поливитаминов. 2. Раствор йода в йодите калия. 3. Вода. Ход работы В две пробирки наливают по 10 капель воды и по 1-2 капли раствора йода в растворе йодита калия. В одну пробирку добавляют 10 капель раствора витамина С, в другую – столько же воды. В пробирке с аскорбиновой кислотой раствор йода обесцвечивается.
Под термином витамин Р (витамин проницаемости), повышающим резистентность капилляров объединяется группа веществ со сходной биологической активностью: флавоны, флавононы, изофлавоны, флаванолы и т.д. Все они обладают Р-витаминной активностью и в основе их структуры лежит дифенилпропановый углеродный скелет хромана или флавона. Этим объясняется их общее название «биофлавоноиды». Витамин Р стабилизирует основное вещество соединительной ткани путем ингибирования гиалуронидазы. Биофлавоноиды вместе с витамином С участвуют в окислительно-восстановительных процессах организма и образуют единую систему. Принцип метода. При взаимодействии рутина с хлоридом железа (III) образуется комплексное соединение зеленого цвета. Исследуемый материал и реактивы 1. Листья чая сухие. 2. Хлорид железа (III) кристаллический. 3. Вода. Ход работы Берут навеску 100 мг чая, добавляют 25 мл воды и кипятят в течении 3 минут. Дают остыть, отбирают в пробирку 1 мл жидкости и добавляют несколько кристалликов хлорида железа (III). Перемешивают и разводят в 2-3 раза водой. Развивается зеленое окрашивание. Указания к оформлению лабораторной работы Полученные результаты лабораторной работы запишите в виде таблицы:
Контрольные вопросы
|