Лаб. практикум. Практикум по биологической химии методические указания к проведению лабораторных работ по биологической химии для студентов второго курса
 Скачать 1.02 Mb.
|
Лабораторная работа №30Тимоловая проба (проба коллоидоустойчивости)В клинико-диагностических лабораториях широко используют методы, при которых простыми коллоидными реакциями косвенно обнаруживаются изменения в составе белков сыворотки крови (диспротеинемические тесты). Все эти методы основываются на изменениях, наступающих в коллоидной устойчивости сыворотки, поэтому получили известность под названием проб коллоидной устойчивости (или проб на лабильность белков сыворотки). Поскольку нарушение коллоидной устойчивости сыворотки под действием какого-либо реактива выражается сначала коагуляцией (склеиванием), а затем флокуляцией (осаждением), коллоидно-устойчивые пробы именуются нередко коагуляционными или флокуляционными (коллоидно-осадочными). Лабильность сывороточных белков во многом зависит от соотношения между альбуминами (гидрофильными, защитными коллоидами) и глобулинами. Установлено, что положительный результат коллоидно-химических проб чаще всего вызывается количественными изменениями в глобулиновых фракциях (, , ), или изменением соотношения альбумины/глобулины, т.е. он связан с увеличением содержания глобулинов. Либо с уменьшением уровня альбуминов. Тимоловая проба более пригодна для функционального исследования печени, чем другие коллоидно-устойчивые пробы. Считают, что она положительна в 90-100% случаев болезни Боткина (уже в преджелтушной ее стадии и при безжелтушной форме) и при токсическом гепатите. Реакция положительна при послегепатитном и постнекротическом, особенно желтушном циррозе. В отличие от других форм циррозов, при коллагеновых заболеваниях, малярии и вирусных инфекциях. При механической желтухе она (в 75% случаев) отрицательна, что имеет дифференциально-диагностическое значение. Принцип метода. Сывороточные β-глобулины, γ-глобулины и липопротеиды осаждаются при рН=7,55 тимоловым реактивом. В зависимости от количества и взаимного соотношения отдельных белковых фракций при реакции возникает помутнение, интенсивность которого измеряют турбодинамически. Считают, что причиной помутнения тимоловой пробы является взаимодействие коллоидных частиц тимола и некоторых крупнодисперсных белков: -глобулинов и -липопротеидов. По представлению Маклагана, который предложил эту пробу в 1944 году, эта реакция связана с образованием глобулин-тимол-липидного комплекса (содержащего 40% глобулинов, 32% тимола, 18% холестерина и 10 % фосфолипидов). Исследуемый материал и реактивы 1. Сыворотка крови. 2. Тимоловый реактив. 3. Физиологический раствор натрия хлористого. 4. Раствор сравнения 1: серная кислота 0,01 моль/л. 5. Раствор сравнения 2: барий хлористый 0,3 ммоль/л, серная кислота 0,097 моль/л. Ход работы В трех пробирках готовят растворы в соответствии с таблицей:
Растворы перемешивают и оставляют стоять точно 30 мин при (+15-+25оС). Потом снова перемешивают и измеряют экстинкцию пробы и контрольного раствора I против контрольного раствора II (длина волны 620-660нм) в кювете с толщиной слоя 10мм. Построение калибровочной кривой Из раствора сравнения 1 и 2 разбавлением приготавливают растворы с помутнением, соответствующим (5-20) единицам помутнения по Shank-Hoagland (ед. S-H) в соответствии с таблицей:
В четырех пробирках смешивают раствор сравнения 1 с раствором сравнения 2 и точно через 30 мин содержимое пробирок тщательно перемешивают, после чего измеряют экстинкцию растворов против дистиллированной воды. Измерение проводят при такой же длине волны, как и при измерении пробы. Строят график, на оси абсцисс откладывая единицы помутнения, а на оси ординат соответствующие им значения экстинкции. Выводят кривые зависимости величины экстинкции от единиц помутнения. Определив экстинкцию исследуемой пробы и контрольного раствора I, находим по графику каким единицам помутнения соответствуют их оптические плотности. Рассчитываем результат по формуле: Т=Ед1–Ед2, где Т – единицы тимоловой пробы; Ед1 – единицы помутнения, соответствующие оптической плотности пробы; Ед2 – единицы помутнения, соответствующие оптической плотности контрольного раствора I. Указания к оформлению лабораторной работы В таблицу показателей норм основных клинико-биохимических исследований впишите нормальные значения единиц тимоловой пробы. В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, полученные результаты (единицы помутнения) и сделайте выводы. Контрольные вопросы
|