Лаб. практикум. Практикум по биологической химии методические указания к проведению лабораторных работ по биологической химии для студентов второго курса
 Скачать 1.02 Mb.
|
Лабораторная работа №22Определение активности аспартатаминотрансферазы( аланинаминотрансферазы) по методу Райтмана-Френкеля(набором реагентов)Аминотрансферазы (трансаминазы) – ферменты, осуществляющие трансаминирование аминокислот, содержащие в качестве кофермента фосфопиридоксаль. Аминотрансферазы относятся к индикаторным ферментам, так как трансаминазы обладают высокой активностью внутри клеток различных тканей и органов человека и сравнительно низкой активностью в крови (в тысячу раз ниже). Содержание этих ферментов в тканях неодинакова, так, аспартатаминотрансфераза (АсАТ) в наибольших количествах содержится в печени и сердечной мышце; содержание аланинаминотрансферазы (АлАТ) в печени во много раз выше, чем в сердце. Поэтому определение их активности широко применяется в диагностике заболеваний сердца и печени. Нормальные концентрации АсАТ (или АлАТ) – 0,14-0,68 ммоль/л*ч (0,028-0,19 ммкат/л). В клинике трансаминазный тест используется не только для постановки диагноза заболевания, но и для прогноза и проверки эффективности методов лечения. Принцип метода. В результате переаминирования, происходящего под действием аминотрансфераз, образуются щавелевоуксусная (ЩУК) и пировиноградная (ПВК) кислоты, которые в щелочной среде образуют с 2,4-динитрофенилгидразином окрашенные гидразоны. Интенсивность окраски пропорциональна активности ферментов и измеряется фотометрически. Исследуемый материал и реактивы 1. Сыворотка крови. 2. Субстратный раствор для определения АСТ – 100 мл (D.L.-аспарагиновая кислота – 0,2 моль/л; α-кетоглутаровая кислота – 2,0 ммоль/л; фосфатный буфер рН=7,4). 3. Субстратный раствор для определения АЛТ – 100 мл (D.L.-аланин – 0,2 моль/л; α-кетоглутаровая кислота – 2,0 ммоль/л; фосфатный буфер рН=7,4). 3. Раствор 2,4-динитрофенилгидразина (ДНФГ) – 1 ммоль/л – 100 мл. 4. Стандартный раствор пирувата натрия – 2 ммоль/л – 3 мл. 5. Натрий едкий – 16г (0,4 моль). 6. Физиологический раствор. Ход работы Реактивы 2,3,4 содержат готовые к использованию реагенты. Хранить при t – 2-80С. Содержимое пакета с натрием едким количественно перенести в колбу вместимостью 1л, растворить и довести до метки дистиллированной водой, свободной от карбонатов. Хранить при комнатной температуре. А. Приготовление опытной пробы. В пробирку вносят 0,25 мл субстратного раствора для определения АсАТ (или АлАТ), нагревают при 370С в течение 5 минут, добавляют 0,05 мл сыворотки крови, инкубируют при 370С 60 минут. Затем добавляют 0,25 мл 2,4-ДНФГ и выдерживают 20 минут при комнатной температуре. Добавляют 2,5 мл 0,4М раствора натрия едкого, перемешивают и через 10 минут фотометрируют при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10мм против холостой пробы. Б. Приготовление холостой пробы. Эту пробу ставят так же, как и опытную, но вместо сыворотки крови добавляют 0,05 мл физиологического раствора. Расчет активности ферментов в сыворотке крови производят по калибровочному графику. Построение калибровочного графика В пробирки вносят растворы в соответствии с таблицей, затем в каждую пробирку добавляют по 0,5 мл 2,4-ДНФГ, тщательно перемешивают и через 20 минут (18-250С) вносят по 0,5 мл 0,4н NaOH.
Инкубирую при комнатной температуре 10 минут и затем фотометрируют при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10мм против контроля. На оси координат откладывают найденную величину оптической плотности, на оси абсцисс – активность фермента в ммоль/ч*л или в мккат/л («ммоль/ч*л» соответствует 0,278 «мккат/л»). Калибровочная кривая до величины оптической плотности 0,3. При более высоких значениях оптической плотности сыворотку крови необходимо развести и повторить анализ. При расчете активности учесть степень разведения сыворотки (пропорциональность между степенью разведения и активностью фермента в разведенной сыворотке наблюдается не всегда). Указания к оформлению лабораторной работы В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, полученные результаты (активность фермента, моль/ч*л) и сделайте выводы о возможных причинах отклонения полученных результатов от нормальных величин. Контрольные вопросы
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||