Лаб. практикум. Практикум по биологической химии методические указания к проведению лабораторных работ по биологической химии для студентов второго курса
 Скачать 1.02 Mb.
|
Лабораторная работа №9Определение оптимума рН для действия α-амилазы слюныДля проявления максимальной каталитической активности ферментов требуются определенные условия, в том числе и оптимальная концентрация водородных ионов в среде. Кислотность (рН) среды, при которой наблюдается максимальная скорость реакции, называется оптимальной. Каждый фермент наиболее активен в пределах довольно узкой зоны рН (пепсин – 1,5-2,5; трипсин – 8,0-9,0; сахараза кишечная – 6,2; амилаза слюны – 6,9-7,0; липаза желудочного сока – 6,0; липаза панкреатическая – 7,0-8,5; каталаза – 7,0). Активность фермента уменьшается если рН среды смещается в сторону от оптимального значения. Это объясняется тем, что белковая молекула фермента является амфотерным полиэлектролитом и его каталитическая активность зависит от степени ионизации функциональных групп, которые входят в активный центр фермента. Отклонение рН от оптимума может нарушить связь между белковой частью ферментов и их простетическими группами, и, следовательно, может влиять на связывание субстрата в активном центре фермента. Принцип метода. Различная величина рН среды оказывает влияние на каталитическую активность α-амилазы слюны, что в свою очередь оказывает влияние на степень гидролиза крахмала под действием этого фермента, т.е. получение промежуточных продуктов гидролиза крахмала. Это обуславливает соответствующую окраску исследуемых растворов (см. лабораторную работу №6). Исследуемый материал и реактивы 1. Слюна в разведении 1:5. 2. Раствор крахмала (0,5%). 3. Раствор йода. 4. Буферный раствор (натрий фосфорнокислый двузамещенный Na2HPO4 и 0,1М раствор лимонной кислоты). Ход работы В 6 пробирок наливают по 2 мл буферного раствора различной величины рН (6.0; 6.4; 6.8; 7.2; 7.6; 8.0). В каждую пробирку наливают по 1 мл 0,5% раствора крахмала и по 1 мл разведенной слюны. Содержимое пробирок перемешивают и ставят в термостат при 37°С на 10 минут. После термостата в каждую пробирку добавляют по 1 капле раствора йода, отмечают наличие или отсутствие синей окраски и определяют рН среды, при котором α-амилаза слюны действует наиболее активно, т.е. где произошел наиболее полный гидролиз крахмала. Указания к оформлению лабораторной работы В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, зарисуйте полученный результаты (окраска растворов) и сделайте выводы о влиянии кислотности (рН) среды на скорость гидролиза крахмала α-амилазой слюны, определите оптимальную рН для этого фермента. Контрольные вопросы
Лабораторная работа №10Влияние активаторов и ингибиторов на активность α-амилазы слюныАктивность некоторых ферментов зависит от природы и концентрации ионов, присутствующих в реакционной среде. Некоторые ионы абсолютно необходимы для нормального действия ряда ферментов. Вещества, усиливающие действие ферментов, называются активаторами. Активаторы стимулируют действие ферментов, но в отличие от коферментов не принимают участия в реакции. Некоторые природные и синтетические вещества оказывают избирательное ингибирующее действие на ферменты и используются в качестве лекарственных средств. В больших дозах подобные вещества могут оказаться ядами. Ингибиторами называются вещества, снижающие скорость ферментативной реакции. Ингибиторами нередко являются продукты промежуточных или конечных реакций какого-либо биохимического процесса. Исследования природы и механизма действия активаторов и ингибиторов ферментов очень важны для изучения кинетики ферментативных процессов, для понимания механизма действия различных лекарственных средств, многих токсических веществ и соединений, которые используются в практике народного хозяйства и здравоохранения. Принцип метода. Активность амилазы слюны усиливается в присутствии хлористого натрия – специфического активатора амилазы. Сернокислая медь оказывает тормозящее действие на активность амилазы. Если добавить к смеси, содержащей слюну, крахмал, в одном случае хлористый натрий, в другом – сернокислую медь и в третьем – воду (контрольная проба), то за один и тот же промежуток времени в первой пробирке произойдет полное расщепление крахмала, в третьей – распад его только до декстринов, а во второй обнаружится нерасщепленный крахмал. Крахмал и декстрины открывают реакцией с раствором йода. Исследуемый материал и реактивы 1 Слюны в разведении 1:5. 2. Раствор крахмала (1%). 3. Раствор йода. 4.Вода. 5. Раствор NаС1 (1%). 6. Раствор СuSО4 (1%). Ход работы В три пробирки налить по 1 мл разведенной слюны. В первую пробирку налить 2 капли воды, во вторую - 2 капли 1% NаС1, в третью - 1% СuSО4. Во все пробирки добавить по 5 капель 1% крахмала и оставить стоять при комнатной температуре 2 минуты. Далее во все пробирки добавить по 1 капле раствора КJ и по 2 мл воды, перемешать и отметить наличие или отсутствие синей окраски. Указания к оформлению лабораторной работы В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, зарисуйте полученные результаты (окраска растворов) и сделайте выводы – какое вещество является активатором, а какое ингибитором для α-амилазы слюны. Контрольные вопросы
|