Лаб. практикум. Практикум по биологической химии методические указания к проведению лабораторных работ по биологической химии для студентов второго курса
 Скачать 1.02 Mb.
|
Лабораторная работа №2Реакции осаждения белковИзучение физико-химических свойств белков необходимо для понимания механизмов развития многих патологических состояний (например, отеков), механизмов транспорта веществ (в том числе лекарственных препаратов). На знании физико-химических свойств белков основано их получение и использование в качестве лекарственных препаратов. Реакции осаждения используются в медицине для качественного и количественного определения белка в биологических жидкостях, для удаления белков из растворов. Пробы коллоидоустойчивости используются для функциональной диагностики болезней внутренних органов. Реакции осаждения белков в зависимости от применяемого осадителя могут быть обратимыми и необратимыми. В случае необратимых реакций белки не подвергаются глубоким изменениям, и получаемые осадки могут быть вновь растворены в первоначальном растворителе, обычно в воде. Белки при этом сохраняют свои первоначальные нативные свойства. При необратимых реакциях, осажденные белки подвергаются глубоким изменениям, получаемые осадки не могут быть вновь растворены в первоначальном растворителе, обычно в воде, т.е. наступает денатурация белков. Обратимые реакции осаждения можно получить путем так называемого высаливания при помощи нейтральных солей: NaCl, (NH4)2SO4, MgSO4, спиртом (в случае непродолжительного действия его га белок при низкой температуре) и др. Значение реакций осаждения белков в том, что они дают возможность: 1) изучить свойства белков; 2) освободить жидкость от присутствия белка, что бывает необходимо при некоторых исследованиях; 3) установить наличие белка, например, в моче, при различных патологических состояниях (заболеваниях почек – нефрите, сердечная декомпенсация и др.); 4) высаливанием с помощью различных концентраций нейтральных солей (или спиртом) можно выделить отдельные белковые фракции. Почти все белки свертываются при нагревании в нейтральной или слабокислой среде. Более полное и быстрое осаждение белков происходит в изоэлектрической точке. Для большинства белков ИЭТ соответствует слабокислой среде (рН около 5,0). Протамины и гистоны имеют ИЭТ в щелочной среде (рН около 8,0). Кроме рН среды важную роль в свертывании белков при нагревании играет концентрация солей.
Устойчивость белка в растворе к нагреванию зависит от наличия заряда (положительного в сильнокислой среде и отрицательного - в щелочной среде). Полное и быстрое осаждение белков происходит в изоэлектрической точке, которая для большинства белков соответствует слабокислой среде (рН около 5,5). Принцип метода. При нагревании растворов белка вначале отмечается увеличение опалесценции и появление мути (коагуляции). При дальнейшем повышении температуры - появление хлопьевидного осадка белка (седиментация). При кипячении происходит необратимое изменение природных свойств белка (денатурация). Исследуемый материал и реактивы 1. Раствор яичного белка (1%). 2. Раствор уксусной кислоты (1%). 3. Насыщенный раствор хлористого натрия. 4. Раствор гидроксида натрия (10%). Ход работы В 5 пробирок наливают по 0,5 мл раствора яичного белка. В первой пробирке нейтральный раствор белка нагревают до кипения. Отмечают появление мути, связанное с разрушением водной оболочки вокруг молекул белка и укрупнению его частиц; мицеллы белка несут заряд и удерживаются во взвешенном состоянии. Во вторую пробирку прибавляют 3 капли 1% раствора уксусной кислоты, создавая слабокислую среду. Раствор белка нагревают до кипения и частицы белка при этом теряют заряд и приближаются к изоэлектрическому состоянию. В третью пробирку добавляют 15 капель 1% раствора уксусной кислоты и нагревают раствор до кипения. В четвертую пробирку наливают 15 капель 1% раствора уксусной кислоты для получения сильнокислой реакции, 2 капли насыщенного раствора хлористого натрия и нагревают. Выпадает хлопьевидный осадок белка, так как частицы белка теряют заряд вследствие взаимодействия белка с разноименно заряженными ионами хлористого натрия. В пятую пробирку добавляют 6 капель 10% раствора едкого натра, создавая щелочную среду, и нагревают. В каждой пробирке определяют рН среды с помощью индикатора. При кипячении жидкости осадок не образуется, поскольку в щелочной среде отрицательный заряд на частицах белка увеличивается. Отмечают, в какой пробирке произошло осаждение белка, а в какой - нет. Делают выводы о влиянии рН среды на белковые макромолекулы и выпадение белка в осадок. Результаты оформляют в виде таблицы (1).
Осаждение белков из растворов при действии высоких концентраций нейтральных солей щелочных и щелочноземельных металлов называют высаливанием. Метод высаливания позволяет получить белки в кристаллическом виде и применяется для разделения и очистки. Принцип метода. Реакция высаливания (осаждение белков с помощью больших концентраций нейтральных солей) обусловлена дегидротацией макромолекул белка с одновременной нейтрализацией электрического заряда. Для высаливания различных белков требуется неодинаковая концентрация одних и тех же солей. Глобулины, имеющие большую молекулярную массу, легче высаливаются, чем альбумины. Глобулины осаждаются в полунасыщенном, а альбумины – в насыщенном растворе сернокислого аммония. Исследуемый материал и реактивы 1. Раствор яичного белка (1%). 2. Насыщенный раствор сульфата натрия. 3. Насыщенный раствор сульфата магния. 4. Насыщенный раствор сульфата аммония. 5. Вода дистиллированная. Ход работы В 3 пробирки вносят по 1 мл раствора белка и добавляют по 1 мл насыщенных растворов: Na2S04, Mg2SO4,(NH4)2SO4. После добавления осадителей к растворам белка, смеси необходимо перемешать встряхиванием. Определяют, в какой пробирке объем осадка больше. Затем проверяют растворимость осажденного белка добавлением 2 мл воды. Выясняют, в какой пробирке происходит растворение осадка. Делают вывод о необратимом или обратимом растворении белков. Результаты оформляют с помощью таблицы (2).
Осаждение белков солями тяжелых металлов, в отличие от высаливания, происходит при небольших концентрациях солей. Принцип метода. Белки при взаимодействии с солями тяжелых металлов (свинца, меди, серебра, ртути и др.) адсорбируют их, образуя с ними солеобразные и комплексные соединения (на этом основано применение белков в качестве противоядия при отравлении солями тяжелых металлов), растворимые в избытке этих солей (за исключением солей AgNO3 , HgCl2), но нерастворимые в воде. Соли тяжелых металлов вызывают необратимое осаждение белков, т.е. денатурацию. Исследуемый материал и реактивы 1. Раствор яичного белка (1%). 2. Раствор сернокислой меди,100 г/л. 3. Раствор уксуснокислого свинца, 50 г/л. Раствор уксусной кислоты, 10 г/л. 4. Вода дистиллированная. Ход работы В 2 пробирки вносят по 0,5 мл раствора белка и добавляют по 1-2 капли растворов CuS04,(CH3COO)2Pb. Отмечают выпадение осадка в пробирках. Затем добавляют в каждую пробирку по 1-2 мл воды и определяют растворимость осадка белка. Далее в эти пробирки добавляют по каплям соответствующие растворы осадителей и перемешивают содержимое. Делают вывод о причинах обратимости осаждения белка в растворах солей тяжелых металлов. Результаты опыта оформляют в виде таблицы (2).
В реакциях осаждения белков большое практическое значение получили трихлоруксусная и сульфосалициловая кислоты. Сульфосалициловой кислотой широко пользуются в клинике при обнаружении малых количеств белка в моче и других биологических жидкостях (чувствительность реакции 1:50000). Сульфосалициловая кислота, помимо белков, осаждает продукты их распада – высокомолекулярные пептоны и полипептиды. ТХУ осаждает только белки и не осаждает продуктов их распада. В связи с этим ТХУ осаждают, например, белки крови, когда хотят отделить их от высокомолекулярных пептидов. Принцип метода. При действии на раствор белка органические кислоты способны нейтрализовать заряд белка и разрушить его пространственную структуру, что приводит к необратимой денатурации и осаждению белка. Исследуемый материал и реактивы 1. Раствор яичного белка (1%). 2. Раствор сульфосалициловой кислоты, 200 г/л. 3. Раствор трихлоруксусной кислоты, 100 г/л. Ход работы В 3 пробирки вносят по 0,5 мл раствора белка и добавляют по 1-2 капли растворов сульфосалициловой кислоты. Определяют растворимость выпавшего осадка в воде. Во 2 пробирку наливают 2 мл раствора белка и 2 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты; взбалтывают содержимое и фильтруют через складчатый фильтр, в другую пробирку. Полноту осаждения белков определяют при добавлении к фильтрату сульфосалициловой кислоты. Результаты опытов оформляют в виде таблицы (2).
Алкалоидные реактивы – танин, пикриновая кислота, фосфорно-вольфрамовая, фосфорно-молибденовая кислота раствор йодной ртути в йодистом калии и др. – вызывают необратимое осаждение белка в кислой среде. Принцип метода. Реакция обусловлена наличием в белке азотистых гетероциклических группировок, аналогично тем, которые встречаются в молекулах алкалоидов (индольные, имидазольныее, пиррольные и др.). При этом алкалоидные реактивы являются анионами, а белки – катионами. Слабое подкисление белкового раствора уксусной кислотой ведет к появлению положительного заряда на поверхности белка и облегчает взаимодействие белка с отрицательно заряженными ионами осадителя. Белки, обладающие основным свойствами (гистоны, протамины), хорошо растворяются в нейтральной среде без подкисления. Исследуемый материал и реактивы 1. Раствор яичного белка (1%). 1. Раствор уксусной кислоты (1%). 2. Раствор пикриновой кислоты (10%). 3. Насыщенный раствор танина. 4. Вода дистиллированная. Ход работы В 2 пробирки вносят по 0,5 мл раствора белка и добавляют по 5 капель 1% раствора уксусной кислоты. Затем добавляют в одну 5 капель пикриновой кислоты, в другую 5 капель танина. Определяют растворимость выпавшего осадка добавлением 1 мл воды. Результаты оформляют в виде таблицы (2).
Концентрированные минеральные кислоты вызывают денатурацию белка и выпадение его в осадок (образуются комплексные соли белка с минеральными кислотами). Ортофосфорная кислота осадка не дает. В избытке всех минеральных солей, за исключением азотной, выпавший в осадок белок растворяется. В связи с этим реакция осаждения белков азотной кислотой особенно распространена при клинических исследованиях мочи (проба Геллера). Эта качественная реакция с концентрированной азотной кислотой лежит в основе количественного определения белка в моче по методу Робертса-Стольникова-Брандберга. Принцип метода. Выпадение белка в осадок связано с дегидратацией белковых частиц и их нейтрализацией, что приводит к разрушению пространственной структуры белка и выпадению его в осадок. Исследуемый материал и реактивы 1. Раствор яичного белка (1%). 2. Концентрированная азотная кислота. 3. Концентрированная соляная кислота. 4. Концентрированная серная кислота. 5. Вода дистиллированная. Ход работы В 3 пробирки вносят по 1 мл раствора белка и добавляют по 2-3 капли следующих концентрированных растворов кислот НNО3, НС1, Н2SO4. Содержимое пробирок осторожно перемешивают и добавляют еще несколько капель соответствующих кислот. Определяют растворимость выпавшего осадка добавлением 1 мл воды. Результаты опыта оформляют в виде таблицы (2).
В органических растворителях, таких как спирт, ацетон и др., белки не растворяются и выпадают в осадок. Однако, кратковременное воздействии органических растворителей при низкой температуре от 0 до 100С сохраняет белок в нативном состоянии, что используется в фармацевтической практике для получения отдельных белковых препаратов, например гормона инсулина. При длительном воздействии органических растворителей наступает необратимая денатурация белка. Принцип метода. Спирт, связывает воду, т.е. обезвоживает коллоидные частицы белка, вызывая дегидратацию мицелл белка, нарушение гидрофобных взаимодействий внутри белковой молекулы и вызывают ее денатурацию, что приводит к снижению растворимости и выпадению денатурированного белка в осадок. Исследуемый материал и реактивы 1. Раствор яичного белка (1%). 2. Спирт этиловый (95%). 3. Насыщенный раствор хлористого натрия. Ход работы К 5 каплям раствора белка прибавить 15-20 капель этилового спирта. Раствор мутнеет. Добавить 1 каплю насыщенного раствора хлористого натрия. При стоянии выпадает осадок белка. Результаты опыта оформляют в виде таблицы (2). Указания к оформлению лабораторной работы В тетради для лабораторных работ отметьте цель занятия, принцип метода, порядок работы (кратко, в виде таблицы). Результаты работ по осаждению белков представьте в виде двух таблиц: 1) Осаждение белка при кипячении при различных реакциях среды.
2) Реакции осаждения белков различными веществами.
Сделайте выводы: 1) о механизме осаждения белков при кипячении; 2) о влиянии концентрации водородных ионов и ионов солей на устойчивость в растворе молекул денатурированного при кипячении белка; 3) о возможности применения реакций осаждения в лабораторной практике. Контрольные вопросы
|