Лаб. практикум. Практикум по биологической химии методические указания к проведению лабораторных работ по биологической химии для студентов второго курса
 Скачать 1.02 Mb.
|
биохимия Сложных белков (протеинов)Сложные белки относятся к смешанным макромолекулам – белок-небелковым комплексам, которые содержат два компонента – простой беок и небелковый компонент, соединенные между собой ковалентными или слабыми (ионными, водородными, вандервальсовыми, фосфоэфирными и др.) связями. Небелковый компонент называется – простетическая группа. К сложным белкам относятся: нуклеопротеины, хромопротеины, фосфопротеины, гликопротеины, липопротеины, сложные белки-ферменты, металлопротеины. Лабораторная работа №3Геминовая проба ТейхманаКачественные реакции на небелковую часть гемопротеинов позволяют выявить структурные компоненты (геминовую группировку и входящее в ее состав железо) в биологическом материале. Пробой Тейхмана пользуются в судебно-медицинской экспертизе для доказательства наличия кровяных пятен. Эта проба заключается в образовании кристаллического солянокислого гемина при действии на кровь уксусной кислоты и хлорида натрия. Гемин отличается от гема наличием трехвалентного железа, соединенного с атомом хлора. Принцип метода. При нагревании крови с ледяной уксусной кислотой гемоглобин распадается на гем и глобин. Если гидролиз крови проводить в присутствии уксусной кислоты и хлорида натрия, гемм превращается в солянокислую соль – гемин. Образуются характерные кристаллы солянокислого гемина. Исследуемый материал и реактивы 1. Кровь. 2. Спирт 3. Вата. 4. Скарификаторы. 5. Предметные и покровные стекла. 6. Раствор хлорида натрия (0,9%). 7. Концентрированная уксусная кислота. Ход работы К  аплю свежей крови помещают на предметное стекло и дают ей высохнуть на воздухе. К подсушенной крови добавляют 1-2 капли 0,9% раствора хлорида натрия; тщательно перемешивают стеклянной палочкой, далее, туда добавляют 1-2 капли концентрированной уксусной кислоты и еще раз тщательно перемешивают стеклянной палочкой, покрывают покровным стеклом и осторожно нагревают до начала кипения (не кипятить!). При этом предметное стекло следует держать высоко над пламенем горелки, чтобы избежать выкипания жидкости. Затем препарат охлаждают и рассматривают под микроскопом образовавшиеся при разрушении гемоглобина кристаллы солянокислого гемина, имеющие форму ромбоидальных палочек (смотри рисунок).Если обнаружить кристаллы не удается, то приподнимают покровное стекло, добавляют 2-3 капли концентрированной уксусной кислоты, нагревают и после охлаждения вновь исследуют под микроскопом. Указания к оформлению лабораторной работы В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, зарисуйте наблюдаемую картину в поле зрения и сделайте выводы об исследуемом веществе. Контрольные вопросы
Лабораторная работа №4Выделение казеиногена из молока и открытие в нем фосфатаКазеиноген белок молока относятся к сложным белкам – фосфопротеинам – содержит в качестве небелковой группы остатки фосфорной кислоты (0,5-0,9%). К фосфопротеинам относятся также вителлин, вителлинин и витин яичного желтка, ихтулин рыбьей икры, а также ферменты – фосфорилаза, фосфоглюкомутаза, пепсин и др. Все фосфопротеины с химической точки зрения характеризуются эфирной связью фосфорной кислоты в белковых молекулах. Эфирная связь в молекулах фосфопротеинов осуществляется благодаря присоединению остатков фосфорной кислоты к оксигруппе остатков серина и треонина (оксиаминокислот). Биологическая роль фосфопротеинов заключается в том, что они служат типичным материалом для растущих организмов. Присутствие фосфопротеинов в материале можно открыть реакциями на фосфаты, на белки и продукты их постепенного гидролиза. Казеиноген – фосфопротеин молока – под действием пищеварительных ферментов (пепсин) превращается в казеин, который с солями кальция образует казеинат кальция, что сопровождается свертыванием молока. Кальциевая соль казеина в противоположность кальциевой соли казеиногена нерастворима в воде. Превращением казеиногена в казеин объясняется ферментативное свертывание молока. В простокваше и других кисло-молочных продуктах в свернутом состоянии находится казеиноген. Качественные реакции на фосфатную группу используются для открытия фосфопротеинов в исследуемых образцах. Принцип метода. Казеиноген обладает свойствами кислоты и в молоке находится в виде анионов, растворимых в воде. Недиссоциированные молекулы казеиногена малорастворимы в воде. Изоэлектическая точка казеиногена находиться при рН=4,7. Этим объясняется, что при подкислении при рН=4,7 молоко свертывается благодаря выпадению в осадок казеиногена. Свертывание молока возможно также и в присутствии молочной кислоты, образовавшейся из лактозы под влиянием молочнокислых бактерий. При щелочном гидролизе казеиноген (казеин) распадается на фосфат и белок. Фосфат может быть обнаружен специфической реакцией с молибденовым реактивом. Исследуемый материал и реактивы 1. Молоко. 2. Уксусная кислота концентрированная. 3. Сернокислая медь (1%). 4. Едкий натр (10%). 5. Реактив Милона. 6. Реактив Фоля. 7. Фильтры. 8. Раствор гидроксида натрия (10%). 9. Биуретовый реактив. 10. Азотная кислота (концентрированная). 12. Раствор молибдата аммония. 13. Раствор аскорбиновой кислоты (1%) на 1М растворе соляной кислоты. 14. Лакмусовая бумага. Ход работы
К 2 мл молока приливают равный объем дистиллированной воды. Осаждают казеиноген добавлением 1 капли концентрированной уксусной кислоты. Не следует добавлять избыток кислоты, поскольку молекулы белка казеиногена перезаряжаются и вновь переходят в раствор, что мешает осаждению. Выпавший осадок казеиногена отфильтровывают и промывают на фильтре дистиллированной водой 2 раза. Часть осадка снимают с фильтра стеклянной палочкой и проводят с ним цветные реакции на белки (биуретовую, Фоля, Милона).
В пробирку вносят 0,1г сухого порошка казеина, прибавляют 5 мл 10% раствора гидроксида натрия и ставят в кипящую водяную баню на 30 мин. Охлаждают пробирку и проводят реакцию на продукты гидролиза. А. Обнаружение белка. Проводят реакцию 10 капель гидролизата и проводят реакцию с биуретовым реактивом, добавляя 3-5 капель его к 10 каплям гидролизата (см. лаб. № 2). Отмечают появление характерного окрашивания. Б. Обнаружение фосфата. В другую пробирку вносят 20 капель гидролизата и нейтрализуют его, прибавляя по каплям концентрированную азотную кислоту до слабокислой реакции по лакмусовой бумаге. Затем прибавляют 10 капель раствора молибдата аммония, перемешивают содержимое и приливают 10 капель 1% раствора аскорбиновой кислоты, приготовленной на 1М растворе соляной кислоты. Вновь перемешивают, оставляют стоять пробы до развития синего окрашивания и записывают химизм реакции. Н3РО4+12(NH4)2МоО4+21НNО3→(NН3)3(РО4•12МоО3)+21N4NО3+12Н2О Указания к оформлению лабораторной работы В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, принцип метода, химизм реакций и сделайте выводы о составе и растворимости сложного белка молока – казеиногена. Контрольные вопросы
|