Тец руководство. Руководство к практаческим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии под редакцией
 Скачать 2.14 Mb.
|
|
Тема 3.2. ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ Введение. Идентификация — определение (установление) видовой принадлежности микроба. В настоящее время общепринятый метод идентификации основан на изучении определенного набора наиболее важных фенотипических признаков исследуемого микроорганизма. Критерием для идентификации является наличие у микроба совокупности основных признаков, характерных для данного вида (таксонометрических признаков). Установление вида производится согласно международной таксономии бактерий (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology). К основным видовым признакам бактерий относятся: морфология микробной клетки; тинкториальные свойства — особенности окрашивания с помощью простых и сложных методов окраски; культуральные признаки — особенности роста микроба на питательных средах; биохимические признаки — наличие у бактерий ферментов, необходимых для синтеза или расщепления (ферментации) различных химических соединений. В бактериологической практике чаще всего изучают сахаро-литические и протеолитические ферменты. К дополнительным признакам, используемым при идентификации, относятся: наличие видоспецифических антигенов (см. главу 10); чувствительность к видоспецифическим бактериофагам (см. главу 5); видовая резистентность к определенным антимикробным препаратам (см. главу 8); для патогенных бактерий — продукция определенных факторов вирулентности (см. главу 9). Тонкая внутривидовая идентификация до биовара (серова-ра, фаговара, ферментовара и т.д.) — типирование — основана на выявлении соответствующего маркера: антигена (серотипи-рование, см. главу 10), чувствительности к типовому бактериофагу (фаготипирование, см. главу 5) и др. В последние годы разработаны и начали применяться современные биохимические и молекулярно-биологические методы идентификации: хемоидентификация, анализ нуклеиновых кислот: рестрикционный анализ, гибридизация, полиме-разная цепная реакция (ПЦР), риботипирование и др. План занятия Программа Идентификация бактерий. Изучение биохимических свойств аэробных и анаэробных бактерий. а Демонстрация Незасеянный "пестрый ряд". Варианты изменения "пестрого ряда". "Пестрый ряд" для анаэробных бактерий. Микрометод изучения биохимических свойств бактерий. Рост бактерий, вырабатывающих пигменты. Задание студентам Зарисовать варианты изменения "пестрого ряда". Оценить результаты отсева чистой культуры: отметить наличие или отсутствие роста посеянной культуры, а также присутствие посторонних бактерий. Убедиться в чистоте выделенной культуры, для этого приготовить мазок и окрасить его по методу Грама. Поставить каталазную пробу на стекле и оценить ее результат. Учесть результаты определения биохимической активности выделенных чистых культур. С помощью таблицы-определителя на основании изученных морфологических, тинкториальных, культуральных и ферментативных свойств идентифицировать выделенные микробы. Методические указания Биохимическая идентификация. Для оценки биохимической активности бактерий используют следующие реакции: 1) ферментацию — неполное расщепление субстрата до промежуточных продуктов, например ферментацию углеводов с образованием органических кислот; окисление — полное расщепление органического субстрата до СО2 и Н2О; ассимиляцию (утилизацию) — использование субстрата для роста в качестве источника углерода или азота; диссимиляцию (деградацию) субстрата; гидролиз субстрата. Классический (традиционный) метод идентификации микробов по биохимическим признакам заключается в посеве чистой культуры на дифференциально-диагностические среды, содержащие определенные субстраты, с целью оценки способности микроорганизма ассимилировать данный субстрат или определения конечных продуктов его метаболизма. Исследование занимает не менее 1 сут. Примером является оценка саха-ролитической активности бактерий (способности ферментировать углеводы) с помощью посева на среды Гисса — короткий и длинный "пестрый ряд". Идентификация бактерий по биохимическим признакам с помощью сред "пестрого ряда". Короткий "пестрый ряд" включает жидкие среды Гисса с моно- и дисахаридами: глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой и с 6-атомным спиртом — маннитом. В длинный "пестрый ряд" наряду с перечисленными углеводами вводят среды с разнообразными моносахаридами (арабиноза, ксилоза, рамноза, галактоза и др.) и спиртами (глицерин, дульцит, инозит и др.). Для оценки способности бактерий ферментировать углевод в среды добавляют индикатор (реактив Андреде или др.), позволяющий выявить образование кислых продуктов расщепления (органических кислот), и "поплавок" для обнаружения выделения СО2. Чистую культуру исследуемого микроорганизма засевают петлей в среды "пестрого ряда". Посевы инкубируют при 37 "С в течение 18—24 ч или больше. В том случае, если бактерии ферментируют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды; при разложении углевода до кислоты и газообразных продуктов наряду с изменением цвета появляется пузырек газа в поплавке. Если используют среды с полужидким агаром, то образование газа регистрируется по разрыву столбика. При отсутствии ферментации цвет среды не меняется. Поскольку бактерии ферментируют не все, а только определенные для каждого вида углеводы, входящие в состав сред Гисса, наблюдается довольно пестрая картина, поэтому набор сред с углеводами и цветным индикатором называют "пестрым рядом" (рис. 3.2.1; на вклейке). Для определения протеолитических ферментов производят посев культуры бактерий уколом в столбик 10—20 % желатина, пептонную воду. Посевы в желатине инкубируют при 20—22 °С в течение нескольких дней. При наличии протеолитических ферментов бактерии разжижают желатин, образуя фигуру, напоминающую воронку или елочку. В посевах в пептонную воду определяют продукты расщепления аминокислот после инкубирования в течение 2—3 сут при 37 °С путем постановки реакций на аммиак, индол, сероводород и др. Реакция на аммиак. Узкую полоску лакмусовой бумаги укрепляют под пробкой так, чтобы она не соприкасалась с питательной средой. Посинение бумаги свидетельствует об образовании аммиака. Реакция на индол. Способ Эрлиха: в пробирку с культурой бактерий прибавляют 2—3 мл эфира, содержимое энергично перемешивают и добавляют несколько капель реактива Эрлиха (спиртовой раствор парадиметиламидобензальдегида с хлористоводородной кислотой). В присутствии индола наблюдается розовое окрашивание, при осторожном наслаивании образуется розовое кольцо (см. рис. 3.2.1). Реакция на сероводород. В пробирку с пептонной водой помещают узкую полоску фильтровальной бумаги, смоченную сульфатом железа, и закрепляют ее под пробкой так, чтобы она не соприкасалась с питательной средой. При выделении сероводорода образуется нерастворимый сульфид железа (FeS), окрашивающий бумагу в черный цвет (см. рис. 3.2.1). Продукцию H2S можно определять также путем посева культуры бактерий уколом в столбик с питательной средой, содержащей реактивы для выявления b^S (смесь солей: сульфат железа, тиосульфат натрия, сульфит натрия). Положительный результат — среда приобретает черный цвет за счет образования FeS. Обнаружение каталазы. На предметное стекло наносят каплю 1—3 % раствора пероксида водорода и вносят в нее петлю с бактериальной культурой. Каталаза разлагает пероксид водорода на кислород и воду. Выделение пузырьков газа свидетельствует о наличии у данного вида бактерий каталазы. В бактериологической практике иногда ограничиваются изучением сахаролитических и протеолитических признаков исследуемых бактерий, если этого достаточно для их идентификации. При необходимости исследуют другие признаки, например способность к восстановлению нитратов, карбоксили-рованию аминокислот, образованию оксидазы, плазмокоагула-зы, фибринолизина и других ферментов. Результаты работ по идентификации выделенной культуры протоколируют (табл. 3.2.1). Биохимические тесты 2-го поколения, основанные на применении концентрированных субстратов и более чувствительных методов обнаружения конечных продуктов реакции, по-
водных). Это позволяет различать микробы, принадлежащие к разным видам, по количественному и качественному составу липидов (жирных кислот, эфиров, спиртов, хинонов и т.д.). Анализ химического состава микробных клеток осуществляется с помощью метода хроматографии. Наиболее широко используют метод газожидкостной хроматографии. Ведущей областью применения метода являются идентификация анаэробных бактерий по составу жирных кислот с короткой углеродной цепью (9—20 атомов углерода), относящихся к основным продуктам метаболизма этих микроорганизмов, а также идентификация медленно растущих бактерий (микобактерий) и бактерий с низкой ферментативной активностью. Молекулярно-генетические методы идентификации. Они основаны на анализе бактериальных ДНК. Рестрикционный анализ. ДНК обрабатывают рестрикционными ферментами — специфическими эндонуклеазами, которые разрезают молекулу ДНК по определенным последовательностям нуклеотидов. Далее проводят анализ полученных фрагментов, уникальных для каждого вида микроорганизма. Метод также позволяет осуществлять внутривидовое типирование бактерий. Гибридизация ДНК. Любой микроорганизм имеет в своем геноме определенные уникальные последовательности, которые могут быть использованы для его идентификации. Метод обнаружения таких участков ДНК основан на способности комплементарных последовательностей нуклеиновых кислот к гибридизации. Исследование проводят с помощью нуклеиновых зондов — однонитевых фрагментов ДНК, комплементарных уникальным участкам микробного генома и несущих метку (радионуклид, фермент или флюорохром). Включение метки обеспечивает высокую чувствительность метода. В зависимости от выбранного генетического фрагмента зонды могут быть родо-, видо- или типоспецифическими. Быстрота и высокая чувствительность метода гибридизации позволяют существенно сократить время исследования. Основной областью применения является идентификация трудно культивируемых или медленно растущих микробов (например, представителей родов Mycobacterium, Neisseria, Campy lobacter). Особо следует выделить метод риботипирования — идентификации, основанной на анализе генов, кодирующих рибосомальные РНК. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Метод ПЦР позволяет обнаруживать уникальные последовательности ДНК, присутствующие в образце в очень малых количествах. Теоретически достаточно одной копии искомой последовательности. Метод ПЦР основан на амплификации (увеличении числа копий) искомого участка генома микроорганизма. С этой целью образец инкубируют в буферном растворе с двумя короткими ДНК-олигомерами (праймерами), комплементарными концам известного фрагмента генома, термостабильной ДНК-полимеразой и нуклеотидами. После гибридизации олигомеров с комплементарными участками ДНК они служат праймерами для полимеразы, которая копирует искомый фрагмент. Образец многократно нагревают для разделения цепей двойной спирали ДНК и остужают для повторной гибридизации праймеров с комплементарной матрицей. Каждая копия ДНК становится новой матрицей для синтеза новой копии. Процедуру повторяют 20—40 раз. При этом количество копий искомого фрагмента генома увеличивается по экспоненциальному закону. Амплификация в миллионы раз занимает всего несколько часов. Глава 4 МОРФОЛОГИЯ И ФИЗИОЛОГИЯ ГРИБОВ Введение. Грибы представляют собой многочисленную группу микроорганизмов, относящихся к доминиону Eukarya, царству Mycota. Классификация внутри царства основана на морфологии, характере и способах размножения, физиологических особенностях и других признаках. Клетка гриба имеет ультраструктуру, типичную для эукариот. Все грибы способны к бесполому размножению, совершенные грибы могут также размножаться половым путем. Представители одного вида в половой (телеоморфной) и бесполой (анаморфной) фазах развития могут существенно различаться по морфологии, экологии и в случае патогенных видов способности вызывать заболевания. Грибы подразделяются на две основные морфологические группы: плесени (нитевидные грибы) и дрожжи. Морфология плесневых грибов. Вегетативное тело плесневого гриба — гифа — имеет нитевидную форму. Толщина гиф обычно превышает 2 мкм, что позволяет отличить их от актиноми-цетов, толщина клеток которых не превышает 1 мкм. Длина гиф у свободно живущих видов может достигать нескольких метров. У высших грибов гифа разделена мембранными перегородками — септами, у низших септы отсутствуют. Гифы в процессе развития ветвятся и образуют анастомозы, за счет чего формируется переплетенная структура — мицелий. Различают субстратные гифы (мицелий), погруженные в питательный субстрат, и воздушные, растущие над его поверхностью.
 параты раздавленная" капля из чистых культур грибов родов Penicillium, Aspergillus, Mucor. Питательные среды для культивирования грибов. Рост и типы филаментации дрожжеподобных грибов рода Candida на картофельном агаре. Изучение биохимических признаков чистой культуры грибов рода Candida ("пестрый ряд"). Задание студентам Микроскопировать и зарисовать мазки, предложенные для демонстрации. Ознакомиться с таблицами. Описать характер роста грибов рода Candida на глюкозокартофельном агаре. Указать тип филаментации (по данным таблицы "Бластоспоры и филаментация дрожжеподобных грибов"). Проанализировать "пестрый ряд" чистой культуры грибов рода Candida, сверяя полученные результаты с данными таблицы "Таксономические признаки дрожжеподобных грибов рода Candida", и сделать заключение о видовой принадлежности. а Методические указания Морфологию грибов изучают в нативных и фиксированных препаратах. Для приготовления нативного препарата "раздавленная капля" для изучения морфологии плесневых грибов отделяют препаровальными иглами небольшой участок мицелия с плодоносящими гифами и прилегающим к нему тонким слоем питательной среды. Материал помещают в каплю воды на предметном стекле, иглой расправляют мицелий, придавливают покровным стеклом и микроскопируют при опущенном конденсоре. Препарат просматривают с объективом 8х, а затем — 40х. Предварительно колонии или культуры грибов микроскопируют непосредственно на чашках или в пробирках под малым увеличением. Методы культивирования грибов аналогичны бактериологическим. Грибы выращивают на специальных сложных питательных средах (среда Сабуро, сусло-агар, картофельные, морковные среды и др.), включающих углеводы в качестве источника энергии и углерода и различные факторы роста. Для приготовления таких сред обычно используют натуральные добавки: дрожжевой экстракт, пивное сусло, овощные экстракты и др. Для задержки роста бактерий добавляют антибиотики и/или молочную кислоту. Среда Сабуро состоит из дрожжевой воды с добавлением 1 % пептона, 2 % агара и 4 % мальтозы (или глюкозы). Питательную среду разливают в пробирки и стерилизуют при 0,5 атм в течение 20 мин. В жидкие среды агар не добавляют. Этапы выделения чистых культур грибов (из организма больного или объектов внешней среды) те же, что и при выделении бактерий. Исследуемый материал засевают на специальные жидкие обогатительные (для накопления в случае малой концентрации микроорганизмов) или плотные питательные среды для получения изолированных колоний и инкубируют в термостате при температуре 37е и 28—30 'С в течение нескольких дней. Рост грибов наблюдается на 3—5-е сутки. На плотных средах формируются разнообразные колонии: плоские, выпуклые, гладкие, морщинистые, мучнистые, слизистые, пушистые и др., часто пигментированные. Так, дрожжеподоб-ные грибы рода Candida на 2—3-й день после посева образуют мелкие выпуклые пигментированные колонии с гладкой блестящей поверхностью, которые нередко сливаются и врастают в питательную среду. Делают пересев колоний, выделяют чистую культуру и проводят идентификацию с определением родовой и видовой принадлежности на основании морфологических, культуральных, биохимических и других признаков. Методы идентификации грибов аналогичны методам идентификации бактерий. Особое значение для определения видовой принадлежности чистой культуры плесневых грибов имеет изучение их морфологии. Для определения культуральных признаков колонии грибов микроскопируют непосредственно на чашках или в пробирках под малым увеличением. Биохимические свойства можно определить с помощью "пестрого ряда" или другими методами (см. тему 3.2). Глава 5 ОБЛИГАТНЫЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ПАРАЗИТЫ Введение. К облигатным внутриклеточным паразитам относятся все вирусы и некоторые бактерии (представители порядков Chlamydiales и Rickettsiales), а также ряд видов патогенных простейших (Toxoplasma, Plasmodium и др.). Вирусы выделены в самостоятельное царство Vira. Вирусы не имеют клеточного строения, собственного метаболизма, содержат один тип нуклеиновой кислоты — ДНК или РНК, не размножаются бинарным делением и могут кристаллизоваться как неорганические вещества. Они являются облигатными внутриклеточными паразитами с дизъюнктивным (разобщенным) типом размножения. Внеклеточная форма существования вируса называется вирионом. В отличие от организмов, имеющих клеточное строение, вирусы занимают промежуточное положение между живой и неживой материей. В основе классификации вирусов лежат определенные признаки: тип вирусной нуклеиновой кислоты — ДНК-содержащие и РНК-содержащие; тип симметрии капсида — изометрический (кубический), спиральный или смешанный; наличие или отсутствие суперкапсида — просто или сложно устроенные; тип хозяина — вирусы человека и животных, растений, бактерий (бактериофаги). |