Тец руководство. Руководство к практаческим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии под редакцией

• Название: Руководство к практаческим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии под редакцией
• Анкор: Тец руководство.doc
• Дата: 28.01.2017
• Размер: 2.14 Mb.
• Имя файла: Тец руководство.doc
• Тип: Руководство; #290
• страница: 2 из 20

Тема 1.1. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ, ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ, МИКОЛОГИЧЕСКИЕ, ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ЛАБОРАТОРИИ И ИХ ОБОРУДОВАНИЕ. УСТРОЙСТВО СОВРЕМЕННЫХ МИКРОСКОПОВ. МЕТОДЫ МИКРОСКОПИИ. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МОРФОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

План

Программа

Правила работы и организация микробиологических (бактериологических, вирусологических, микологи­ческих) лабораторий.

Основные приборы и оборудование микробиологичес­кой лаборатории.

Микроскопы и микроскопическая техника. Правила работы с иммерсионным микроскопом (объективами).

а Демонстрация

Устройство и применение основных приборов и обо­рудования, используемого в микробиологических ла­бораториях: термостата, центрифуг, автоклава, су­шильного шкафа, инструментария и посуды.

Устройство биологического микроскопа. Различные ме­тоды микроскопии: темнопольная, фазово-контрастная, люминесцентная, электронная.

Препараты микробов (дрожжей и бактерий) при различных методах микроскопии.

Задание студентам

1. Микроскопировать и зарисовать препараты дрожже-подобных грибов рода Candida, используя различные виды микроскопии.

Методические указания

Правила работы в микробиологических лабораториях. Работу в микробиологической лаборатории медицинского учреждения проводят с возбудителями инфекционных заболеваний — пато­генными микроорганизмами. Поэтому для предохранения от заражения персонал обязан строго соблюдать правила внутрен­него распорядка.

Все сотрудники должны работать в медицинских халатах, шапочках и сменной обуви. Вход в лабораторию без халата категорически воспрещен. В необходимых слу­чаях работающие надевают на лицо маску из марли. Ра­бота с особо опасными микробами регламентируется спе­циальной инструкцией и проводится в режимных лабора­ториях.

В лаборатории запрещается курить и принимать пищу.

Рабочее место должно содержаться в образцовомпорядке. Личные вещи сотрудников следует хранить в специально отведенном месте.

При случайном попадании инфицированного мате­риала на стол, пол и другие поверхности это место необходимо тщательно обработать дезинфицирующим раство­ром.

Хранение, наблюдение за культурами микробов и их уничтожение должны производиться согласно специаль­ной инструкции. Культуры патогенных микробов реги­стрируют в специальном журнале.

По окончании работы руки следует тщательно вы­мыть, а при необходимости обработать дезинфицирующим раствором.

Микроскопы и методы микроскопии

Для микробиологических исследований используют не­сколько типов микроскопов (биологический, люминесцент-





увеличения объектива на увеличение окуляра. Например, уве­личение микроскопа с иммерсионным объективом 90 и окуля­ром 10 составляет: 90x10=900.

Микроскопия в проходящем свете (светлопольная микроско­пия). Используется для изучения окрашенных объектов в фик­сированных препаратах.

Темнопольная микроскопия. Применяется для прижизненно­го изучения микробов в нативных неокрашенных препаратах. Микроскопия в темном поле зрения основана на явлении дифракции света при боковом освещении частиц, взвешенных в жидкости (эффект Тиндаля). Эффект достигается с помощью параболоид- или кардиоид-конденсора, которые заменяют обычный конденсор в биологическом микроскопе (рис. 1.3). При этом способе освещения в объектив попадают только лучи, отраженные от поверхности объекта. В результате на темном фоне (неосвещенном поле зрения) видны ярко светя­щиеся частицы. Препарат в этом случае имеет вид, показанный на рис. 1.4, б (на вклейке).

Фазово-контрастная микроскопия. Предназначена для изуче­ния нативных препаратов. Фазово-контрастное приспособле­ние дает возможность увидеть в микроскоп прозрачные объек­ты. Свет проходит через различные биологические структуры с разной скоростью, которая зависит от оптической плотности объекта. В результате возникает изменение фазы световой волны, не воспринимаемое глазом. Фазовое устройство, вклю­чающее особые конденсор и объектив, обеспечивает преобра­зование изменений фазы световой волны в видимые изменения амплитуды. Таким образом достигается усиление различия в оптической плотности объектов. Они приобретают высокую контрастность, которая может быть позитивной или негатив­ной. Позитивным фазовым контрастом называют темное изо­бражение объекта в светлом поле зрения, негативным — свет­лое изображение объекта на темном фоне (см. рис. 1.4; на вклейке).

Для фазово-контрастной микроскопии используют обыч­ный микроскоп и дополнительное фазово-контрастное устрой­ство КФ-1 или КФ-4 (рис. 1.5), а также специальные освети­тели.

Люминесцентная (или флюоресцентная) микроскопия. Осно­вана на явлении фотолюминесценции.

Люминесценция — свечение веществ, возникающее под воздействием внешнего излучения: светового, ультрафиолето­вого, ионизирующего и др. Фотолюминесценция — люмине­сценция объекта под влиянием света. Если освещать люминес-цирующий объект синим светом, то он испускает лучи крас­ного, оранжевого, желтого или зеленого цвета. В результате возникает цветное изображение объекта. Длина волны излуча-


Наряду с приборами "просвечивающего" типа используют сканирующие электронные микроскопы, обеспечивающие рель­ефное изображение поверхности объекта. Разрешающая спо­собность этих приборов значительно ниже, чем у электронных микроскопов "просвечивающего" типа.

Правила работы с микроскопом. Работа с любым световым микроскопом включает установку правильного освещения по­ля зрения и препарата и его микроскопию различными объек­тивами. Освещение может быть естественным (дневным) или искусственным, для чего используют специальные источники света — осветители разных марок.

При микроскопии препаратов с иммерсионным объективом следует строго придерживаться определенного порядка:

на приготовленный на предметном стекле и окрашенный мазок нанести каплю иммерсионного масла и поместить его на предметный столик, укрепив зажимами;

повернуть револьвер до отметки иммерсионного объек­тива 90х или 100х;

3) осторожно опустить тубус микроскопа до погруженияобъектива в каплю масла;

установить ориентировочный фокус при помощи макрометрического винта;

провести окончательную фокусировку препарата микро­метрическим винтом, вращая его в пределах только одного оборота. Нельзя допускать соприкосновения объектива с пре­паратом, так как это может повлечь поломку покровного стек­ла или фронтальной линзы объектива (свободное расстояние иммерсионного объектива 0,1-1 мм).

По окончании работы микроскопа необходимо удалить мас­ло с иммерсионного объектива и перевести револьвер на малый объектив 8х.

Для темнопольной и фазово-контрастной микроскопии ис­пользуют нативные препараты ("раздавленная" капля и др., см. тему 2.1); микроскопируют с объективом 40х или специальным иммерсионным объективом с ирис-диафрагмой, позволяющей регулировать численную апертуру от 1,25 до 0,85. Толщина предметных стекол не должна превышать 1-1,5 мм, покров­ных – 0,15-0,2 мм.

Глава 2

МОРФОЛОГИЯ И УЛЬТРАСТРУКТУРА БАКТЕРИЙ

Введение. Бактерии относятся к доминиону Bacteria. Они являются одноклеточными прокариотическими (доядерными) организмами. Бактериальная клетка обладает характерными особенностями строения (ультраструктуры) и существенно от­личается от эукариотической.

Бактерии имеют микроскопические размеры, большинство — в пределах разрешающей способности светооптической микро­скопии (превышают 0,2 мкм), однако существуют и более мелкие формы.

Форма клетки относится к числу важных таксономических признаков бактерии. По форме клеток бактерии подразделяют на шаровидные, палочковидные, нитевидные и извитые (рис. 2.1).

Шаровидные бактерии — кокки (coccus — зерно) имеют правильную сферическую или эллипсоидную форму. Кокки могут образовывать характерные скопления, что обусловлено особенностями их деления и способностью дочерних клеток сохранять связь друг с другом после деления. Кокки могут располагаться беспорядочно (микрококки), парами (диплокок­ки), в виде цепочек из 3 и более кокков (стрептококки), в виде пакетов, состоящих из 4 (тетракокки) и 8 (сарцины) кокков, и в виде скоплений, напоминающих виноградную гроздь (стафи­лококки).

Диплококки и стрептококки образуются при делении в одной плоскости, если дочерние клетки могут не отходить друг от друга. Упорядоченное деление в 2 и 3 плоскостях приводит к образованию тетракокков и сардин. При делении в разных плоскостях образуются стафилококки.

Палочковидные бактерии (бациллы) различаются по разме­рам, форме клеток и их концов, а также по расположению. Они могут быть тонкими, утолщенными на концах либо с обрубленными концами. Одни располагаются в виде одиноч­ных клеток, другие парами — диплобактерии, третьи в виде цепочек — стрептобактерии.

Извитые формы бактерий представлены изогнутыми палоч­ками, имеющими V4V2 завитка (вибрионы) или несколько (1-3) завитков (спириллы), и спиралевидными бактериями (спирохеты). Нитевидные и ветвистые формы характерны для актиномицетов.

Бактерии не имеют дифференцированного ядра. Нуклеоид бактерий — аналог ядра — не окружен мембраной и располага­ется в цитоплазме. Бактерии лишены внутриклеточных мем­бран и ограниченных ими органелл. Плазматическая мембрана (ПМ) является единственной мембраной, присущей всем бак­териальным клеткам. В цитоплазме бактерий свободно распо­лагаются рибосомы, могут также присутствовать включения и споры (рис. 2.2). Последние могут располагаться терминально, субтерминально и центрально. Снаружи от ПМ находится клеточная стенка (КС). По строению КС бактерии подраз­деляют на 2 группы: фирмикутные и грациликутные. КС может быть покрыта капсулой или капсулоподобной оболоч-




и др.)- Для выявления различных структур бактериальной клет­ки применяют нейтральные и кислые красители.

Различают простые и сложные методы окраски. Простые методы заключаются в окраске препарата одним красителем и позволяют изучать форму и размеры бактерий. Сложные мето­ды (по Граму, Цилю—Нильсену и др.) включают последова­тельное использование нескольких красителей и дополнитель­ных способов обработки препаратов. Тинкториальные свой­ства — способность воспринимать и удерживать красители — зависят от особенностей строения и химического состава бак­териальной клетки. Сложные методы окраски позволяют диф­ференцировать бактерии по этим признакам и имеют диагнос­тическое значение. Существуют специальные сложные методы окраски, которые используют для выявления структурных ком­понентов бактерий: жгутиков, капсул и разных цитоплазматичес-ких включений.

Методы темнопольной и фазово-контрастной микроскопии дают возможность прижизненного изучения бактерий, в част­ности их подвижности. Для этого готовят нативные (прижиз­ненные) препараты.

Электронную микроскопию используют для изучения ульт­раструктуры (тонкой организации) бактерий.

Тема 2.1. ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИИ БАКТЕРИЙ И ИХ ТИНКТОРИАЛЬНЫХ СВОЙСТВ. ПРОСТЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ

План

Программа

Морфология бактерий и методы ее изучения.

Подвижность бактерий и методы ее изучения.

Простые методы окраски препаратов.

Определение размеров бактерий.

Демонстрация

Приготовление мазков из бактериальных культур.

Красители, используемые в микробиологии.

Подвижность бактерий в препарате "висячая" капля.

Задание студентам

Микроскопировать и зарисовать готовые мазки, окра­шенные простым методом (стафилококки, стрептококки, сарцины, палочки, стрептобациллы).

Приготовить мазки из бактерий, выращенных на жид­кой и плотной питательных средах.

Окрасить мазки простым методом.

Микроскопировать и дифференцировать бактерии в мазках по основным морфологическим признакам и зарисовать их. 5. Определить размеры бактериальной клетки.

Методические указания

Приготовление препаратов для микроскопического исследова­ния. Для приготовления препарата исследуемый материал берут из пробирки, колбы или чашки Петри бактериологической петлей или стерильной пипеткой. В некоторых случаях исполь­зуют препаровальные иглы.

Петлю прокаливают в пламени горелки для уничтожения посторонних бактерий. Вращательным движением вынимают из пробирки ватную пробку, прижимая ее V и IV пальцами к ладони, и обжигают край пробирки. Осторожно вводят петлю в пробирку, охлаждая ее о внутреннюю поверхность стекла, после чего легким скользящим движением захватывают мате­риал. Затем вынимают петлю из пробирки, снова обжигают край пробирки и закрывают пробкой. После приготовления препарата петлю обязательно прожигают (стерилизуют) в пла­мени. Жидкий материал из пробирки или колбы можно наби­рать пипеткой.

Приготовление нативных препаратов для прижизненного изу­чения микроорганизмов. Метод "висячей" капли. Пре­парат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят одну каплю исследуемого материала. Затем предметное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном пре­парате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. Для микроскопии вначале используют объек­тив малого увеличения (8х или 10х), находят край капли, а затем устанавливают объектив 40х или иммерсионный и ис­следуют препарат. Определяют подвижность бактерий.

Метод "раздавленной" к а пли. На поверхность обез­жиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают ее покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за край покровного стекла.

Прижизненная (витальная) окраска. Взвесь мик­роорганизмов вносят в каплю 0,001 % раствора метиленового синего или нейтрального красного. Затем готовят препарат "висячая" или "раздавленная" капля и микроскопируют.

После микроскопии препараты "раздавленной" или "вися­чей" капли опускают в дезинфицирующий раствор.

Приготовление фиксированных препаратов-мазков. Для при­готовления препарата на обезжиренное предметное стекло на­носят суспензию (взвесь) бактерий. Если мазок готовят из

жидкой питательной среды, то материал непосредственно на­носят петлей на предметное стекло и распределяют его так, чтобы получить тонкий мазок. В других случаях первоначально на предметное стекло наносят каплю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуе­мый материал и готовят взвесь. При правильном распределе­нии материала в мазке при микроскопии видны изолирован­ные бактериальные клетки. Мазки высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем горелки, не давая капле закипать.

Фиксация препарата. Высушенные мазки подвергают термической или химической обработке, в результате которой бактерии погибают и плотно прикрепляются к поверхности стекла. Обычно для фиксации мазка предметное стекло про­водят несколько раз через пламя горелки (мазком вверх).

Мазки крови, мазки-отпечатки из органов фиксируют по­гружением на 5-20 мин в метиловый или этиловый спирт или другие фиксирующие жидкости.

Окраска препаратов простым методом. Фиксированный мазок окрасить каким-либо одним красителем, например фук­сином водным (1-2 мин) или метиленовым синим (3-5 мин), промыть водой, высушить и микроскопировать.

Приготовление и окраска препаратов для люминесцентной микроскопии. Для люминесцентной микроскопии на предмет­ных стеклах готовят фиксированные препараты-мазки или на-тивные препараты, которые окрашивают специальными флю­оресцентными красителями: акридиновым желтым, акридино­вым оранжевым, ауромином, корифосфином. При работе с иммерсионным объективом используют нефлюоресцирующее масло.

Приготовление препаратов для электронной микроскопии. Приготовление препаратов для исследования в электронном микроскопе имеет ряд особенностей. Препараты готовят на специальных пленках-подложках, так как стекло непроницае­мо для электронов. Исследуемый объект максимально очища­ют от посторонних примесей и наносят на пленку-подложку, предварительно помещенную на опорную металлическую се­точку. Для контрастирования применяют соединения тяжелых металлов (золото, осмий, рутений и др.).

Измерение микробных клеток. Измерение микробов осущест­вляют в ходе микроскопического исследования с помощью специальных приспособлений. Для измерения применяют оку­ляр-микрометр и объект-микрометр. Окуляр-микрометр слу­жит для непосредственного измерения объекта и представляет собой стеклянную пластинку в окуляре, в центральной части которой нанесена шкала с 50 делениями. Объект-микрометр представляет собой стекло, в середине которого имеется эта­лонная шкала, разделенная на 100 частей. Цена деления шкалы

Форма Разме- Окраска Наличие Кислого- Под-клеток ры по мето- устойчи- виж-ду Грама СПОР кап" зерен вость ность сул волю-тина

Спорообразующие бактерии (окраска по методу Шеффера—Фултона).

Зерна волютина в клетках Corynebacterium diphtheriae (окраска по методу Нейссера).

Задание студентам

Микроскопировать и дифференцировать бактерии по морфологическим и тинкториальным свойствам в го­товом препарате из смеси бактерий (окраска по методу
Грама). Зарисовать.

Самостоятельно приготовить мазки из смеси бакте­рий, окрасить по методу Грама, Микроскопировать и дифференцировать бактерии по морфологическим признакам и тинкториальным свойствам. Зарисовать.

Микроскопировать и зарисовать:

капсулы (окраска по методу Бурри—Гинса);

С.diphtheriae, содержащие зерна волютина (окраска по методу Нейссера);

кислотоустойчивые бактерии М. tuberculosis (окраска по методу Циля—Нильсена);

спорообразующие бактерии (окраска по методу Шеффера—Фултона).

4. Сделать заключение по результатам проведенных исследований.
Методические указания

Сложные методы окраски. Сложные методы окраски исполь­зуют для выявления ультраструктурных компонентов бактери­альных клеток, имеющих достаточно большие размеры (мак­рокапсулы, жгутики, цитоплазматические включения и т.д.), а также для дифференцировки (различения) бактерий в зависи­мости от химического состава и особенностей их тонкой орга­низации (ультраструктуры).

Окраска по методу Грама

На фиксированный мазок нанести карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильт­ровальной бумаги. Через 1—2 мин ее снять, а краситель
слить.

Нанести раствор Люголя на 1-2 мин.

Обесцветить этиловым спиртом в течение 30-60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

Промыть водой.

Докрасить водным раствором фуксина в течение 1-2 мин, промыть водой, высушить и Микроскопировать.

Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фио­летовый цвет, грамотрицательные — в красный (рис. 2.2.1; на вклейке). В основе этого метода лежит избирательное обесцве­чивание — удаление комплекса генцианового фиолетового с йодом под действием спирта. Результат окраски по методу Грама определяется особенностями строения и химического состава клеточной стенки бактерий и зависит от способности удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс генцианового фиолетового с йодом.

Фирмикутные бактерии окрашиваются грамположительно, поскольку имеют многослойный пептидогликан, связанный с тейхоевыми кислотами. Последние обусловливают прочную фиксацию красителя и резистентность к обесцвечиванию спир­том. Грациликутные бактерии окрашиваются грамотрица-тельно.

Окраска по методу Грама имеет важное дифференциально-диагностическое значение и широко используется в микробио­логии. К грамположительным бактериям относятся стафило­кокки, стрептококки, коринебактерии дифтерии и др., к грамотрицательным — гонококки, менингококки, кишечная палоч­ка и др. Некоторые виды бактерий (клостридии, гарднереллы) могут окрашиваться по методу Грама вариабельно в зависимос­ти от возраста культуры, особенностей культивирования и дру­гих факторов, воздействующих на структуру клеточной стенки.

Основная ошибка, допускаемая при окраске по методу Гра­ма, заключается в "переобесцвечивании" мазка этиловым спиртом. Грамположительные бактерии при этом могут утра­чивать первоначальную окраску генциановым фиолетовым и приобретать красный цвет (характерный для грамотрицатель-ных бактерий) в результате последующей докраски мазка фук­сином. Грамотрицательные бактерии в свою очередь могут сохранять сине-фиолетовый цвет генцианового фиолетового. Для правильной окраски следует строго соблюдать технику обесцвечивания.

Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Ниль­сена

На фиксированный мазок нанести карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подо­греть 3-5 мин до появления паров.

Снять бумагу, промыть мазок водой.

Нанести 5 % раствор серной кислоты или 3 % раствор смеси спирта с хлористоводородной кислотой на 1-2 мин. для обесцвечивания.

Промыть водой.

Докрасить мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-5 мин.

Промыть водой, высушить и микроскопировать.

В основе метода лежат протравливание (разрыхление) кле­точной стенки бактерий для усиления поглощения красителя и избирательное обесцвечивание под действием кислоты. Кис-лотоустойчивость бактерий обусловлена особым строением их клеточной стенки с повышенным содержанием липидов: разветвленных жирных кислот (миколовых кислот), глико- и фос-фолипидов, восков. Клеточная стенка кислотоустойчивых бак­терий имеет очень низкую проницаемость, поэтому они пло­хо воспринимают красители. Раствор карболовой кислоты разрыхляет клеточную стенку и тем самым повышает ее тинк-ториальные свойства, а высокая концентрация красителя и нагревание в процессе окраски усиливают реакцию взаимодей­ствия красителя с бактериальными клетками, которые при этом окрашиваются в красный цвет. При обработке препарата серной кислотой некислотоустойчивые бактерии обесцвечива­ются и в дальнейшем окрашиваются метиленовым синим в голубой цвет, а кислотоустойчивые бактерии остаются окра­шенными фуксином в красный цвет (рис. 2.2.2; на вклейке).

Окраска спор по методу Ожешко

На нефиксированный мазок нанести 0,5 % раствор хло­ристоводородной кислоты и подогреть в течение 2-3 мин. на пламени.

Кислоту слить, препарат промыть водой, просушить и фиксировать над пламенем.

Окрасить по методу Циля-Нильсена.

Споры бактерий приобретают красный цвет, а вегетативные формы — синий (рис. 2.2.3; на вклейке). Споры бактерий име­ют многослойную клеточную стенку сложного строения, прак­тически непроницаемую для красителей, поэтому для повыше­ния их тинкториальных свойств используют более жесткие условия протравливания, чем для окрашивания кислотоустой­чивых бактерий.

Окраска спор по методу Шеффера-Фултона

На фиксированный мазок нанести 5 % раствор малахитового зеленого и 3-4 раза нагреть до появления паров.

Промыть водой.

Докрасить 0,5 % сафранином в течение 30 с.

4. Промыть водой, высушить и микроскопировать. Споры бактерий окрашиваются в зеленый цвет, вегетатив­ные клетки — в красный.

Окраска зерен волютина по методу Нейссера

На фиксированный мазок нанести ацетат синьки Нейссера на 2-3 мин.

Добавить раствор Люголя на 10-30 с.

Промыть препарат водой.

Докрасить водным раствором везувина или хризоидина в течение 0,5-1 мин.

Промыть препарат водой, высушить и микроскопиро­вать.

Зерна волютина представляют собой включения полифос­фатов, имеющие в отличие от цитоплазмы щелочную реакцию, и поэтому избирательно воспринимают ацетат синьки, окра­шиваясь в темно-синий цвет. Цитоплазма клетки, обладающая кислой реакцией, воспринимает щелочной краситель везувин и окрашивается в желтый цвет (рис. 2.2.4; на вклейке). Обнаружение макрокапсул по методу Бури-Гинса

Смешать каплю взвеси микробных клеток с каплей туши и при помощи стекла со шлифованым краем сделать мазок таким же образом, как мазок из крови, высушить и фиксировать.

На мазок нанести водный раствор фуксина на 1—2 мин.

Промыть водой, высушить на воздухе и микроскопировать.

Бактерии окрашиваются в красный цвет. Капсулы не окра­шиваются анилиновыми красителями, остаются прозрачными и контрастно выделяются на черно-розовом фоне (рис. 2.2.5; на вклейке).