Тец руководство. Руководство к практаческим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии под редакцией
 Скачать 2.14 Mb.
|
|
Тема 22.1. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ИНФЕКЦИЙ, ВЫЗВАННЫХ ОНКОГЕННЫМИ ВИРУСАМИ ЧЕЛОВЕКА И ВИРУСАМИ ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА План Программа Биологические свойства онкогенных вирусов. Вирусные и клеточные онкогены и антионкогены. Роль онкогенных вирусов в патогенезе злокачественных но вообразований человека. Биологические свойства ВИЧ. Экология ВИЧ и эпидемиология ВИЧ-инфекции, группы риска. Патогенез, диагностика, принципы профилактики и лечения ВИЧ/СПИД. СПИД-ассоциированные оппортунисти ческие инфекции. а Задание студентам Ознакомиться с бланками направлений на исследование в вирусологическую лабораторию. Указать материал для диагностики ВИЧ-инфекции. Ознакомиться с тест-системами для серодиагностики ВИЧ-инфекции. Оценить результаты серодиагностики ВИЧ-инфекции методом ИФА и наметить план дальнейшего обследования. а Методические указания • Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных HPV МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: мазок-соскоб или биоптат из пораженного участка кожи или слизистой оболочки. МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ: Цитологический метод — обнаружение измененных клеток с признаками ЦПД (коилоциты). Вирусоскопический метод — обнаружение зрелых вирусных частиц в зараженных клетках. Этот метод позволяет обнаружить вирусы только в случае их репродукции. В опухолевых клетках присутствуют дефектные вирусы, не способные к репродукции. Вирусологический метод — не применяют в связи со сложностью культивирования вируса. Экспресс-методы диагностики: иммунохимические и молеку-лярно-биологические методы. Иммунохимические исследования. Обнаружение вирусных антигенов в зараженных клетках методом ИФ. Молекулярно-биологические исследования. Обнаружение вирусных ДНК в зараженных клетках — метод ДНК-зондов (ДНК-гибридизация in situ), ПЦР. Эти методы позволяют диагностировать латентную инфекцию и присутствие дефектных вирусов. Серодиагностика. С целью диагностики ЯРК-инфекции выявляют антитела к белкам капсида и вирусным онкогенам. • Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных BKV и /СУ (см. главу 21 и главу 19 соответственно) • Диагностика инфекций, вызванных HTLV МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь. МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ: Серодиагностика — обнаружение антител к вирусным белкам — применяют для выявления вирусоносительства и лабораторной диагностики тропического спастического паралича (см. также главу 19). • Микробиологическая диагностика ВИЧ-инфекции МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь, лейкоциты периферической крови, пунктах лимфатических узлов и костного мозга. Вирус также может быть обнаружен в отделяемом слизистых оболочек генитального тракта, сперме, слюне, слезной жидкости, грудном молоке, спинномозговой жидкости, в трупном материале. МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ: Вирусологический метод (схема 22.1.1). Выделение вируса из крови и лейкоцитов в связи со сложностью культивирования в клинической практике используется редко. Основным показанием к применению является раннее обнаружение вируса у новорожденных от ВИЧ-инфицированных матерей. Вирус выделяют путем совместного культивирования мононуклеарных лейкоцитов периферической крови пациента с лейкоцитами здоровых доноров в присутствии IL-2 для стимуляции роста Т-лимфоцитов. ЦПД проявляется образованием синцития и лизисом зараженных клеток. Метод позволяет выявить латентную инфекцию. О присутствии вируса судят по результатам определения специфических антигенов ВИЧ (р24, обратной транскриптазы) в культуральной среде и зараженных клетках. Культивирование ВИЧ требует соблюдения специальных условий безопасности при работе. Экспресс-методы диагностики: иммунохимические и молеку-лярно-биологические методы. Иммунохимические исследования. Обнаружение вирусных антигенов (р24) в крови и лимфоцитах с помощью ИФА. Следует учитывать, что р24 в достаточном для выявления количестве присутствует в крови только при первичной инфекции и на поздних стадиях заболевания. Молекулярно-биологические исследования. Обнаружение РНК вирусов в крови методом RT-ПЦР. Метод основан на преобразовании вирусной РНК в комплементарную ДНК (кДНК) с использованием фермента обратной транскриптазы (RT) и амплификации полученной кДНК методом ПЦР — применяется для определения уровня вирусемии. Чувствительность метода позволяет обнаруживать вирус в малых концентрациях. Серодиагностика. Обнаружение антител к вирусным антигенам (поверхностным белкам gp!20) — методы ИФА — применяют для массового обследования. В случае положительного результата с целью верификации осуществляют поиск антител к индивидуальным вирусным белкам методом иммуноблоттин-га, непрямой ИФ и другими методами. Метод иммуноблоттинга ("вестерн-блот") — тестирование сыворотки на наличие антител против отдельных вирусных антигенов сердцевины и поверхностной оболочки ВИЧ. Вирусные белки с помощью электрофореза в вертикальном блоке полиакриламидного геля разделяют по молекулярной массе и переносят на нитроцеллюлозную мембрану, где антитела сыворотки реагируют с индивидуальными вирусными белками. Образующиеся иммунные комплексы выявляются авторадио-графически или с помощью ИФА. Для косвенного подтверждения диагноза СПИД могут быть использованы методы оценки иммунного статуса: определение общего количества лимфоцитов, Т-лимфоцитов, соотношения CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов, количества натуральных киллеров, уровней сывороточных иммуноглобулинов. Для СПИД характерно развитие Т-клеточного дефицита: снижение количества Т-лимфоцитов, преимущественно Т-хелперов CD4+ (менее 500/мм3), снижение уровня показателя CD4+/CD8+ ниже 1,0; уменьшение количества натуральных киллеров; умеренная поликлональная гипергаммаглобулинемия с увеличением содержания IgG. • Диагностические, профилактические и лечебные препараты Тест-системы для диагностики ВИЧ/СПИД методом ПЦР. Тест-системы для серодиагностики ВИЧ/СПИД методом ИФА. Тест-системы для диагностики папилломавирусной инфекции методом ПЦР. Противовирусные препараты: Ингибиторы обратной транскриптазы: азидотимидин (AZT), ди-дезоксиинозин (DDI), дидезоксицитидин (DDC), невирапин и др. Ингибиторы протеазы: саквинавир, ритонавир, индинавир, нелфинавир и др. Препараты для иммунотерапии: интерферон человеческий лейкоцитарный; интерферон рекомбинантный. Глава 23 ВОЗБУДИТЕЛИ МИКОЗОВ Заболевания, вызываемые грибами (myces), — микозы, чрезвычайно разнообразны как по биологическим особенностям их возбудителей, так и по патогенезу и клиническим проявлениям (табл. 23.1). Важную роль в развитии микозов играют иммунодефицитные состояния, изменения экологических факторов. Некоторые грибы рассматриваются как возбудители вторичных инфекций, например при ВИЧ/СПИД, а также имеют значение при развитии дисбактериоза. Лабораторная диагностика микозов проводится в микологических лабораториях или в специализированных микологических центрах.
Определение видовой принадлежности грибов рода Candida. РСК и реакция агглютинации при диагностике висцерального кандидоза с парными сыворотками. Морфология и культуральные свойства плесневых и других грибов (рост на плотных питательных средах). Диагностические, профилактические и лечебные препараты. а Задание студентам Указать материал для исследования. Микроскопировать и зарисовать препараты дрожжеподобных грибов рода Candida, приготовленные из чистой культуры и патологического материала. Определить видовую принадлежность грибов рода Candida на основании морфологии клеток и колоний, типа филаментации и биохимических свойств. Оценить результаты РСК для серодиагностики висцерального кандидоза. Сделать заключение. Дать краткую характеристику демонстрируемым диагностическим, профилактическим и лечебным препаратам. а Методические указания • Микробиологическая диагностика кандидоза МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: налет со слизистых оболочек, кожные чешуйки из очага поражения, мокрота, моча, спинномозговая жидкость, кровь и др. МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ: Микроскопическое исследование. При исследовании препаратов используют окраску простыми методами, а также по методам Романовского—Гимзы, Грама и др. Грибы рода Candida хорошо окрашиваются анилиновыми красителями. При необходимости исследуют нативные препараты. В нативных и окрашенных препаратах видны одноклеточные микроорганизмы круглой или овальной формы. Микологическое (культуральное) исследование. Делают посев исследуемого материала на агар Сабуро или другие специальные среды. Посевы инкубируют при 20 и 37 "С. Рост колоний начинается на 2—3-й сутки, и окончательное формирование происходит через 5—6 дней. Идентификацию грибов рода Candida проводят на основании морфологии клеток, типа филаментации и биохимических свойств (табл. 23.1.1). Важное диагностическое значение имеют многократные количественные посевы исследуемого материала. Нарастающее количество колоний в посевах подтверждает диагноз.
 Trichophyton (Achorion) schoenleinii (фавус или парша) — в волосе обнаруживают полиморфные грибковые элементы. Наряду с тонким мицелием встречается мицелий широкий, состоящий из прямоугольных клеток. Часто наблюдаются споры круглой или прямоугольной формы, а также пузырьки воздуха. Epidermophyton floccosum (эпидермофития паховая) — элементы гриба содержатся в чешуйках кожи, где располагаются в виде толстых септированных ветвящихся нитей мицелия наряду со спорами многогранной формы. Микологическое (культуральное) исследование. Проводят для установления родовой и видовой принадлежности возбудителя путем выделения чистой культуры гриба и изучения его биологических свойств. Материал предварительно обрабатывают кислотами или антибиотиками. Затем делают посев на сахарный питательный агар, сусло-агар, агар Сабуро, овощные среды (см. тему 4.1), куда добавляют антибиотики для задержки роста бактериальной флоры. Посевы инкубируют при 30 "С. В положительных случаях рост наблюдается на 3—5-е сутки в виде разнообразных колоний: гладких, морщинистых, мучнистых, пушистых, часто пигментированных. При микроскопии препаратов, приготовленных из культур, хорошо заметен развитой, широко ветвящийся септированный мицелий. Органами размножения служат споры, которые могут быть как внутренними (эндоспоры), расположенными внутри мицелия, так и наружными (экзоспоры), расположенными на концах или по сторонам нитей мицелия. Специальных органов плодоношения типа асков (сумок) у дерматофитов не обнаружено, что дало основание отнести их к несовершенным грибам — Fungi imper-fecti. • Микробиологическая диагностика глубоких (системных) микозов МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: мокрота, моча, пораженные ткани, биоптаты кожи и лимфатических узлов, спинномозговая жидкость и др. МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ: Микроскопическое исследование. Обнаружение овальных дрожжевых или других тканевых форм грибов позволяет поставить предварительный диагноз. Иммунофлюоресцентный метод является наиболее эффективным способом выявления возбудителя в патологическом материале (см. ниже). Микологическое исследование. Производят посев материала на среду Сабуро, кровяной агар и другие среды. Посевы инкубируют в течение нескольких недель при 37 и 20 "С. Выделенные культуры идентифицируют на основании морфологических и 347 биохимических признаков. Грибы, вызывающие глубокие микозы, относятся к группе возбудителей ООИ, представляющих биологическую опасность IV степени (см. главу 11). Необходимо помнить, что лабораторная диагностика этих инфекций осуществляется только в специализированных лабораториях. Экспресс-методы диагностики: иммунохимические и молеку-лярно-биологические исследования. Иммунохимические исследования. При криптококкозе определяют антиген в спинномозговой жидкости и в сыворотке крови (у больных ВИЧ/СПИД) в динамике заболевания. Молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить предварительный диагноз. Серодиагностика. Проводят для определения антител, которые обнаруживаются в сыворотке крови через 2—4 нед после начала заболевания. Обычно используют РСК, РНГА, реакции иммунодиффузии, ИЭФ и др. Кожно-аллергические пробы. Применяют для выявления состояния ГЗТ к соответствующим аллергенам. • Диагностические, профилактические и лечебные препараты Кандидозный антиген — взвесь 2-суточной агаровой культуры грибов рода Candida в изотоническом растворе хлорида натрия. Применяют для постановки реакции агглютинации для серодиагностики кандидоза. Кандидозный антиген для РСК — спиртово-водный экстракт из культуры гриба рода Candida. Применяют для постановки РСК и кожно-аллергических проб при кандидозе. Противогрибковые препараты: полиеновые антибиотики (нистатин, леворин, амфотерицин В), кетоконазол, флуконазол и другие производные имидазола, полиоксины, эхинокандины, 5-фторцитозин, гризеофульвин. Глава 24 ВОЗБУДИТЕЛИ ПРОТОЗОЙНЫХ ИНФЕКЦИЙ Патогенные простейшие относятся к эукариотам, которые по структуре близки к клеткам животных. Простейшие относятся к царству Protozoa. К основным патогенным простейшим — возбудителям заболеваний человека относятся дизентерийная амеба, лямблии, трихомонады, лейшмании, трипаносомы, плазмодии малярии, токсоплазма, балантидии. Простей-
Тема 24.1. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ПРОТОЗОЙНЫХ ИНФЕКЦИЙ План Программа Изучение схем-фотографий патогенных простейших. Диагностические и лечебно-профилактические препараты. Демонстрация Мазки из влагалища для выявления Trichomonas vaginalis. Серодиагностика лейшманиоза (ИФА). Серодиагностика токсоплазмоза (РСК, РПГА). Задание студентам Микроскопировать дофашс'й'ные по методу Романовского-Гимзы мазкая из одержимого влагалища. Сделать заключение^'цЙ^ид трихомониаза. Учесть результы серодогических реакций, поставленных для^ё^^^гн^стй'ки лейшманиоза и токсоплазмоза. О^елад^заййючение. а Методические указния МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: в качестве материала для диагностики кишечных протозойных инфекций (амебиаз, лямблиоз, балантидиаз, криптоспоридиоз) используют фекалии, а также материал из различных отделов кишечника: двенадцатиперстной, сигмовидной, ободочной кишки — аспираты, биоптаты, мазки с пораженных участков слизистой оболочки, желчь. При абсцессах, вызванных Entamoeba histolytica, получают пунктат из полости абсцесса. Для диагностики трихомониаза исследуют мазки со слизистой оболочки урогенитального тракта. При генерализованных протозойных инфекциях (лейшманиоз, трипаносомоз, малярия, токсоплазмоз) материалом является кровь, пунктаты лимфатических узлов, био-птаты из пораженных органов, спинномозговая жидкость. МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ: Микроскопическое исследование. Основным методом лабораторной диагностики протозойных инфекций является микроскопический — обнаружение присутствия возбудителя в материале, полученном от больного, с помощью микроскопических методов и идентификация его по морфологическим признакам. Готовят как нативные препараты, позволяющие изучить подвижность возбудителя, так и фиксированные препараты, окрашенные различными сложными методами. Для диагностики некоторых протозойных инфекций (трихомониаз, амебиаз, криптоспоридиоз) разработаны методы иммунофлюо-ресценции. Серодиагностика. Поиск антител в крови больных используется для диагностики генерализованных форм протозойных инфекций, а также для подтверждения диагноза (при отрицательных результатах микроскопического исследования). Применяют различные серологические реакции (РСК, РПГА, метод непрямой ИФ, ИФА и др.). |