Тец руководство. Руководство к практаческим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии под редакцией
Скачать 2.14 Mb.
|
Глава 17 ВОЗБУДИТЕЛИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ТРАНСМИССИВНЫХ ИНФЕКЦИЙ К возбудителям бактериальных трансмиссивных инфекций относятся бактерии, которые передаются людям при участии переносчиков — кровососущих членистоногих: комаров, москитов, клещей, вшей и др. (табл. 17.1). При этом членистоногие являются промежуточными или основными природными хозяевами возбу-
нами из R.prowazekii и R.typhi. Сопоставить результаты и обосновать диагноз заболевания. 4. Учесть результаты РСК, поставленных для дифференциации первичного эпидемического сыпного тифа и рецидива (болезнь Брилля—Цинссера). Сделать заключение по результатам серодиагностики. а Методические указания • Микробиологическая диагностика возвратного тифа МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь. МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ: Бактериоскопическое исследование. Основной метод лабораторной диагностики возвратного тифа. У больного во время приступа болезни берут кровь и готовят препараты для микроскопии. Мазки окрашивают фуксином, а препарат "толстая" капля — по методу Романовского—Гимзы. Borrelia recurrentis представляют собой тонкие изогнутые нити длиной 8—16 мкм с 4—12 завитками (рис. 17.1.1; на вклейке). В мазках они окрашиваются фуксином в красный цвет, в препарате "толстая" капля — в фиолетово-розовый. Кроме того, рекомендуется исследовать нативные препараты в темном поле. Биопроба. Используют для дифференциальной диагностики эпидемического возвратного тифа от клещевого, к возбудителям которого чувствительны лабораторные животные. Кровью больных заражают морских свинок. Через 5—6 дней при положительном результате (клещевой возвратный тиф) в крови животных появляется большое количество боррелий. Серодиагностика имеет дополнительное значение, для выявления антител применяют РСК, метод непрямой ИФ и другие реакции. • Микробиологическая диагностика клещевого боррелиоза Лайма МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: биоптаты из пораженных участков кожи, кровь, спинномозговая жидкость; гемолимфа инфицированного клеща. МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ: Бактериоскопическое исследование. На ранних стадиях заболевания в биоптатах из пораженных участков кожи возбудитель может быть обнаружен методом серебрения. По морфологии В. burgdorferi не отличается от других представителей рода. Бактериологическое исследование. В.burgdorferi культивируют на жидких и плотных питательных средах сложного состава (среда Келли и др.). Для идентификации возбудителя используют биохимические и молекулярно-генетические методы (гель-электрофорез для анализа белков наружной мембраны, ДНК-гибридизацию, рестрикционный анализ ДНК). Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохимические и молекулярно-биологические исследования. Иммунохимические исследования. Антигены возбудителя в био-птатах из пораженных участков кожи или гемолимфе инфицированного клеща могут быть обнаружены методом ИФ. Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить предварительный диагноз. Серодиагностика. Для обнаружения антител в крови больного применяют методы непрямой ИФ и ИФА. МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь, аспират из высыпных элементов. МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ: Бактериоскогшческое исследование. Для обнаружения рик-кетсий в организме переносчика, органах зараженных животных и культурах клеток готовят препараты, окрашивают их по методам Романовского—Гимзы, Здродовского или другими методами и микроскопируют. R.prowazekii полиморфны. В зависимости от стадии инфекции, вида культуры в цитоплазме зараженных клеток встречаются различные морфологические типы риккетсий. Использование иммунофлюоресцентного метода (см. ниже) облегчает обнаружение риккетсий. Бактериологическое исследование. Материалом для выделения возбудителей при всех видах риккетсиозов служит кровь, взятая у больного в раннем периоде лихорадки (схема 17.1.1). Первичное выделение риккетсий осуществляется путем заражения лабораторных животных (мышей, морских свинок и др.). Выбор зависит от вида возбудителя, поскольку лабораторные животные различаются по чувствительности к риккетсиям разных видов. Для дальнейшего культивирования первичного изолята используют культуры клеток или куриные эмбрионы. Культивирование риккетсий производится только в специальных лабораториях, требует соблюдения определенных правил безопасности и практически применяется редко. Биопроба. Применяют для дифференциации возбудителей эндемических риккетсиозов от R.prowazekii. Для этого самцу морской свинки внутрибрюшинно вводят кровь больного. При большинстве эндемических риккетсиозов у животных развивается специфический периорхит, сопровождающийся накоплением риккетсий в мезотелии влагалищных оболочек яичка (положительный скротальный феномен). Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохимические и молекулярно-биологические исследования. Иммунохимические исследования. Возбудитель может быть обнаружен в аспирате из высыпных элементов, а также в цитоплазме моноцитов периферической крови методом иммунофлюо-ресценции. Положительные результаты удается получить в 50 % случаев заболевания. Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью метода "зондов" и ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить предварительный диагноз. Серодиагностика. Является наиболее распространенным и доступным методом лабораторной диагностики риккетсиозов. Для обнаружения антител в крови больного применяют реакции агглютинации, РКС и РИГА, непрямой иммунофлюоре-сценции, ИФА и др. (см. схему 17.1.1, тему 10.4). Реакция агглютинации применяется при серодиагностике всех риккетсиозов и характеризуется высокой специфичностью. В отличие от РСК РИГА не позволяет провести внутри-групповую дифференциацию риккетсиозов. Однако РИГА может быть использована для определения фазы заболевания, поскольку гемагглютинирующие антитела накапливаются в высоком титре в ходе инфекционного процесса, титр их быстро падает в период реконвалесценции, а через 6 мес после выздоровления они исчезают. Использование РСК в сочетании с РИГА позволяет дифференцировать текущее заболевание от перенесенного в прошлом (анамнестического). Серодиагностика позволяет дифференцировать первичный (эпидемический) сыпной тиф от рецидива сыпного тифа (болезни Брилля—Цинссера) на основании особенностей иммунного ответа. При первичной инфекции образуются антитела, относящиеся к иммуноглобулинам класса М, тогда как при рецидиве антитела представлены преимущественно иммуноглобулинами класса G. Метод ИФА позволяет избирательно выявлять противомикробные IgM или IgG в сыворотке больных. • Микробиологическая диагностика эрлихиозов МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь. МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ: Цитологическое исследование. В лейкоцитах периферической крови больных при окраске по методу Романовского— Гимзы могут быть обнаружены характерные гроздьевидные включения — морулы, напоминающие ягоды ежевики. Бактериологическое исследование. Эрлихии культивируют путем заражения клеточных культур (первичные культуры моноцитов собак, перевиваемые линии мышиных макрофагов, клетки HeLa, промиелоцитарные опухолевые клетки человека и др.). В зараженных клетках появляются характерные включения, которые выявляют при окраске по методу Романовского— Гимзы. Для идентификации используют иммунохимичес-кие и молекулярно-биологические методы (ПЦР, метод ДНК-зондов). Метод культивирования эрлихий редко применяют с диагностической целью по причине трудоемкости. Экспресс-методы диагностики. Биохимические и молекулярно-биологические исследования. ДНК возбудителя может быть обнаружена непосредственно в крови и лейкоцитах больного с помощью метода "зондов" и ПЦР. Серодиагностика. Антитела к антигенам эрлихий в сыворотке крови пациентов могут быть обнаружены с помощью метода непрямой ИФ (диагностический титр 1:40) и других серологических реакций. Необходимо помнить, что антитела в диагностических титрах могут длительно сохраняться после выздоровления, поэтому для подтверждения диагноза применяют метод парных сывороток. • Микробиологическая диагностика бартонеллезов (см. тему 16.1 "Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных Bartonella hensella") МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: кровь, биоптаты пораженных органов, лимфатических узлов. МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ: Бактериоскопическое, бактериологическое исследование, экспресс-методы диагностики см. тему 16.1 "Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных Bartonella hensella". Серодиагностика. Антитела к антигенам бартонелл в сыворотке крови пациентов могут быть обнаружены с помощью ИФА, метода непрямой ИФ и других серологических реакций. Необходимо помнить, что антитела могут присутствовать в крови практически здоровых лиц, поэтому для подтверждения диагноза применяют метод парных сывороток. Для обнаружения IgM используют метод непрямой ИФ. • Диагностические, профилактические и лечебные препараты Тест-системы для диагностики возвратного тифа и болезни Лайма методом ДНК-зондов. Флюоресцирующие антитела для диагностики возвратного тифа и болезни Лайма методом ИФ. Тест-системы для серодиагностики возвратного тифа и болезни Лайма методом непрямой ИФ. Тест-системы для диагностики эрлихиозов методом ДНК-зондов. Флюоресцирующие антитела для диагностики эрлихиозов методом ИФ. Тест-системы для серодиагностики эрлихиозов методом ИФА. Тест-системы для серодиагностики эрлихиозов методом непрямой ИФ. Антибиотики: пенициллины, тетрациклины, хлорамфеникол, фторхинолоны, макролиды и др. Глава 18 ВОЗБУДИТЕЛИ РЕСПИРАТОРНЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ Возбудители респираторных вирусных инфекций относятся к различным семействам ДНК- и РНК-содержащих вирусов (табл. 18.1). Они объединены в одну группу на основании способности проникать в организм преимущественно через слизистую оболочку верхних дыхательных путей и вызывать поражения различных отделов респираторного тракта — острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ): риниты, фарингиты, ларингиты, трахеиты, бронхиты, а также пневмонии. Генерализованная инфекция с выраженной вирусемией наблюдается лишь при тяжелых формах заболевания, возникающих на фоне иммунодефицитов различной природы (врожденные иммунодефицита, тяжелые сопутствующие заболевания, СПИД и др.), а также в младенческом и старческом возрасте на фоне физиологического иммунодефицита. Таблица 18.1. Вирусы-возбудители респираторных инфекций Название вируса Вызываемые заболевания ДНК-вирусы СЕМЕЙСТВО Adenoviridae аденовирусы серотипов 1—39 ОРВИ, пневмония, отит, конъ- юнктивит; гепатит и другие системные инфекции при им-мунодефицитах СЕМЕЙСТВО Herpesviridae ПОДСЕМЕЙСТВО Alphaherpesvirinae Фарингит, тонзиллит, трахео- вирус простого герпеса 1-го типа бронхит; пневмония при имму- (HSV-1) нодефицитах и др. (см. главу 21)
3. Диагностические и лечебно-профилактические препараты. а Демонстрация Иммунофлюоресцентный метод экспресс-диагностики гриппа и ОРВИ. Риноцитоскопия при гриппе и аденовирусной инфекции. Диагностические и лечебно-профилактические препараты. а Задание студентам Ознакомиться с бланками-направлениями на исследование в вирусологическую лабораторию. Указать материал для исследования, необходимый для диагностики ОРВИ. Оценить результаты реакции гемагглютинации с материалом зараженного куриного эмбриона (амниотической и аллантоисной жидкостью), поставленной с целью индикации вируса гриппа. Учесть результаты идентификации выделенного вируса гриппа в РТГА. Сделать заключение. Учесть результаты идентификации аденовирусов, выделенных в культуре клеток, в РСК. Учесть результаты серодиагностики респираторных вирусных инфекций в РСК. Ознакомиться с диагностическими и лечебно-профилактическими препаратами. Указать механизм их действия. а Методические указания • Микробиологическая диагностика гриппа и других респираторных вирусных инфекций МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: отделяемое из респираторного тракта, мазки и смывы со слизистой оболочки верхних дыхательных путей, промывные воды бронхов, мокрота. МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ: Цитологическое исследование. Мазки, приготовленные из исследуемого материала, окрашивают по методу Романовского—Гимзы или другими методами и микроскопируют. В положительном случае наблюдаются признаки ЦПД вирусов. Поскольку большинство респираторных вирусов оказывают неспецифическое ЦПД (дегенерация и лизис зараженных клеток), метод является малоспецифичным и имеет ориентировочное значение. Цитологическое (риноцитоскопическое) исследование применяют как ориентировочный экспресс-метод лабораторной диагностики гриппа. С поверхности нижней носовой раковины берут мазки-отпечатки. Препараты окрашивают смесью основного фуксина и метиленового синего. В цитоплазме цилиндрического эпителия, а также в цитоплазме дегенерированных макрофагов и лейкоцитов располагаются широко контуриро-ванные включения, окрашенные в красный цвет. Данный метод позволяет дифференцировать грипп от аденовирусной инфекции, при которой наблюдаются деструкция клеток, вакуолизация ядер и образование внутриядерных включений. Вирусологическое исследование. Исследуемый материал помещают в транспортную среду, содержащую антимикробные препараты широкого спектра действия для уничтожения сопутствующей бактериальной флоры. Затем материал центрифугируют. Для выделения чистой культуры производят заражение культур клеток надосадочной жидкостью. В зависимости от предполагаемого возбудителя используют разные типы клеточных культур: клетки человека (первичные культуры эмбриональных клеток, диплоидные линии фибробластов, перевиваемые клеточные линии Не La, НЕр-2 и др.) или животных (первичные культуры клеток почки обезьян, линии мышиных фибробластов и др.). Культивирование респираторных вирусов может занимать от 2—3 до 20 сут и более в зависимости от природы возбудителя. Так, выделение аденовирусов занимает в среднем 6 сут, риновирусов — 4—5 сут, вируса гриппа — 3—4 сут, реовирусов — около 3 нед. Индикацию вирусов производят по ЦПД. Для индикации гемагглютинирующих вирусов (грипп, парагрипп) может быть использована реакция гем-адсорбции (см. тему 5.2), которая становится положительной еще до появления ЦПД. Идентификацию респираторных вирусов осуществляют по их антигенной структуре с помощью иммунологических методов [иммунофлюоресценция, РТГА, РСК, реакция нейтрализации (РН), ИФА и др.]. Эти же реакции используют для типирования выделенных вирусов. Применяют также биохимические (анализ фрагментов вирусных НК методом электрофореза) и молекулярно-биологические методы идентификации (ПЦР, метод нуклеиновых зондов). Вирусологическое исследование не применяется для диагностики заболеваний, вызванных коронавирусами и РСВ, в связи со сложностью их культивирования. В ряде случаев для выделения вируса гриппа используют куриные эмбрионы. Наличие вирусов гриппа в амниотической или аллантоисной жидкости устанавливают с помощью РГА (см. тему 5.2). Вирусы гриппа А хорошо агглютинируют эритроциты курицы, морской свинки, человека с группой крови 1(0), вирусы гриппа В — эритроциты курицы. Этот метод позволяет также установить титр вируса. Идентификацию и типирование выделенной чистой культуры вируса гриппа осуществляют на основании антигенной структуры с помощью серологических реакций. Тип вируса (А, В или С) определяют в РСК. Подтипы вируса гриппа А по Н- и N-антигенам (HON1, H1N1, H2N2, H3N2 и др.) - в реакциях с набором типоспецифических сывороток к гемаг-глютинину и нейраминидазе (см. табл. 10.1.2 и 10.1.3). Идентификацию по Н-антигену проводят в РТГА, результаты реакции учитывают по отсутствию гемагглютинации. Для определения N-антигена применяют реакцию ингибиции нейрамини-дазы и реакцию иммунопреципитации в геле. Результаты РТГА (рис. 18.1.1; на вклейке), приведенные в табл. 10.1.3, свидетельствуют, что гемагглютинирующая активность исследуемого вируса нейтрализуется типоспецифической сывороткой N3H2 в разведениях 1:10—1:160 (до ее титра), т.е. исследуемый вирус относится к подтипу N3H2. Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохимические и молекулярно-биологические исследования. Иммунохимические исследования. Метод ИФ является высокоспецифичным, универсальным в отношении разных возбудителей методом экспресс-диагностики (схема 18.1.1). Он позволяет обнаружить антигены вируса-возбудителя заболевания непосредственно в инфицированных клетках, присутствующих в исследуемом материале. Используют прямой и непрямой методы ИФ (см. тему 10.1). Из исследуемого материала готовят мазки на нескольких предметных стеклах. Носоглоточные смывы предварительно центрифугируют и из осадка, содержащего зараженные клетки, готовят мазки. Препараты обрабатывают различными флюоресцирующими антителами (против вирусов гриппа А, В, против вирусов парагриппа II и III типов, против РСВ, поливалентной противоаденовирусной сывороткой и др.) и изучают методом люминесцентной микроскопии. В положительном случае внутри клеток обнаруживают светящиеся вирусные включения и обращают внимание на их внутриклеточную локализацию. Так, при аденовирусной инфекции включения располагаются преимущественно в ядре зараженных клеток, при гриппе и парагриппе — в цитоплазме. Присутствие вирусных антигенов в исследуемом материале может быть выявлено с помощью чувствительных серологических реакций: ИФА, РИА и др. Молекулярно-биологические исследования. Вирусные НК в исследуемом материале обнаруживают с помощью ПЦР или метода ДНК-зондов. Серодиагностика. Диагностика респираторных вирусных инфекций осуществляется методом парных сывороток. Кровь берут на 1-й и 3-й неделе от начала заболевания. Диагностическое значение имеет нарастание титра специфических противовирусных антител в поздней сыворотке не менее чем в 4 раза. Серодиагностика при ОРВИ носит ретроспективный характер, поскольку накопление антител происходит в период реконва-лесценции — через 2—3 нед после начала заболевания. Метод
• Диагностические, профилактические и лечебные препараты Тест-системы для выявления антигенов респираторных вирусов (гриппа, парагриппа, респираторно-синцитиального) методом ИФ. Типоспецифические гриппозные сыворотки HON1, H1N1, H2N2, H3N3, В и С. Применяют для серотипирования вирусов гриппа в РТГА и РСК. Типоспецифические парагриппозные сыворотки. Используют для идентификации и серотипирования вирусов парагриппа. Типоспецифические аденовирусные сыворотки. Применяют для серотипирования аденовирусов в реакции нейтрализации. Сухие Типоспецифические диагностикумы (гриппозный и парагриппозный). Используют для серодиагностики соответствующих инфекций. Аденовирусные диагностикумы. Применяют для серодиагностики аденовирусной инфекции. Живая гриппозная вакцина. Готовят из аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, зараженных вакцинными штаммами вируса гриппа основных серотипов. Применяют для профилактики гриппа (создание активного иммунитета). Вакцину вводят через нос или рот. Убитая гриппозная вакцина. Инактивированные формалином цельные вирионы вакцинного штамма вируса гриппа, выращенного в культуре клеток. Вакцинный штамм получают ежегодно на основании данных эпидемиологического анализа с учетом предполагаемого направления антигенной изменчивости вируса. Применяют для профилактики гриппа (создание активного иммунитета). Расщепленные гриппозные вакцины. Получают путем инактивации цельных вирионов вируса гриппа вакцинного штамма (см. выше) с последующим разрушением и очисткой компонентов. Вакцина содержит основные протективные антигены вируса гриппа — гемагглютинин, нейраминидазу, а также ряд дополнительных белков (Ml, NP). Применяют для создания активного иммунитета с целью профилактики гриппа. Субъединичные гриппозные вакцины. Содержит основные протективные антигены вируса гриппа (гемагглютинин и нейраминидазу), полученные методом генной инженерии. Состав антигенов ежегодно обновляется с учетом предполагаемого направления антигенной изменчивости вируса. Лечебно-профилактическая поливалентная гриппозная сыворотка. Получена путем гипериммунизации лошадей вирусами гриппа разных серотипов. Выпускают в сухом виде в смеси с антибиотиками и сульфаниламидами. Применяют интраназаль-но с целью экстренной профилактики гриппа и для лечения больных в начале заболевания (создание пассивного иммунитета). Противогриппозный донорский иммуноглобулин. Готовят из сыворотки крови доноров, иммунизированных живой гриппозной вакциной типов А и В. Применяют для экстренной профилактики и лечения гриппа в эпидемических очагах. Иммуноглобулин нормальный человеческий. Получают путем фракционирования крови здоровых доноров. Неспецифический препарат, содержащий антитела различной специфичности. Применяют для профилактики ОРВИ (пассивный иммунитет). Противовирусные препараты: Интерферон человеческий лейкоцитарный (получают из культуры лейкоцитов человека, обработанных интерфероногеном); интерферон рекомбинантный; неовир и другие индукторы интерферона. Применяют для профилактики и лечения гриппа и других вирусных респираторных заболеваний. Ремантадин. Назначают для профилактики и лечения гриппа в первые дни заболевания. Рибавирин. Применяют для лечения пневмонии, вызванной РСВ. Арилдон и другие производные 3-метил-изоксазола. Применяют для лечения риновирусных инфекций. |