|
|
Тец руководство. Руководство к практаческим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии под редакцией
Тема 15.1. ВОЗБУДИТЕЛИ СИФИЛИСА И МЯГКОГО ШАНКРА
План
Программа
Биологические свойства возбудителей сифилиса и мягкого шанкра, их патогенность, экология, особенности инфекции и эпидемиология вызываемых заболеваний.
Микробиологическая диагностика.
Диагностические, профилактические и лечебные препараты.
а Демонстрация
Treponema pallidum — мазок из отделяемого твердого шанкра, окраска T.pallidum методом серебрения (или микрофотография в темном поле).
Haemophilus ducreyi — мазок из отделяемого мягкого шанкра, окраска по методу Грама и метиленовым синим.
Диагностические и лечебные препараты.
Задание студентам
Указать материал для исследования.
Зарисовать демонстрируемые препараты возбудителей сифилиса и мягкого шанкра.
Серодиагностика сифилиса:
учесть результаты реакции Вассермана. Сделать заключение.
учесть результаты реакции микропреципитации.
Сделать заключение.
оценить результаты реакции иммобилизации трепонем (РИТ). Сделать заключение.
4. Дать краткую характеристику диагностическим и лечебным препаратам.
Методические указания
• Микробиологическая диагностика сифилиса
МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: отделяемое шанкра (I период заболевания); аспират из высыпных элементов, пунк-тат регионарных лимфатических узлов (II период); кровь (II, III, IV период); спинномозговая жидкость (IV период заболевания).
247
следуемой инактивированной сывороткой крови или плазмой. В лунку на пластине из плексигласа (или на обычное стекло) наносят 3 капли сыворотки и добавляют 1 каплю кардиолипинового антигена. Смесь тщательно перемешивают и учитывают результаты. Положительная реакция характеризуется образованием и выпадением хлопьев разной величины; при отрицательном результате наблюдается равномерная легкая опалесценция. Положительная реакция микропреципитации позволяет поставить предварительный диагноз и направить пациента на дальнейшее обследование.
Реакцию Вассермана ставят одновременно с двумя антигенами: 1) специфическим, содержащим антиген возбудителя — разрушенные ультразвуком трепонемы; 2) неспецифическим — кардиолипиновым. Исследуемую сыворотку разводят в соотношении 1:5 и ставят РСК по общепринятой методике. При положительной реакции наблюдается задержка гемолиза, при отрицательной — происходит гемолиз эритроцитов, интенсивность реакции оценивается соответственно от (++++) До (-).
Первый период сифилиса является серонегативным и характеризуется отрицательной реакцией Вассермана. У 50 % больных реакция становится положительной не ранее чем через 2—3 нед после появления твердого шанкра. Во II и III периоде сифилиса частота положительных реакций достигает 75—90 %. После успешно проведенного курса лечения реакция Вассермана становится отрицательной.
Для диагностики поздних и латентных форм сифилиса можно ставить реакцию Вассермана, используя спинномозговую жидкость, с теми же антигенами, что и в реакции с сывороткой больного.
РИФ —реакция непрямой ИФ—является специфической при диагностике сифилиса. В качестве антигена используют взвесь тканевых трепонем. Разработаны разные методики постановки реакции; обычно используют модификацию РИФ-200. Сыворотку больного инактивируют так же, как для реакции Вассермана, и разводят в соотношении 1:200. На предметные стекла наносят каплю антигена, высушивают и фиксируют 5 мин в ацетоне. Затем на препарат наносят сыворотку больного, через 30 мин промывают и высушивают. Следующим этапом является обработка препарата флюоресцирующей сывороткой против иммуноглобулинов человека. Изучают препарат с помощью люминесцентного микроскопа, отмечая степень свечения трепонем.
Реакция иммобилизации трепонем также является специфической. Принцип реакции заключается в угнетении движения трепонем (иммобилизация) антителами сыворотки крови пациента в присутствии комплемента. Живую культуру
250
трепонем получают при культивировании в яичке кролика. Яичко зараженного животного измельчают в специальной среде, в которой трепонемы сохраняют подвижность. Ставят реакцию следующим образом: взвесь тканевых (подвижных) трепонем смешивают в пробирке с исследуемой сывороткой и добавляют свежий комплемент. В одну контрольную пробирку вместо исследуемой сыворотки добавляют сыворотку здорового человека, в другую — вместо свежего комплемента добавляют инактивированный. После инкубации при 35 °С в анаэробных условиях (анаэростат) из всех пробирок готовят препарат "раздавленная" капля и в темном поле определяют количество подвижных и неподвижных трепонем. Процент специфически иммобилизированных трепонем определяют по формуле:
Т -Т
Х= \ °хЮО, Ч
где Tfc — число подвижных трепонем в контроле (с инактиви-рованным комплементом), Т0 -— число подвижных трепонем в опыте (с активным комплементом). Результат реакции считают положительным, если процент иммобилизации выше 50, слабоположительным — от 31 до 50, сомнительным — от 21 до 30 и отрицательным — ниже 20. Для обнаружения специфических антител к T.pallidum используют и другие серологические реакции, в частности РИГА.
Необходимо отметить, что в широкой медицинской практике при обследовании больных и здоровых лиц обычно используют реакцию Вассермана и микропреципитации; РИТ, РИФ и другие специфические реакции применяют для уточнения диагноза и проводят в специализированных лабораториях.
• Микробиологическая диагностика мягкого шанкра
МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: отделяемое из язвы (мягкого шанкра).
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:
Бактериологическое исследование. Проводят путем микроскопии мазков, окрашенных по методу Грама и метиленовым синим. Наличие в мазках грамотрицательных бактерий, располагающихся в виде длинных цепочек, позволяет подозревать наличие возбудителя — H.ducreyi.
Бактериологическое исследование. Проводят путем выделения чистой культуры возбудителя. Материал засевают на кровяной агар или другие среды, содержащие дефибринированную кровь. На этих средах H.ducreyi через 48—72 ч образует мелкие круглые колонии, окруженные зоной гемолиза. Идентификацию выделенной культуры проводят по ферментации Сахаров
251
и по способности агглютинироваться сывороткой этого же больного.
Кожно-аллергическая проба. Ставят с антигеном из H.ducreyi для подтверждения диагноза.
• Диагностические, профилактические и лечебные препараты
Антигены для реакции Вассермана:
специфический антиген из тканевых трепонем, разрушенных ультразвуком;
неспецифический кардиолипиновый антиген — высокоочищенный экстракт бычьего сердца, имеющий постоянный химический состав липидов, смешанных в определенной про
порции с лецитином и холестерином.
Антигены разводят согласно инструкции и используют в рабочих-дозах, указанных на этикетках. Кардиолипиновый антиген используют также и в реакции микропреципитации.
Антибиотики: пенициллин, цефотаксим, тетрациклины, эритромицин.
Тема 15.2. ВОЗБУДИТЕЛИ ГОНОРЕИ, УРОГЕНИТАЛЬНОГО ХЛАМИДИОЗА, МИКОПЛАЗМОЗА И УРЕАПЛАЗМОЗА
План
Программа
Биологические свойства возбудителей гонореи, урогенитального хламидиоза и уреаплазмоза; их патогенность, экология, особенности инфекции и эпидемиология вызываемых заболеваний.
Лабораторная диагностика.
Диагностические и лечебные препараты.
Демонстрация
Neisseria gonorrhoeae — в мазках из чистой культуры и уретрального гноя, окраска по методу Грама.
Chlamydia trachomatis — в мазках со слизистой оболочки мочеиспускательного канала (иммунофлюоресцентный метод или окраска по методу Романовского-Гимзы).
"Пестрый" ряд для определения биохимических свойств N. gonorrhoeae.
Колонии Mycoplasma hominis на питательной среде (или фотографии этих колоний).
ИФА для серодиагностики урогенитальных инфекций, вызванных хламидиями и микоплазмами.
Диагностические и лечебные препараты.
252
а Задание студентам
Указать материал для исследования.
Микроскопировать и зарисовать мазок из уретрального гноя, окрашенный по методу Грама, сделать заключение.
Зарисовать демонстрируемый мазок со слизистой оболочки мочеиспускательного канала. Сделать заключение.
Оценить результаты ИФА при урогенитальных инфекциях, вызванных хламидиями и микоплазмами. Сделать заключение.
Дать краткую характеристику демонстрируемым диагностическим и лечебным препаратам.
а Методические указания
• Микробиологическая диагностика гонореи
МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: гнойное отделяемое, мазки со слизистых оболочек мочеполовых органов и прямой кишки, суставной и перитонеальный экссудат, отделяемое конъюнктивы глаза при бленнорее.
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:
Бактериоскопическое исследование. Материал для исследования должен быть максимально быстро доставлен в лабораторию во избежание аутолиза гонококков, которые очень чувствительны к изменению температуры и охлаждению. Из материала готовят мазки, окрашивают их по методу Грама, а также метиленовым синим (схема 15.2.1). При положительном результате в мазках обнаруживают грамотрицательные диплококки бобовидной формы, находящиеся внутри лейкоцитов (рис. 15.2.1; на вклейке). Положительный бактериоскопический диагноз ставится в основном при острой форме гонореи до применения антибиотиков. При хронической гонорее бактерио-скопическое исследование часто дает отрицательный результат, так как в этих случаях возбудители могут иметь атипичную форму в виде шаров или, наоборот, очень мелких образований. Кроме того, в препарате обнаруживают разнообразную постороннюю микрофлору, лейкоциты, эпителиальные и другие клеточные элементы.
Бактериологическое исследование. Материал засевают на чашки Петри со специальными питательными средами — КДС, сывороточным агаром и др. Среда КДС содержит питательный агар с добавлением казеина, дрожжевого экстракта и сыворотки крови. Посевы инкубируют при 37 "С в атмосфере с повышенным содержанием СО2 (не менее 3 %) в течение 24—72 ч. Гонококки образуют круглые прозрачные колонии, напоминающие капли росы в отличие от более мутных колоний стреп-
253
тококков или пигментированных колоний стафилококков, которые также могут расти на этих средах. Подозрительные колонии пересевают в пробирки на соответствующие среды для получения чистых культур, которые идентифицируют по саха-ролитическим свойствам на средах "пестрого" ряда (полужидкий агар с сывороткой и углеводом) или с помощью микротест-систем. Гонококки ферментируют только глюкозу с образованием кислоты.
Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохимические и молекулярно-биологические исследования. Иммунохимические исследования. Антигены возбудителя могут быть обнаружены в исследуемом материале с помощью чувствительных иммунологических методов (иммуноблотинг и ДР-).
Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить предварительный диагноз. ДНК возбудителя в материале может быть обнаружена также методом гибридизации со специфическим ДНК-зондом.
• Микробиологическая диагностика урогенитального хлами-диоза
МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: мазки со слизистой оболочки мочеиспускательного канала, выделения из шейки матки, соскобы, отпечатки и др.
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:
Цитологическое исследование. Препараты, содержащие клетки, окрашивают по методу Романовского—Гимзы. В положительном случае в клетках эпителия обнаруживают цитоплазма-тические включения — микроколонии возбудителя, которые могут содержать как ретикулярные (сетчатые) тельца, так и элементарные тельца. Внеклеточные элементарные тельца таким способом не выявляются. Микроскопия окрашенных препаратов имеет ориентировочное значение.
Бактериологическое исследование. Чистую культуру хлами-дий из исследуемого материала выделяют путем заражения культур клеток McCoy, HeLa и других линий. После инкубации в течение 48 ч определяют включения возбудителя в клетках иммунофлюоресцентным методом. Выделение хламидий в культуре клеток имеет важное диагностическое значение, позволяет выявить жизнеспособные хламидий и определить их чувствительность к антимикробным препаратам.
Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохимические и молекулярно-биологические исследования. Иммунохимические исследования. Метод ИФ позволяет обна-ружить антигены хламидий в зараженных клетках. Препараты 'из исследуемого материала обрабатывают мечеными МКАТ. В люминесцентном микроскопе хорошо видны ярко-зеленые скопления элементарных и ретикулярных телец (внутриклеточные микроколонии), контрастно выделяющиеся на красновато-коричневом фоне эпителиальных клеток.
Антигены возбудителя в исследуемом материале могут быть выявлены с помощью чувствительных серологических реакций (ИФА и др.).
Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить предварительный диагноз.
Серодиагностика. Основана на определении антител к хла-мидиям в сыворотке крови методами ИФА, РСК, РИГА. В качестве антигенов используют родоспецифические антигены (ЛПС), полученные из хламидий, диагностический титр 1:64. ИФА применяют так же, как дополнительный серологический метод при дифференциальной диагностике урогенитальных инфекций, вызванных хламидиями и микоплазмами.
• Микробиологическая диагностика микоплазмоза и уреаплазмоза
МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: выделения и мазки со слизистой оболочки мочеиспускательного канала, сперма, выделения из шейки матки, осадок мочи.
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:
Бактериологическое исследование. Проводят путем посева исследуемого материала на богатые элективные питательные среды сложного состава, содержащие нативные добавки (экстракт из плаценты, триптический перевар бычьего сердца, сыворотку и т.д.). Для посева исследуемого материала используют плотные, полужидкие и жидкие среды. В последнем случае в среду добавляют индикатор для контроля роста, поскольку накопление микоплазм не сопровождается выраженным помутнением. С целью подавления роста других бактерий добавляют антибиотики группы пенициллина (пенициллин 100 ЕД/мл и др.), не активные в отношении микоплазм. Посевы инкубируют при 37 "С в течение 48 ч. На плотных средах микоплазмы образуют микроколонии в виде яичницы-глазуньи с врастающим в среду центром и полупрозрачной периферией, которые обнаруживают путем микроскопии посевов при малом увеличении (объектив 8х). Идентификацию выделенной культуры возбудителя проводят по биохимическим (ферментация углеводов, разложение аргинина) и антигенным свойствам в реакции ингибирования роста культуры специфической сывороткой и нейтрализации метаболизма аргинина той же сывороткой. M.hominis в отличие от других видов микоплазм не ферментирует углеводы и разлагает аргинин. Уреаплазмы вызывают гидролиз мочевины.
Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохимические и молекулярно-биологические исследования. Иммунохимические исследования. Антигены возбудителя могут быть обнаружены непосредственно в материале от больного в реакциях ИФА.
Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить предварительный диагноз.
Серодиагностика. Основана на определении антител к ми-коплазмам и уреаплазмам в сыворотке крови методами ИФА. Используется также как дополнительный серологический метод при дифференциальной диагностике урогенитальных инфекций, вызванных хламидиями и микоплазмами.
• Диагностические и лечебные препараты
Гонококковая вакцина. Взвесь N. gonorrhoeae, убитых нагреванием. Используют для вакцинотерапии хронической гонореи, а также для "провокации" при диагностике этого заболевания.
Флюоресцирующие антитела для диагностики урогениталь-ного хламидиоза методом ИФ.
Тест-системы для серодиагностики негонококковых уретритов методом ИФА.
Антибиотики: пенициллины, цефалоспорины (цефтриаксон), спектиномицин, тетрациклины, макролиды природные и полусинтетические, фторхинолоны.
Глава 16
ВОЗБУДИТЕЛИ ЗООАНТРОПОНОЗНЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ
К зооантропонозным инфекциям относятся заболевания, источником которых являются животные (млекопитающие и птицы) — больные и бактерионосители. Возбудители этих заболеваний принадлежат к разным порядкам, семействам и родам бактерий. Пути и способы передачи этих инфекций от животных людям также различны (табл. 16.1).
Возбудитель Заболе- Свой- Источник Пути заражения вание ства инфекции человека
Brucella Бруцел- Гр— , Крупный и мел- Алиментарный, melitensis, лез А кий рогатый скот, контактный, Brucella abor- свиньи аэрогенный tus, Brucella suis
Francisella Туляре- Гр-, Грызуны: мыши- Алиментарный, tularensis мия А полевки, водяные контактный, крысы, домашние трансмиссивный, мыши, зайцы аэрогенный
Yersinia pestis Чума Гр, Грызуны многих Трансмиссивный А видов, человек (блохи), контактный, алиментарный, воздушно-капельный
Yersinia Псевдо- Гр— , Грызуны, человек Алиментарный pseudotu- тубер- А berculosis кулез
Yersinia Кишеч- Гр-, Зайцы, кролики, » enterocolitica ный А собаки, человек иереи- ; ниоз Bacillus Сибир- Гр+, Овцы, козы, Контактный, anthracis екая А крупный рогатый аэрогенный, язва скот и др. трансмиссивный (слепни) Burkholderia Гр— , Лошади Контактный mallei A Pasteurella Пастер- Гр-, Кошки, собаки При укусе multocida релез А
Leptospira Лепто- Гр-, Грызуны, парно- Алиментарный, interrogans спироз А копытные контактный
Listeria mono- Листе- Гр+, Грызуны, коро- Алиментарный, cytogenes риоз А вы, лошади, соба- контактный, ки, кошки аэрогенный
Chlamydophi- Пнев- Гр- Птицы Аэрогенный la psittaci мония
Coxiella Пнев- Гр— Собаки, кошки, » burnetii мония другие млекопитающие Spirillum Содоку Гр— Кр*ысы При укусе minus
Streptobacil- Лихо- Гр-, » То же 1ш monilifor- радка от А mis укуса крысы
|
Возбудитель Заболе- Свой- Источник Пути заражения вание ства инфекции человека
Erysipelothrix Эризи- Гр-, Свиньи и другие Контактный rhusiopathiae пелоид А виды домашних и диких животных Bartonella Болезнь Гр— Кошки Укус или царапи-henselae коша- на чьей царапины
|
бораторной диагностики сибирской язвы является бактериологический (выделение из исследуемого материала культуры возбудителя). Диагностическую ценность представляет также кож-но-аллергическая проба.
Возбудители лептоспироза относятся к порядку Spirocha-etales роду Leptospira. Патогенные лептоспиры относятся к виду L.interrogans, включающему более 160 сероваров, объединенных в несколько групп. Чаще всего заболевания у человека вызывают L.interrogans серогруппы icterohaemorrhagica — возбудитель желтушного лептоспироза (болезнь Васильева—Вейля) и L.interrogans серогруппы grippotyphosa — возбудитель безжелтушного лептоспироза (водная лихорадка).
|
|
|
Скачать 2.14 Mb.