Тец руководство. Руководство к практаческим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии под редакцией

• Название: Руководство к практаческим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии под редакцией
• Анкор: Тец руководство.doc
• Дата: 28.01.2017
• Размер: 2.14 Mb.
• Имя файла: Тец руководство.doc
• Тип: Руководство; #290
• страница: 12 из 20

Тема 13.2. ВОЗБУДИТЕЛИ БРЮШНОГО ТИФА, ПАРАТИФОВ И ИЕРСИНИОЗОВ. ДИСБАКТЕРИОЗ

Современная классификация бактерий рода Salmonella. Род

Salmonella включает 2 вида: S.enterica (2307 сероваров) и S.bon-gori (17 сероваров). Вид S.enterica включает 5 подвидов: enterica (I), salamae (И), arizonae (Ilia), diarisonae (Illb), houtenae (IV), indica (V), которые вьщелены на основании молекулярно-гене-тических признаков (гибридизационного анализа ДНК) и фе-нотипически различаются по биохимическим свойствам. Внут­ри подвидов сальмонеллы подразделяются на серовары по О-и Н-антигенам согласно классификации Кауфмана—Уайта. Не­обходимо помнить, что представители разных подвидов могут иметь общие или идентичные антигены. Абсолютное большин­ство сероваров (1367) относятся к подвиду enterica. Согласно ранее существовавшей классификации, сальмонеллы — предста­вители различных сероваров — рассматривались как самостоя­тельные виды и имели собственные видовые названия. В на­стоящее время старые видовые названия используют для обо­значения биоваров (сероваров), например S.enterica подвида enterica серовара typhimurium соответствует S.typhimurium, cepo-вара typhi — S.typhi, серовара paratyphi A — S.paratyphi А и т.д. Природным резервуаром бактерий S.enterica подвида enterica являются теплокровные животные, для остальных — холодно­кровные животные и окружающая среда. Возбудители заболе­ваний человека относятся к подвиду enterica.

С эпидемиологической точки зрения сальмонеллы, вызы­вающие заболевания человека, относят к трем основным груп­пам. Первая группа включает 3 биовара: typhi, paratyphi А и С, которые являются возбудителями строгих антропонозов (ин­фицируют только человека и передаются от человека к чело­веку прямо или опосредованно — через пищу, воду). Вторая группа включает серовары, которые адаптировались к опреде­ленному виду животных. Некоторые из этих сероваров пато­генны для человека (dublin, gallinarum, schottmulleri и др.). К третьей группе относятся большинство сероваров, не имею­щих специфических хозяев и способных инфицировать как человека, так и животных. По клинической классификации сальмонеллы подразделяют на возбудителей брюшного тифа (биовар typhi) и паратифов (биовары paratyphi А, С и schottmul­leri) и возбудителей сальмонеллезов, включающих все осталь­ные биовары сальмонелл, патогенных для человека. Большин­ство возбудителей сальмонеллезов относится к третьей группе по эпидемиологической классификации.

План

Программа

Биологические свойства возбудителей брюшного тифа, паратифов и иерсиниозов. Их патогенность, экология, особенности инфекции и эпидемиология вызываемых заболеваний. Дисбактериоз.

Лабораторная диагностика.

Диагностические, профилактические и лечебные препараты.

Демонстрация

Мазки из чистых культур возбудителей кишечных ин­фекций: Salmonella enterica биоваров typhi, paratyphi A, typhimurium, Proteus vulgaris. Окраска по методу Грама.

Диагностические и лечебно-профилактические пре­параты.

Задание студентам

Микроскопировать и зарисовать мазки из чистых культур возбудителей кишечных инфекций.

Лабораторная диагностика кишечных инфекций.

2.1. Диагностика брюшного тифа и паратифов.


А. Бактериологическая диагностика:

выбрать материал для исследования;

учесть результаты первичного посева исследуемого материала на среду Раппопорт;

учесть результаты пересева бактерий со среды Раппопорт на среду Эндо. Описать и зарисо­вать колонии, выросшие на среде Эндо, и обо­сновать выбор подозрительных колоний для
дальнейшего исследования;

учесть результаты пересева подозрительных ко­лоний со среды Эндо на среду Ресселя;

учесть результаты идентификации выделенной чистой культуры по биохимическим свойствам;

сделать вывод и наметить план дальнейшего исследования.

Б. Серодиагностика. Проанализировать результаты реакции Видаля.

2.2. Бактериологическая диагностика сальмонеллезов:

выбрать материал для исследования;

учесть результаты первичного посева исследуемого материала на висмут-сульфит агар. Опи­сать и зарисовать колонии и обосновать выбор подозрительных колоний для дальнейшего ис­следования;

учесть результаты пересева подозрительных ко­лоний на среду Ресселя;

учесть результаты идентификации выделеннойчистой культуры по биохимическим свойствам;

сделать вывод и наметить план дальнейшего исследования.

3. Ознакомиться с диагностическими и лечебно-профи­лактическими препаратами.

Методические указания

• Микробиологическая диагностика брюшного тифа и пара-тифов

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: исходя из особеннос­тей патогенеза брюшного тифа, на 1-й неделе заболевания, в период бактериемии, возбудителей выделяют из крови (полу­чение гемокультуры), со 2-й недели заболевания — из испраж­нений (получение копрокультуры), мочи или желчи.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериологическое исследование (схема 13.2.1).

Получение гемокультуры. В 1-й день из локтевой вены больного берут 5—10 мл крови и засевают в колбу с 50—100 мл селективной среды Раппопорт, содержащей желчный бульон (для подавления роста других бактерий), глюкозу, индикатор Андреде и поплавок для обнаружения газа. Указанные соотно­шения крови и среды необходимы для подавления бактерицид­ного действия белков крови. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 18—20 ч. На 2-й день при росте сальмонелл наблюда­ется помутнение и изменение цвета среды. При росте парати­фозных бактерий (биоварыparatyphi А, Си schottmuelleri) наряду с указанными изменениями появляются пузырьки газа в по­плавке. Для ускорения ответа из среды Раппопорт делают маз­ки и препараты "висячая" капля. При наличии чистой культу­ры грамотрицательных подвижных палочек и изменении цвета среды (или наличии газа) дают первый предварительный ответ. Затем культуру из среды Раппопорт пересевают в пробирку со средой Ресселя, полагая при этом, что из крови выделена чистая культура и можно сразу приступить к ее идентифика­ции. Одновременно со среды Раппопорт делают посевы на среду Эндо для получения изолированных колоний с целью проверки чистоты выделенной культуры.

На 3-й день отмечают ферментацию глюкозы на среде Рес­селя и ставят ориентировочную реакцию агглютинации на сте­кле. На основании полученных данных дают второй предвари­тельный ответ. Для дальнейшего исследования отбирают не­сколько бесцветных колоний со среды Эндо и пересевают их в среду Ресселя или скошенный питательный агар (для кон­троля полученных результатов). Чистую культуру пересевают на среды "пестрого" ряда и серотипируют в реакции агглюти­нации на стекле со смесью групповых сывороток, а затем с

Биовар Ферментация Образование S. enterica 1 1 i \ i лак- глю- маль- саха- ман- H2S NH3 индо- тозы козы тозы розы нита ла ТурЫ -КК-К + --ParatyphiA - КГ КГ - КГ - - -Schottmuelleri - КГ КГ - КГ + + -

Род Лизин- Ферментация углеводов р- декар- 1 1 1 1 1 Галак- бокси- дуль- сор- кси- рам- сали- 4 % този- лаза цита бита лозы нозы цина лактозы даза Salmonella ± К(-) К К К - - -Citrobacter - K(-) К К К К(±) К(±) К Hafnia + - - К К К(±) - К

товая или висмут-сульфит агар). Для посева петлю фекалий вносят в пробирку с изотоническим раствором хлорида натрия и готовят суспензию. После оседания крупных комочков сус­пензию петлей наносят на поверхность агаровой среды — на одну половину чашки. Материал тщательно растирают шпате­лем по одной, а затем по другой половине чашки для получе­ния изолированных колоний. Посевы инкубируют при 37 "С в течение 18—20 ч. На 2-й день изучают характер колоний, выросших на чашках (рис. 13.2.1; на вклейке), пересевают 2—3 бесцветные колонии (со среды Эндо или Левина) или колонии черного цвета (висмут-сульфит агар) на среду Ресселя и в пробирки со скошенным питательным агаром. При отсутствии подозрительных колоний на чашках делают высевы из среды Мюллера или селенитовой среды на чашки со средой Эндо для получения изолированных колоний. Для ускорения ответа ста­вят ориентировочную реакцию агглютинации на стекле с ма­териалом, взятым из бесцветной колонии. Далее поступают так же, как и при идентификации гемокультуры.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования. Молеку-лярно-биологические исследования. Исследуемый мате­риал, полученный из очага инфекции, используют для обнару­жения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаруже­ния соответствующих молекул можно поставить предваритель­ный диагноз.

Серодиагностика. В лабораторной практике широко приме­няют развернутую реакцию агглютинации Видаля, основанную на обнаружении в сыворотке крови людей антител — агглюти­нинов, которые появляются в конце 1-й — начале 2-й недели заболевания. Реакцию ставят одновременно с четырьмя анти­генами: О- и Н-брюшнотифозными, А- и В-паратифозными диагностикумами. Брюшнотифозные монодиагностикумы при­меняют для установления стадии болезни, так как содержание О- и Н-антител в разные ее периоды неодинаково. О-антитела появляются на 1-й неделе, накапливаются в разгар заболевания и исчезают к моменту выздоровления. Н-антитела появляются в разгар заболевания, накапливаются к концу заболевания и сохраняются у переболевших в течение длительного времени. У людей, вакцинированных против брюшного тифа и парати-фов, также наблюдается положительная реакция Видаля, при­чем в довольно высоком титре, поэтому "инфекционный Ви-даль" удается отличить от "прививочного" только по нараста­нию титра агглютининов у больных в процессе заболевания. Реакцию Видаля ставят в четырех рядах пробирок по 7 проби­рок в каждом ряду, из которых 5 опытных и 2 контрольные. Для контроля каждого диагностикума в пробирки вносят по 1 мл изотонического раствора хлорида натрия, в который до­бавляют 2 капли диагностикума. В контрольной пробирке с 1 мл сыворотки (без диагностикума) не должно быть хлопьев. При спонтанной агглютинации реакция не учитывается. Диа­гностический титр реакции Видаля равен 1:200. Для серологи­ческого исследования реконвалесцентов и выявления бакте­рионосителей широко используют реакцию непрямой К/'-гемаг-глютинации, с помощью которой в сыворотке крови людей определяют присутствие антител к К/-антигену. В качестве антигена используют эритроцитарный И-диагностикум, пред­ставляющий собой взвесь эритроцитов человека 1(0) группы, обработанных формалином и сенсибилизированных И-антиге-ном S.enterica биовара typhi. Готовят разведения испытуемой сыворотки от 1:10 до 1:1280. При положительной реакции эритроциты покрывают дно пробирки в виде диска с зазубрен­ными краями, а надосадочная жидкость остается прозрачной. При отрицательной реакции, так же как и в контроле, эрит­роциты осаждаются на дно пробирки и имеют вид диска с ровными краями ("пуговки"). Диагностическое значение имеет титр пассивной К/-гемагглютинации, начиная с 1:40 и выше. Всех лиц, сыворотка крови у которых дает положительный результат в РИГА с эритроцитарным К/-диагностикумом, рас­сматривают как подозрительных на носительство S.enterica биовара typhi и подвергают многократному бактериологическо­му обследованию.

• Микробиологическая диагностика сальмонеллезов

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: испражнения, при генерализованной форме — кровь.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ: микробиологическая диагнос­тика сальмонеллезов принципиально не отличается от диа­гностики брюшного тифа и паратифов. Серодиагностика не применяется по причине большого числа сероваров возбуди­телей.

• Микробиологическая диагностика кишечного иерсиниоза

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: испражнения, при генерализованной форме — кровь, моча, спинномозговая жид­кость.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериологическое исследование. Посев материала на диф­ференциально-диагностические (среда Эндо, Мак-Конки, СБТС-агар с желчью и бромтимоловым синим) и селективные (CIN-агар с антибиотиками цефсулодином и новобиоцином) плотные среды или жидкие среды обогащения (буферно-казе-иново-дрожжевой бульон, 1 %, пептонная вода с рН 7,6—7,8). Посевы инкубируют при 25 "С в течение 24—48 ч. Идентифи­кация чистой культуры осуществляется на основании морфо­логии, подвижности, тинкториальных свойств (грамотрицательные палочки с закругленными концами и характерным биполярным окрашиванием, неспорообразующие, перитрихи), культуральных, биохимических признаков.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования. Молеку-лярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить пред­варительный диагноз.

Серодиагностика. Диагностическое значение имеет обнару­жение антител к поверхностным антигенам возбудителей наи­более распространенных серотипов (ОЗ, О4, О5, Об, О8, О9) в РА. Положительной считается РА в титре не менее 1:160. Разработаны также ИФА-тесты.

• Микробиологическая диагностика кишечного дисбактериоза

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: фекалии. МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование. Имеет ориентировочное значение. При резко выраженном дисбактериозе в мазках пре­обладают микроорганизмы определенных видов (например, дрожжеподобные грибы, стафилококки и др.) на фоне сущест­венного уменьшения грамотрицательной микрофлоры.

Бактериологическое исследование. Проводится количествен­ное исследование состава микрофлоры кишечника. Для этого из исследуемого материала готовят разведения 10², 10⁴, 10^ и т.д. Первичные посевы по 0,1 мл каждого разведения про­изводят параллельно на несколько питательных сред (Эндо, кровяной агар, ЖСА, агар Сабуро и др.) и инкубируют при 37 °С. Подсчитывают число выросших колоний и определяют число КОЕ в 1 г материала. Проводят отсев 2—3 колоний каждого вида для выделения и идентификации чистых культур микроорганизмов.

Для обнаружения анаэробных Bifidobacterium spp, делают мерные посевы материала в разведениях 10⁷ и выше в про­бирки с 13—15 мл модифицированной среды Блаурокка, в со­став которой входит печеночный бульон, пептон — 1 %, лакто­за — 1 %, хлорид натрия — 0,5 %, цистин — 0,01 %, агар-агар — 0,75%, твин-80 — 0,1 %. При росте Bifidobacterium spp. через 24—48 ч происходит помутнение всей среды с образованием тяжей или отдельных колоний. Готовят мазки и окрашивают по методу Грама. Выделение чистых культур Bifidobacterium spp. является весьма трудоемким и практически необязатель­ным. При необходимости идентификацию представителей рода осуществляют по биохимическим свойствам.

Для оценки результатов бактериологического исследования

Микроорганизмы Норма Патогенные микробы сем. Enterobacteriaceae 0 Общее количество E.coli, млн/г 300—400 E.coli со слабовыраженными ферментативными свойствами, % До 10 E.coli с гемолитическими свойствами, % Нет Энтеробактерии (лактозоотрицательные и лактозополо-жительные): Hafhia, Aerobacter, Citrobacter, Klebsiella, Serratia, % До 5 Кокковые формы, % До 25 Гемолитический стафилококк по отношению ко всем кокковым формам, % Нет Bifidobacterium spp. (рост при посеве разведения) 10 и выше Бактерии рода Proteus Нет Грибы рода Candida Нет

Получают так же, как и другие диагностические сыворотки. Применяют для серотипирования сальмонелл в реакции аг­глютинации.

Сальмонеллезные О- и Н-монодиагностикумы. Представляют собой взвеси сальмонелл, убитых нагреванием (О-диагностику-мы) или обработкой формалином (Н-диагностикумы). Применя­ют для серодиагностики брюшного тифа в реакции Видаля.

Типовые сальмонеллезные бактериофаги. Применяют для фа-готипирования сальмонелл.

Брюшнотифозная моновакцинд и брюшнотифозная спиртовая вакцина, обогащенная Vi-антигеном. Применяют для специфи­ческой активной профилактики брюшного тифа.

Поливалентный брюшнотифозный бактериофаг. Выпускается в виде таблеток с кислотоустойчивым покрытием. Применяют для экстренной профилактики брюшного тифа.

Коли-бактерин. Содержит лиофильно высушенные живые клетки E.coli штамма М17, обладающего выраженными анта­гонистическими свойствами в отношении ряда патогенных ки­шечных бактерий. Применяют для нормализации кишечной микрофлоры при дисбактериозе и лечении дизентерии, глав­ным образом у детей.

Бифидумбактерин. Содержит лиофильно высушенную взвесь живых клеток B.bifidum. Применяют для лечения хронических кишечных инфекций невыясненной этиологии у детей и ди­зентерии.

Бификол. Содержит смесь высушенных живых бактерий E.co­li штамма М17 и B.bifidum. Показания к применению те же.

Лактобактерин. Содержит продукты жизнедеятельности лак-тобактерий. Выпускается в таблетированном виде. Применяют для лечения дисбактериозов у детей.

Антибиотики: сульфаниламиды, полусинтетические пени-циллины, цефалоспорины 2—4-го поколения, хлорамфеникол, тетрациклины, фторхинолоны, полимиксин.
Тема 13.3. ВОЗБУДИТЕЛИ ПИЩЕВЫХ

ТОКСИКОИНФЕКЦИЙ, ИНТОКСИКАЦИЙ, ХОЛЕРЫ

И ДРУГИХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ
План

Программа

Биологические свойства возбудителей холеры, пищевых токсикоинфекций и интоксикаций. Их патогенность, экология, особенности инфекции и эпидемио­логия вызываемых заболеваний.

Лабораторная диагностика.

Диагностические, профилактические и лечебные пре­параты.

Демонстрация

Мазки из чистых культур возбудителей пищевых ин­токсикаций кишечных инфекций: Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Vibrio cholerae. Окраска по методу Грама.

Диагностические и лечебно-профилактические пре­параты.

Задание студентам

Микроскопировать и зарисовать мазки из чистых культур возбудителей кишечных инфекций.

Бактериологическая диагностика холеры.
Указать материал для исследования.

Идентификация чистой культуры вибрионов, вы­деленных от больного:

изучить морфологические и тинкториальные свойства: микроскопировать мазок из чистой
культуры, выделенной от больного;

изучить антигенные свойства: отметить резуль­таты развернутой реакции агглютинации с диа­гностической 01-сывороткой;

изучить биохимические свойства: отметить ре­зультат гексаминового теста;

определить чувствительность выделенной куль­туры к диагностическим бактериофагам;

отметить способность к росту на среде с полимиксином;

дать заключение.

3. Диагностика ботулизма:

указать материал для исследования;

проанализировать результаты РИГА для обнаруже­ния ботулотоксина в сыворотке крови больного
(реакция Бойдена). Дать заключение.

4. Ознакомиться с диагностическими и лечебно-профи­лактическими препаратами.

Методические указания

• МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ПИЩЕВЫХ ТОКСИКОИНФЕКЦИЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПРИРОДЫ

• Микробиологическая диагностика пищевых токсикоинфек-иий, вызванных Escherichia spp., Salmonella spp., Proteus spp,

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: фекалии, рвотные мас­сы, промывные воды желудка больного, остатки пищевых про­дуктов — возможные источники и факторы передачи инфек­ции.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериологическое исследование. Производят путем посева

материала на дифференциально-диагностические и элективные среды (Эндо, висмут-сульфит агар и др.) для выделения чистой культуры сальмонелл и эшерихии, а также в конденсационную воду в пробирке со скошенным питательным агаром для вы­явления бактерий рода Proteus. После инкубации посевов при 37 °С в течение 20—24 ч отмечают цвет колоний на чашках с дифференциальной средой и наличие "ползучего" роста, ха­рактерного для Proteus spp., в пробирке со скошенным пита­тельным агаром. Подозрительные колонии пересевают на ско­шенный питательный агар для получения чистых культур и одновременно ставят с ними ориентировочную реакцию агг­лютинации на стекле, используя смеси диагностических сыво­роток. На следующий день с чистой культурой ставят развер­нутую реакцию агглютинации с соответствующей монорецеп-торной сывороткой и делают посев на среды "пестрого" ряда. При выделении одного и того же серовара сальмонелл или эшерихии из организма больных людей и пищевого продукта делают окончательное заключение об этиологии пищевой ток-сикоинфекции — источнике заболевания. При наличии "пол­зучего" роста на скошенном питательном агаре из конденса­ционной воды петлей берут материал для приготовления пре­парата "висячая" капля с целью установления подвижности и для мазка, который окрашивают по методу Грама и микроско-пируют. Затем выделяют чистую культуру, определяют биохи­мические и другие признаки и устанавливают вид: P.vulgaris, P.mirabilis, P.morganii и P.rettgeri.

Оценка роли условно-патогенных микроорганизмов в этио­логии пищевых токсикоинфекций должна быть строго аргу­ментирована: а) бактериологическим, серологическим, эпиде­миологическим и клиническим исключением сальмонеллезов, дизентерии, холеры; б) выделением идентичных штаммов ус­ловно-патогенных бактерий из рвотных масс, промывных вод желудка, испражнений, продуктов.

• МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ПИЩЕВЫХ ИНТОКСИКАЦИЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПРИРОДЫ

• Микробиологическая диагностика стафилококковых пище­вых интоксикаций

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: рвотные массы, про­мывные воды желудка, подозрительные пищевые продукты.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования. Иммуно­химические исследования. Диагностика основана на об­наружении энтеротоксина в исследуемом материале. Энтеро-токсин Staphylococcm spp. экстрагируют изотоническим раствором хлорида натрия, затем определяют его присутствие и се­рологическую специфичность реакцией преципитации в геле с иммунными антитоксическими сыворотками А, В, С. Техника постановки реакции описана выше (см. рис. 10.1.6). Исполь­зуют также латекс-агглютинацию, ИФА, РИА и др.

Бактериологическое исследование. С целью выделения чис­той культуры стафилококка исследуемый материал, который может содержать жизнеспособные бактерии, засевают в чашки с ЖСА. Полученные по схеме (см. тему 12.1) чистые культуры проверяют на способность продуцировать энтеротоксины. Для эпидемиологического анализа массовых стафилококковых ин­токсикаций проводят фаготипирование выделенных культур с помощью набора стафилококковых фагов.

Биопроба. Для обнаружения энтеротоксина можно исполь­зовать биопробу — скормить изучаемый материал котятам-со­сункам, у которых стафилококковый энтеротоксин вызывает рвоту и понос через 30—60 мин после скармливания.

• Микробиологическая диагностика пищевых интоксикаций,
вызванных C.perfringens типа А

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: подозрительные пи­щевые продукты (мясные, рыбные и др.), испражнения, рвот­ные массы, промывные воды желудка.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериологическое исследование. Поскольку энтеротоксин C.perfringens типа А выделяется в процессе спорообразования в кишечнике больного и быстро разрушается, обнаружить его в продуктах или материале от больного практически не удается. Основным методом диагностики является бактериологический. Выделение чистой культуры производят стандартным методом (см. тему 12.2). Диагностическое значение имеет обнаружение большого количества бактерий в материале от больного и по­дозрительном продукте.

• Микробиологическая диагностика ботулизма

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: сыворотка крови, мо­ча, испражнения, промывные воды желудка, остатки пищи или подозреваемые продукты (колбасы, мясные, рыбные, фрукто­вые, овощные консервы и др.).

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования. Иммуно­химические исследования. Диагностика основана на об­наружении ботулотоксина в исследуемом материале. С этой целью ставят реакцию Бойдена — РИГА с эритроцитами, на­груженными моновалентными антитоксическими противобо-тулиническими сыворотками типов А, В, Е. В качестве кон­троля используют нормальную сыворотку крови. Для выявле­ния ботулотоксина могут быть использованы также ИФА и другие чувствительные серологические реакции.

Биопроба. Для обнаружения ботулотоксина в пищевых про­дуктах и определения токсигенности C.botulinum можно про­вести реакцию нейтрализации токсина на белых мышах. Для определения серотипа токсина реакцию ставят с моновалент­ными сыворотками типов А, В, Е. При нейтрализации токсина гемолитической антитоксической сывороткой мыши остаются живыми.

• Микробиологическая диагностика пищевых интоксикаций, вызванных бактериями рода Bacillus

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: рвотные массы, про­мывные воды желудка, фекалии, подозрительные пищевые продукты.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериологическое исследование. Материал засевают на кровяной агар или селективные среды с лецитином и поли-миксином. При исследовании материала, содержащего посто­роннюю микрофлору (фекалии), образцы предварительно об­рабатывают нагреванием при 63 °С в течение 15 мин или 50 % этиловым спиртом (45—60 мин) для уничтожения вегетативных форм бактерий. Споры возбудителя при этом сохраняются. Идентификацию выделенной чистой культуры производят по морфологии, наличию и расположению спор, тинкториальным свойствам и биохимическим признакам. Для эпидемиологичес­кого анализа осуществляется серотипирование по жгутиковому антигену (существует более 40 серотипов).

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования. Иммуно­химические исследования. Токсины Bacillus cereus могут быть обнаружены во всех вышеназванных видах материала, включая фекалии, с помощью серологических реакций (ИФА, РИА, иммунопреципитации и др.).

Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих моле­кул можно поставить предварительный диагноз.

• МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: испражнения боль­ного, рвотные массы, вода, пищевые продукты; при постмор-тальной диагностике: отрезки тонкой кишки и желчный пу­зырь с частью печени. При необходимости хранения материал помещают в транспортную среду (буферный солевой раствор с глицерином). Для длительного сохранения рекомендуется по­лоску фильтровальной бумаги, смоченную в жидких испраж­нениях, поместить в герметически закрытый пластиковый кон­тейнер — для предохранения от высыхания. Таким образом возбудитель сохраняется в материале до 5 нед.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование. Из исследуемого мате­риала готовят мазки, окрашивают их по методу Грама и вод­ным фуксином. Кроме того, из нативного материала готовят препарат "висячая" капля, в котором определяют наличие по­движных вибрионов при темнопольной или фазово-контраст-ной микроскопии. Обнаружение в мазках большого количества грамотрицательных, слегка изогнутых палочек (длиной от 1,5 до 3 мкм) и активно-подвижных вибрионов в препарате "ви­сячая" капля позволяет дать первый предварительный положи­тельный ответ (рис. 13.3.1; на вклейке).

Бактериологическое исследование. Материал засевают в раз­личные жидкие и плотные элективные среды, в частности во флаконы со щелочной пептонной водой (1 % с теллуритом) и на чашки со щелочным питательным агаром. Посевы на пеп­тонной воде инкубируют при 37 °С в течение 5—6 ч, на чаш­ках — 10—12 ч. Из голубоватой пленки, образующейся на пеп­тонной воде, или из ее поверхностного слоя делают мазки и препараты "раздавленная" и "висячая" капля. Этот же мате­риал используют для постановки реакции агглютинации на стекле со специфической противохолерной 01-сывороткой. Часть пептонной воды переносят в другую пробирку для по­становки нитрозоиндоловой пробы. Для этого добавляют туда же несколько капель серной кислоты. В положительном случае появляется розовое окрашивание вследствие образования нитрозоиндола под влиянием холерного вибриона. Независимо от результатов исследования делают пересев на вторую пептон-ную воду. Наличие грамотрицательных вибрионов, агглютини­рующихся 01-сывороткой, позволяет дать второй предвари­тельный ответ. Независимо от полученных результатов продол­жают исследование, как показано на схеме 13.3.1.

Выделение чистой культуры и ее идентификацию проводят по 5—6 однотипным колониям, выросшим на щелочном агаре. Для ускорения хода анализа ставят развернутую реакцию аг­глютинации с бактериальной суспензией, приготовленной из колоний. Для этого агглютинирующую 01-сыворотку разводят в пробирках до титра пептонной водой (в объеме 0,5 мл). Затем в каждую пробирку вносят 1—2 капли суспензии бактерий. Результат реакции агглютинации учитывают после 3—4-часо­вой инкубации при 37 °С.

Идентификацию культуры проводят на основании опреде-

Тест V.choterae V.cholerae Неагглюти-asiatici el-tor нирующиеся вибрионы Агглютинация О-сывороткой + + — Агглютинация типовыми сы- + + — воротками Огава и Инаба Лизис фагами: холерный фаг С (фаг IV) + + фаг Эль-Тор II — + + Агглютинация куриных эрит- — + + роцитов Гемолиз эритроцитов барана — + + Рост на агаре с 50 ЕД поли- — + + миксина Гексаминовый тест — + + Реакция Фогеса— Проскауэра — + + (образование ацетил метил -карбинола)

кой, типовыми сыворотками Огава и Инаба или типовыми холерными фагами. Готовят из них препараты "раздавленная" капля, которые исследуют с помощью темнопольной и фазо-во-контрастной микроскопии. В положительном случае через 3—5 мин движение вибрионов прекращается.

Иммунохимические исследования. Применяют ме­тод прямой ИФ. Мазки из исследуемого материала обрабаты­вают флюоресцирующей противохолерной сывороткой и ис­следуют в люминесцентном микроскопе. Положительным ре­зультатом считается обнаружение в препарате даже единичных вибрионов с ярким желто-зеленым свечением в виде блестя­щего ободка по периферии клетки. Положительный результат можно получить через 1—2 ч после начала исследования при концентрации вибрионов не менее 10⁶ клеток в 1 мл, поэтому рекомендуется предварительное подращивание материала на питательных средах.

Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих моле­кул можно поставить предварительный диагноз.

Серодиагностика. Выявление антител к возбудителю являет­ся вспомогательным и применяется для ретроспективной диа­гностики холеры, выявления вибрионосителей и оценки напря­женности постинфекционного и поствакцинального иммунитета. Для этого обычно ставят реакцию агглютинации или РИГА, диагностический титр антител в этих реакциях 1:80—1:320, а также определяют вибриоцидные антитела в реакции лизиса.

• Диагностика носителъства

Во время вспышки холеры проводят массовое обследование на носительство V.cholerae.

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: ректальные мазки (фекалии, взятые тампоном из прямой кишки).

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериологическое исследование. Посев материала от 10 обследуемых на обогатительную среду с 01-агглютинирующей диагностической сывороткой. В положительных случаях через 3—4 ч начинается выпадение хлопьев в результате агглютина­ции размножившихся вибрионов. При обнаружении в осадке грамотрицательных подвижных вибрионов каждый из 10 паци­ентов обследуется индивидуально.

• МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ, ВЫЗВАННЫХ БАКТЕРИЯМИ РОДА VIBRIO

Возбудители: V.cholerae не О1 (серовары О4, Об и др.), V.mimicm, V.parahaemolyticus, V.fluvialis и др.

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: фекалии, рвотные массы, ректальные мазки.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование. Изучение нативных маз­ков ("висячая" или "раздавленная" капля) методом темнополь-ной или фазово-контрастной микроскопии и фиксированных препаратов, окрашенных по методу Грама. Предварительный диагноз ставится на основании обнаружения подвижных грам-отрицательных вибрионов при исключении холеры с помощью экспресс-методов (отрицательная реакция иммобилизации и иммунофлюоресценции с 01-специфической сывороткой). Метод имеет ориентировочное значение, поскольку не позво­ляет дифференцировать между собой различных представите­лей семейства Vibrionaceae.

Бактериологическое исследование. Посев материала на ос­новные (кровяной агар), а также на элективные и дифферен­циально-диагностические среды для вибрионов. Возбудители дифференцируют по культуральным, антигенным и биохими­ческим признакам.

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования. Биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, ис­пользуют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поста­вить предварительный диагноз.

• МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ, ВЫЗВАННЫХ БАКТЕРИЯМИ РОДА AERO-MONAS

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: фекалии, рвотные массы, ректальные мазки.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование. См. раздел "Микробио­логическая диагностика кишечных инфекций, вызванных бак­териями рода Vibrio".

Бактериологическое исследование. Посев материала на ще­лочную пептонную воду и селективную среду — агар с добав­лением антибиотиков (ампициллина, новобиоцина и др.). При росте на кровяных средах характерен бета-гемолиз. Идентифи­кацию чистой культуры производят на основании культураль-ных, биохимических признаков, серотипирования, фаготипи-рования, используют также молекулярно-биологические мето­ды идентификации (риботипирование и др.).

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохимические и молекулярно-биологические исследования. Биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, ис­пользуют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поста­вить предварительный диагноз.

• МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ, ВЫЗВАННЫХ БАКТЕРИЯМИ РОДА PLESIOMONAS

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: фекалии, рвотные массы, ректальные мазки.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование. См. раздел "Микробио­логическая диагностика кишечных инфекций, вызванных бак­териями рода Vibrio".

Бактериологическое исследование. Посев материала на ще­лочную пептонную воду, кровяной агар (гемолиз нехарактерен) и селективную среду — агар с добавлением инозитола, желчных кислот и бриллиантового зеленого. Идентификацию чистой культуры производят на основании культуральных, биохими­ческих признаков, серотипирования по О- и Н-антигенам (не­обходимо помнить, что P.shigelloides имеет перекрестные анти­гены с S.sonnei и может давать положительную РА с соответ­ствующими диагностическими сыворотками). Используют также молекулярно-биологические методы идентификации (риботипирование и др.).

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования. Биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, ис­пользуют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поста­вить предварительный диагноз.

• ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ, ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЕ И ЛЕЧЕБ­НЫЕ ПРЕПАРАТЫ

Стафилококковые бактериофаги (международный набор). Применяют для фаготипирования стафилококков с целью эпи­демиологического анализа пищевой интоксикации.

Противоботулинические сыворотки. Получены из крови ло­шадей, гипериммунизированных ботулиническими анатокси­нами. Очищены и концентрированы методом диаферм-3. Для лечебно-профилактических целей готовят Противоботу­линические сыворотки четырех типов: А, В, Е, F. Монова­лентные сыворотки перечисленных типов используют в диагностических целях для определения серотипа токсина в ис­следуемом материале.

Ботулинический трианатоксин адсорбированный очищенный.

Экзотоксины C.botulinum (серотипы А, В и Е) обезвреживают формалином при нагревании, а затем очищают от балластных веществ, концентрируют и адсорбируют на гидрате оксида алюминия. Применяют для проведения плановой активной иммунизации против ботулизма юношей допризывного возрас­та (16 лет).

Противохолерная агглютинирующая О-сыворотка, типовые сыворотки Огава и Инаба. Получены из крови кроликов, им­мунизированных холерными вибрионами. Применяют для се­рологической идентификации и типирования холерных вибри­онов в реакции агглютинации.

Холерные фаги. Типовые холерные фаги применяют для идентификации и типирования холерных вибрионов. Полива­лентный холерный бактериофаг используют для лечебно-про­филактических целей.

Холерная вакцина. Взвесь убитых холерных вибрионов при­меняют для активной иммунизации против холеры. Готовится из чистых культур V.cholerae O1 биоваров El-tor и asiatici cepo-типов Инаба и Огава.

Холероген-анатоксин. Обезвреженный холерный токсин. При­меняют для специфической профилактики холеры (создание активного специфического антитоксического иммунитета).

Антибиотики. Могут быть использованы все препараты, дей­ствующие на соответствующие бактерии. Вместе с тем надо учитывать, что среди возбудителей достаточно широко распро­странены устойчивые варианты. Для большинства грамотрица-тельных возбудителей кишечных инфекций широко использу­ют тетрациклины, ампициллин, цефалоспорины 2—4-го поко­лений, хлорамфеникол, фторхинолоны.