Тец руководство. Руководство к практаческим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии под редакцией

• Название: Руководство к практаческим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии под редакцией
• Анкор: Тец руководство.doc
• Дата: 28.01.2017
• Размер: 2.14 Mb.
• Имя файла: Тец руководство.doc
• Тип: Руководство; #290
• страница: 14 из 20

Тема 14.2. ВОЗБУДИТЕЛИ МЕНИНГОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ, КОКЛЮША И ДИФТЕРИИ

План

Программа

1. Биологические свойства возбудителей менингококко-вой инфекции, коклюша и дифтерии; их патоген-

220

ность, экология, особенности инфекции и эпидемио­логия вызываемых заболеваний.

Микробиологическая диагностика.

Диагностические, профилактические и лечебные пре­параты.

а Демонстрация

[.Приспособления и тампоны (простые, проволочные, сывороточные) для взятия материала из зева и носо­глотки.

2. Мазки для микроскопии.

Neisseria meningitidis — мазки из чистой культуры и спинномозговой жидкости, окраска по методу Грама и метиленовым синим.

BordeteНа pertussis — мазок из чистой культуры, ок­раска по методу Грама.

Corynebacterium diphtheriae:
мазок из чистой культуры, окраска по методу Грама, метиленовым синим по Леффлеру, по Нейссеру;

мазок из чистой культуры в люминесцентном микроскопе, окраска корифосфином.
Культура N.meningitidis на сывороточном агаре.

Обнаружение менингококкового антигена в спинно­мозговой жидкости в РИГА.

Колонии В.pertussis на казеиноутольном агаре (КУА) и среде Борде—Жангу.

Определение уреазной активности возбудителя паракоклюша.

PC К для серодиагностики коклюша.

Экспресс-диагностика коклюша с помощью иммунофлюоресцентного метода.

Рост коринебактерий на свернутой сыворотке и теллуритовой среде.
"Пестрые" ряды культур коринебактерий. Пробы на цистиназу и уреазу.

Определение токсигенности C.diphtheriae (реакция преципитации в агаре).

Ускоренный метод диагностики дифтерии.

а Задание студентам

Указать приспособления (виды тампонов) для взятия материала при менингококковой инфекции, коклюше и дифтерии.

Микробиологическое исследование при менингокок­ковой инфекции:
указать материал, подлежащий исследованию;

бактериоскопический метод: микроскопировать готовые мазки из спинномозговой жидкости и носо­глотки, сделать заключение;

бактериологическое исследование и иммунохимический метод;

по результатам, полученным из лаборатории, сде­лать заключение.

3. Микробиологическое исследование при коклюше и паракоклюше:

указать материал, подлежащий исследованию;

бактериоскопический метод: микроскопировать го­товые мазки из носоглотки. Сделать вывод и наме­тить план дальнейшего исследования;

бактериологический метод: по результатам, полу­ченным из лаборатории, сделать заключение.

4. Микробиологическое исследование при дифтерии:

указать материал, подлежащий исследованию;

бактериоскопический метод: микроскопировать мазки из материала, взятого из зева лиц с подозре­нием на дифтерию или бактерионосительство, сде­лать предварительное заключение и наметить ход дальнейшего исследования для подтверждения бактериоскопического диагноза;

бактериологический метод: описать рост культуры, полученной на свернутой сыворотке, и колоний на теллуритовой среде, отметить результаты готовых посевов исследуемых культур на средах "пестрого" ряда, в случае обнаружения C.diphtheriae определить ее токсигенность. Сопоставить данные бактериоскопического и бактериологического исследований с целью идентификации выделенной культуры и поставить окончательный микробиологический диагноз.

5. Дать краткую характеристику диагностическим, про­филактическим и лечебным препаратам.

Методические указания

• Микробиологическая диагностика метнгококковой инфек­ции

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: спинномозговая жидкость, кровь, мазки со слизистой оболочки верхних отделов носоглотки, аспират из высыпных элементов.

При обследовании на носительство материал из верхних отделов носоглотки берут специальным носоглоточным тампо­ном (который на ³/4 Длины сгибают под углом 45°). При доставке в лабораторию его предохраняют от охлаждения и высушивания, поскольку менингококк очень чувствителен к воздействию этих факторов.

Спинномозговую жидкость берут в количестве 2—5 мл и делят на две части: одну центрифугируют и исследуют осадок, к другой добавляют полужидкую питательную среду и выдер­живают при 37 °С для накопления бактерий. Из исследуемого материала готовят мазки и производят посевы.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование (схема 14.2.1). Мазки из осадка спинномозговой жидкости окрашивают по методу Гра-ма и микроскопируют. При наличии гноя в большинстве слу­чаев обнаруживаются типичные грамотрицательные диплокок­ки, имеющие характерное расположение внутри лейкоцитов, что позволяет сделать окончательное заключение о менинго-кокковой инфекции. При микроскопии мазков из носоглотки бактерионосителей наряду с менингококком обнаруживаются грамположительные стафилококки и стрептококки, а также непатогенные нейссерии (Moraxella spp. и др.). Дифференциро­вать их по морфологическим признакам не представляется возможным.

Бактериологическое исследование. Исследуемый материал засевают петлей на чашки с питательным агаром, содержа­щим кровь, сыворотку крови или асцитическую жидкость. В среды добавляют антибиотик ристомицин (150 ЕД/мл), который задерживает размножение грамположительных кок­ков, содержащихся в исследуемом материале, и тем самым способствует выделению чистой культуры менингококка. Образование колоний менингококка на этих средах наблю­дается через 48 ч после инкубации посевов при 37 °С в атмосфере с повышенным содержанием СО₂ (3—10 %) и вы­сокой влажностью. В отличие от других кокков колонии ме­нингококка величиной с булавочную головку прозрачны, име­ют голубоватый оттенок и ровные края. Такие колонии пере­севают в пробирку со скошенным агаром для получения чистой культуры.

Идентификацию чистой культуры, дифференциацию от сап­рофитных нейссерии, обитающих в носоглотке, проводят по ряду культуральных и биохимических признаков. Так, менин­гококк растет только в присутствии нативного белка, в то время как другие нейссерии размножаются на простых средах и образуют пигмент; на средах Гисса с добавлением сыворотки крови менингококк ферментирует глюкозу и мальтозу до кис­лоты (табл. 14.2.1).

Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохими­ческие и молекулярно-биологические исследования. Иммуно­химические исследования. Для выявления антигенов менингококков в мазках из исследуемого материала использу­ют метод ИФ.

Признак N.men- N.gonor- N.sub- N.mu- M. catar-ingitidis rhoeae flava cosa rhalis Продукция каталазы + -*- + + + Продукция оксидазы + + + + + Образование пигмента ± ± + + + Рост при 22 °С ± ± + + + Потребность для роста + + ± ± ± в сыворотке или крови Образование кислоты при расщеплении углеводов: глюкозы + + + + ± лактозы ± ± ± [+} ± мальтозы + ± + ± ± сахарозы ± ± + ± ± Восстановление нитратов ± ± ± + ±

• Микробиологическая диагностика коклюша и паракоклюша

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: мокрота, слизь из носоглотки. Материал берут стерильным ватным тампоном из носоглотки больного ребенка. Для взятия материала у малень­ких детей тампон, приготовленный на тонкой эластичной про­волоке, вводят через нос.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование (схема 14.2.2). Бактерио-скопический метод как таковой при диагностике коклюша не применяется. Для быстрого обнаружения и идентификации Bordetella pertussis используют иммунофлюоресцентный метод (см. ниже).

Бактериологическое исследование. Основной метод лабора­торной диагностики коклюша. Материал для посева берут с помощью носоглоточного тампона или методом "кашлевых пластинок". Для этого в момент появления кашля открытую чашку Петри с питательной средой подносят ко рту ребенка и держат в течение 6—8 кашлевых толчков. Правильное и раннее взятие материала позволяет выделить возбудителя в начальном периоде болезни от 80—90 % больных. Материал засевают на КУА или кровяные среды — картофельно-глицериновый кро­вяной агар (среда Борде—Жангу) и молочно-кровяной агар. В питательные среды добавляют пенициллин для угнетения роста посторонней микрофлоры. Колонии В.pertussis на указан­ных средах обычно появляются через 48—72 ч культивирова­ния. B.parapertussis — несколько раньше: через 24—72 ч. Борде-теллы образуют мелкие (диаметром около 1 мм) выпуклые влажные блестящие колонии. На КУА колонии имеют серова­то-кремовый цвет, а на среде Борде—Жангу приобретают жем­чужный или ртутный блеск. Колонии B.parapertussis более круп­ные. На среде Борде—Жангу и молочно-кровяном агаре они образуют ограниченную зону гемолиза. Из колоний, выросших на чашках, готовят мазки, окрашивают их по методу Грама и микроскопируют. При наличии в мазках овоидных грамотри-цательных палочек ставят ориентировочную реакцию агглюти­нации с коклюшной и паракоклюшной сыворотками. Затем подозрительные колонии пересевают в пробирки для дальней­шего изучения чистых культур.

Идентификацию выделенной культуры производят на осно­вании комплексного изучения морфологических, культураль-ных, биохимических и серологических свойств (табл. 14.2.2). В отличие от других бордетелл B.pertussis не растет на простом питательном агаре и не изменяет цвета специальных питатель­ных сред.

Признак В. per- В. parapertussis В. bron-tussis chisep-tica Рост: на агаре (простом) — + 4-— Коричневая окраска на агаре с тирозином + + Ярко-коричневая окраска Изменение окраски: КУА — Буро-коричневая — кровяного агара — Потемнение — Образование уреазы + + + Наличие антигенов: родового (общего) 777 видового (специфического) 1 14 12

люшными антителами, другой — паракоклюшными антитела­ми. Препараты микроскопируют в люминесцентном микроско­пе, просматривая не менее 50 полей зрения. О положительном результате свидетельствует обнаружение темных бактериаль­ных клеток с четким светящимся венчиком.

Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих моле­кул можно поставить предварительный диагноз.

Серодиагностика. Реакции агглютинации и РСК применяют в основном для ретроспективного подтверждения диагноза и дифференциальной диагностики атипичных форм коклюша. Агглютинины в крови больных появляются на 3—4^й неделе заболевания в титрах 1:20 и выше. В условиях массовой вак­цинации детей против коклюша диагностическое значение имеет нарастание титра антител в динамике болезни, поэтому реакцию ставят повторно через 4—5 дней.

• Микробиологическая диагностика дифтерии

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: мазки со слизистой оболочки зева и носа, пленки с поверхности миндалин и но­соглотки. Материал берут двумя ватными стерильными тампо­нами, один из которых используют для приготовления мазков, другой — для посева.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование (схема 14.2.3). Мазки ок­рашивают по методу Грама, метиленовым синим по Леффлеру, по Нейссеру. Для Corynebacterium diphtheriae характерно нали­чие полярно расположенных зерен волютина и расположение в виде буквы "V" (см. рис. 2.2.4). Corynebacterium pseudodiphth-eriae и дифтероиды не имеют зерен волютина или содержат их не на концах, а по длине палочки. Кроме того, сами бактерии располагаются в виде частокола. Применение люминесцентной микроскопии позволяет повысить эффективность исследова­ния. При этом C.diphtheriae можно отличить от других корине-бактерий по коричнево-красному свечению зерен волютина, которое они приобретают после окраски флюорохромом кори-фосфином. Цитоплазма этих бактерий дает зеленое или желтое свечение. Однако C.diphtheriae часто изменяют свою морфоло­гию, в частности при санации зева антибиотиками. В настоя­щее время бактериоскопическое исследование при дифтерии практически не используют в связи с его низкой надежностью (высокой частотой ложноположительных и ложноотрицатель-ных результатов).

Бактериологическое исследование. Является ведущим мето-


дом диагностики дифтерии. Материал засевают на кровяной агар и элективные питательные среды, содержащие теллурит: среда Клауберга (питательный агар с теллуритом натрия, гли­церином и дефибринированной кровью) и др. На средах с теллуритом задерживается рост кокков и другой микрофлоры зева, что способствует размножению возбудителя дифтерии. На теллуритовой среде C.diphtheriae образует черные колонии (рис. 14.2.1; на вклейке) за счет восстановления теллурита (биовар gravis формирует колонии серовато-черного цвета с радиальной исчерченностью поверхности, напоминающие цве­ток маргаритки, биовар mitis — круглые выпуклые колонии черного цвета). Типичные колонии, представленные грамполо-жительными палочками булавовидной формы с характерным расположением, содержащими зерна волютина, пересевают на кровяной агар для получения чистой культуры.

Для подтверждения диагноза дифтерии в первую очередь необходимо установить токсигенность выделенной культуры (способность к продукции дифтерийного токсина). Наличие токсина определяют с помощью различных серологических реакций (преципитации в агаре, ИФА и др.). Применяют также метод ПЦР, позволяющий обнаружить присутствие у выделен­ных бактерий tox-гена, контролирующего синтез дифтерийного токсина. До последнего времени общепринятым методом оп­ределения токсигенности являлась реакция преципитации в агаре с антитоксической противодифтерийной сывороткой. Методы ИФА и ПЦР, разработанные в последние годы, явля­ются более чувствительными и позволяют получить результат в течение 3—5 ч.

Определение токсигенности в реакции преципитации: в чашку Петри с питательным агаром, содержащим 15—20 % лошадиной сыворотки, 0,3 % мальтозы и 0,03 % цистина, кладут полоску фильтровальной бумаги, пропитанную анти­токсической противодифтерийной сывороткой, содержащей 5000 АЕ/мл. Чашку подсушивают при 37 "С в течение 30 мин и засевают исследуемые культуры в виде перпендикулярных к бумаге штрихов на расстоянии 0,6—0,8 см от края бумаги. В качестве контроля используют заведомо токсигенную куль­туру. Посевы инкубируют при 37 "С до следующего дня. При размножении токсигенной культуры в месте соединения ток­сина с антитоксическими антителами в плотной питательной среде образуется преципитат в виде белых линий — "усов" (см. рис. 10.1.7).

Выделенную культуру идентифицируют и дифференцируют от сходных с ней непатогенных коринебактерий по морфоло­гическим особенностям, культуральным и биохимическим признакам: пробы на цистиназу, уреазу, ферментация углево­дов и др. (табл. 14.2.3). В случае выделения нетоксигенной культуры ставят дополнительную реакцию агглютинации с

Вид Ферментация (2 ^ « 1 s 8 s 5 Р i 1 1 1 1 _ С в о Я « в s яб"-0-? II 1 1 | 1 1 1 | iSlI л! ^ е 1 s- (2 я ^ Ilig C.diphlheriae биовар ^rav/5 + — — + + + +— + биовар mitis + + — + — ± + — + C.xerosis ± _ + + — — ±— — C.pseudodiphtheriticum ± ______+ _

Применяют для обнаружения антигенов N.meningitidis в спин­номозговой жидкости в РИГА.

Коклюшная вакцина. Содержит взвесь В.pertussis, убитых формалином. Применяют для обязательной активной специ­фической профилактики коклюша. Входит в состав АКДС (ад­сорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина), которая включает также очищенные концентрированные диф­терийный и столбнячный анатоксины, адсорбированные на гидрате оксида алюминия.

Иммуноглобулин нормальный человеческий. Получен из пла­центарной или венозной крови человека. Содержит специфи­ческие антитела против возбудителей многих инфекционных заболеваний, в том числе возбудителя коклюша. Применяют для создания пассивного иммунитета с целью профилактики и лечения коклюша.

Агглютинирующие адсорбированные (факторные) сыворотки. Применяют для серологической дифференциации возбудите­лей коклюша.

Дифтерийный адсорбированный очищенный анатоксин (АД). Дифтерийный экзотоксин обезвреживают формалином при на­гревании, а затем очищают от балластных веществ, концент­рируют и адсорбируют на гидрате оксида алюминия. Приме­няют для профилактики дифтерии путем создания активного иммунитета. Входит в состав адсорбированного дифтерийно-столбнячного анатоксина (АДС) и АКДС.

Противодифтерийная антитоксическая сыворотка. Получена из крови лошадей, гипериммунизированных дифтерийным ана­токсином, очищена и концентрирована методом диаферм-3. Активность сыворотки изменяется в международных единицах. Применяют для экстренной профилактики и лечения дифте­рии за счет создания пассивного иммунитета.

Агглютинирующая противодифтерийная сыворотка (полива­лентная и типовые). Применяют для дифференциации C.diph-theriae от дифтероидов.

Антимикробные препараты: пенициллин и другие р-лактамы, хлорамфеникол, рифампицин, сульфаниламиды, тетрациклин, эритромицин.

Тема 14.3. ВОЗБУДИТЕЛИ ТУБЕРКУЛЕЗА, ПРОКАЗЫ И АКТИНОМИКОЗА

План

Программа

1. Биологические свойства возбудителей туберкулеза, микобактериозов, проказы и актиномикозов; их пато-генность, экология, особенности инфекции и эпиде­миология вызываемых заболеваний.
Микробиологическая диагностика.

Диагностические, профилактические и лечебные пре­параты.

Демонстрация

1. Мазки для микроскопии:

Mycobacterium tuberculosis — мазки из чистой куль­туры и мокроты, окраска по методу Циля—Ниль­сена;

препарат М.tuberculosis в люминесцентном микроскопе;

Mycobacterium leprae — мазок со слизистой оболоч­ки носа, окраска по методу Циля—Нильсена;

Actinomyces spp. — друзы актиномицетов в ткани легкого.
Питательные среды для культивирования М.tuberculo­sis.

Рост микобактерий на среде Левенштейна—Йенсена.

Ниациновая проба для идентификации М.tuberculosis.

Определение чувствительности микобактерий к противотуберкулезным препаратам.

Рост актиномицетов на питательных средах.

Биохимические признаки для дифференциации акти­номицетов.

РСК для серодиагностики актиномикоза.

Задание студентам

1. Микробиологическое исследование при туберкулезе:

указать материал, подлежащий исследованию;

бактериоскопический метод: окрасить по методу Циля—Нильсена приготовленные из мокроты маз­ки и провести микроскопическое исследование. Сде­лать заключение и наметить ход дальнейшего ис­следования для подтверждения бактериоскопического диагноза;

бактериологический метод:

4 отметить характер роста исследуемой культуры

на среде Левенштейна—Йенсена, Ф отметить результаты ниациновой пробы, 4 определить чувствительность М.tuberculosis к ан­тимикробным препаратам: отметить наличие или отсутствие, роста микобактерий на среде Левен­штейна—Йенсена с разными концентрациями противотуберкулезных препаратов и сопоставить полученные данные с клиническими границами устойчивости микобактерий. Дать окончательное заключение по проведенным исследованиям.

2. Микроскопическое исследование при проказе:

1) указать материал, подлежащий исследованию;

2) бактериоскопический метод: микроскопировать и зарисовать окрашенный по методу Циля—Нильсе­на мазок со слизистой оболочки. Сделать заключе­ние. 3. Микробиологическое исследование при актиномикозе:

указать материал, подлежащий исследованию;

бактериоскопический метод: микроскопировать пре­парат из патологического материала. Сделать за­ключение;

бактериологический метод: на основании результа­тов исследования (морфологических, культуральных и биохимических свойств) идентифицировать культуру актиномицетов. Сделать окончательное за­ключение.

а Методические указания

• Микробиологическая диагностика туберкулеза

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: при легочном тубер­кулезе материалом для исследования являются мокрота, про­мывные воды бронхов, бронхоальвеолярная жидкость, плев­ральный экссудат, промывные воды желудка. Образцы мокро­ты необходимо собирать в течение 3—6 дней. Если пациент откашливает недостаточное количество мокроты, отделение можно облегчить (индуцировать) путем вдыхания аэрозоля по­догретого гипертонического (5—15 %) раствора поваренной со­ли. При внелегочном туберкулезе материал для исследования выбирают в зависимости от локализации поражений. Это мо­жет быть кровь, спинномозговая жидкость, моча, синовиаль­ная жидкость, тканевые биоптаты (лимфатических узлов, кост­ного мозга, печени, кожи и подкожной жировой клетчатки и др.), испражнения. Нестерильный материал, контаминирован-ный нормальной микрофлорой (мокрота, промывные воды бронхов, бронхоальвеолярная жидкость, промывные воды же­лудка, материал из пораженных участков кожи и подкожной жировой клетчатки, испражнения) для предотвращения раз­множения посторонних бактерий сразу после отбора должен быть помещен в холодильник и храниться до исследования при температуре 4—8 °С.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Первичная обработка клинического материала. Нестерильный материал нуждается в предварительной деконтаминации (унич­тожении посторонней микрофлоры). Для исследования вязко­го и негомогенного материала, содержащего тканевой детрит (мокрота, бронхоальвеолярная жидкость и др.), требуется также произвести процедуру разжижения и гомогенизации. По­скольку клинические образцы обычно содержат малое количе­ство микобактерий, желательно производить обогащение ис­следуемого материала. Обычно с целью гомогенизации/декон-таминации материал обрабатывают муколитическими (М-аце-тил-Ь-цистеин) и антибактериальными агентами (10 % Na₃PO₄, 1—2 % NaOH и др.). Далее бактерии концентрируют путем осаждения (центрифугирование 15—20 мин при 3000 g). При этом клеточный детрит и погибшие посторонние микроорга­низмы удаляются в виде супернатанта. Осадок ресуспендируют в минимальном объеме стерильной воды или изотонического раствора хлорида натрия и используют для дальнейшего иссле­дования. Применяют и другие методы деконтаминации, гомо­генизации и обогащения материала. Тканевые биоптаты перед исследованием необходимо гомогенизировать.

Бактериоскопическое исследование (схема 14.3.1). Бактерио-скопическая диагностика туберкулеза основана на выявлении в материале кислотоустойчивых бактерий с помощью специ­альных сложных методов окраски.

Выявление микобактерий классическим методом Циля— Нильсена является весьма трудоемкой процедурой. Кислото­устойчивые бактерии окрашиваются в ярко-красный цвет, рас­полагаются поодиночке или небольшими скоплениями (см. рис. 2.2.2). Препараты из мочи обязательно обесцвечивают не только кислотой, но и спиртом для дифференциации M.tuber-culosis от M.smegmatis, которые могут находиться в моче здоро­вых людей. В отличие от М.tuberculosis они обесцвечиваются спиртом. Мазок исследуют иммерсионным методом при уве­личении 900х—ЮООх, просматривая до 300 полей зрения. Ре­зультат считается положительным при обнаружении 1 или бо­лее кислотоустойчивых бактерий на 100 полей зрения. Отсут­ствие кислотоустойчивых бактерий при просмотре 300 полей зрения следует трактовать как отрицательный результат. Ок­раску по методу Циля—Нильсена применяют преимуществен­но для изучения выделенных чистых культур.

В качестве основного метода выявления микобактерий в материале от больного в настоящее время применяют люми­несцентную микроскопию мазков, окрашенных флюорохро-мом аурамином О по методу Боя (последующая обработка 3 % раствором НС1 в абсолютном этаноле обеспечивает обесцвечи­вание некислотоустойчивых бактерий). Этот метод облегчает исследование, поскольку позволяет использовать меньшее уве­личение (250х или 450х) и просматривать меньшее число полей зрения (30—70 в зависимости от увеличения).

Независимо от метода окраски бактериоскопическое иссле­дование позволяет обнаружить бактерии при их концентрации не менее 5000—10 000 в 1 мл образца, поэтому отрицательный результат не позволяет исключить заболевание.

Микроскопическое исследование является ориентировоч* ным и дает возможность судить лишь о наличии в материале кислотоустойчивых бактерий без определения их видовой при* надлежности. Метод не позволяет дифференцировать микобак-терии между собой и от других кислотоустойчивых микроор­ганизмов. Легочные и внелегочные поражения в первую оче­редь у лиц с иммунодефицитом различной этиологии могут быть вызваны не только бактериями комплекса Mycobacterium tuberculosis (МТС), но также и нетуберкулезными микобакте-риями: бактериями комплекса M.avium (MAC), M.kansassii, реже другими представителями рода Mycobacterium, Посколь­ку нетуберкулезные микобактерии являются обитателями ок­ружающей среды, загрязняющими воду, продукты, системы принудительной вентиляции/кондиционирования воздуха и др., они могут также присутствовать в образце как контами-нанты.

Бактериоскопическое исследование считается оптимальным методом ориентировочной экспресс-диагностики туберкулеза.

Бактериологическое исследование. Считается ведущим мето­дом диагностики туберкулеза, поскольку обладает достаточно высокой чувствительностью, специфичностью и обеспечивает материал (чистую культуру), необходимый для определения чувствительности возбудителя к противомикробным препара­там.

Для выделения чистой культуры микобактерии производят посев исследуемого материала на специальные жидкие или плотные питательные среды. Для выделения микобактерии из нестерильного материала желательно использовать селектив­ные среды, содержащие антимикробные препараты, подавляю­щие рост посторонних микробов. Для культивирования мико­бактерии применяют плотные яичные (среда Левенштейна— Йенсена) и агаровые среды, а также ряд синтетических жидких питательных сред.

Среда Левенштейна—Йенсена готовится из суспензии све­жих яиц, картофельной муки, глицерина, аспарагина, Ю^РОф суль­фата и цитрата магния и малахитового зеленого. Среду свертывают в наклонном положении при 85 "С в течение 45 мин.

Большинство питательных сред выпускаются микробиоло­гической промышленностью в виде полуфабрикатов или в го­товом виде. Поскольку на жидких средах скорость роста ми­кобактерии выше, чем на плотных, для ускорения исследова­ния рекомендуется осуществлять посев одновременно на плотную и жидкую среду. Посевы необходимо инкубировать в атмосфере с повышенным содержанием СС>2 (5—10 %). Мини­мальный срок инкубации составляет не менее 8 нед. Посевы первый раз просматривают на 3—5-й день после внесения материала, далее — 2 раза в неделю. Начиная с 5-й недели культивирования — 1 раз в неделю. Культуры М.tuberculosis имеют вид сероватого или светло-кремового морщинистого или крошкообразного сухого налета (рис. 14.3.1; на вклейке). Еще до появления видимых невооруженным глазом макроско­пических колоний на плотных средах с помощью микроскопии могут быть обнаружены микроколонии. Отсутствие микробно­го роста через 8 нед культивирования следует расценивать как отрицательный результат.

В последнее время широкое применение нашли также раз­личные коммерческие системы культивирования микобакте-рий, использующие как жидкие, так и плотные питательные среды, а также различные высокочувствительные способы ав­томатизированного контроля роста бактерий на основании их метаболической активности — по потреблению компонентов питательной среды и/или образованию продуктов жизнедея­тельности. Это позволяет обнаружить присутствие бактерий значительно раньше появления видимых признаков роста. Для посева используют стандартные емкости, заполненные готовой средой. Определение концентрации соответствующего метабо­лита в каждой пробе осуществляется непрерывно с помощью радиометрических, флюорометрических, колориметрических, манометрических или других методов в специальной камере для инкубации посевов, регистрируется и анализируется с по­мощью компьютера. В настоящее время изотопные методы контроля роста вытесняются неизотопными, основанными на различных способах детекции поглощения и выделения газов (О2 и/или СО₂) микроорганизмами в ходе активного метабо­лизма. Использование указанных методов контроля роста по­зволяет в большинстве случаев существенно ускорить процесс выделения чистой культуры микобактерий. Положительный результат может быть получен уже через 3—5 дней, средний срок составляет 7—14 дней. Однако, учитывая вероятную низ­кую концентрацию возбудителя в исследуемом материале, мак­симальный срок инкубации достаточно велик — результат бак­териологического исследования считается отрицательным при отсутствии признаков роста в течение 40 дней. В случае регистрации положительного результата культивирование про­должают до тех пор, когда количество бактерий в среде дости­гает определенной концентрации, необходимой для проведе­ния дальнейшего изучения выделенной чистой культуры — идентификации и определения чувствительности к антимик­робным препаратам. Среднее время культивирования состав­ляет 9—20 дней.

Бактериологический метод дает положительный результат при наличии не менее 10—30 жизнеспособных микобактерий в 1 мл исследуемого материала после обогащения. Чувствитель­ность бактериологического метода приближается к 100 %, од­нако не всегда позволяет однозначно исключить заболевание.

Отрицательный результат в ряде случаев может быть обуслов­лен очень низким содержанием возбудителя в клиническом образце.

Идентификация чистой культуры. Выделенные чис­тые культуры микобактерий обычно идентифицируют до вида. Идентификация осуществляется с помощью традиционных ме­тодов (на основании фенотипических признаков бактерий — культуральных и биохимических), а также с использованием молекулярно-генетических и химических методов анализа вы­деленной культуры.

Традиционные методы идентификации основаны на изуче­нии достаточно большого числа признаков, включая скорость роста, морфологию колоний, способность к пигментообразо-ванию, продукции никотиновой кислоты, восстановлению нит­ратов и теллурита калия, гидролизу твина-80, мочевины (уре-азная активность), пиразинамида до пиразиновой кислоты (пиразинамидазная активность), перекиси водорода при повы­шенной температуре (термоустойчивая каталазная активность) и некоторых других. На основании этих признаков можно однозначно идентифицировать представителей основных ви­дов Mycobacterium spp., вызывающих заболевания человека. Процедура идентификации по фенотипическим признакам может занимать до 3 нед. Специфичность метода составляет 100%.

Способность исследуемой культуры синтезировать никоти­новую кислоту (ниациновая проба Конно) является одним из важных признаков, с помощью которого удается отличить М. tuberculosis, хорошо синтезирующие никотиновую кислоту, от M.bovis, образующих ее в минимальных количествах. Для определения ниацина к культуре микобактерий в жидкой пи­тательной среде добавляют 1 мл раствора KCN и 1 мл 5 % раствора хлорамина. При наличии ниацина через несколько минут появляется ярко-желтая окраска. Для нейтрализации KCN после учета результатов реакции в пробирки добавляют 3—5 мл 10 % раствора гидрокарбоната натрия.

При выращивании микобактерий на предметных стеклах (метод микрокультур Прайса) вирулентные штаммы характе­ризуются ростом в виде жгутов или кос за счет образования корд-фактора (рис. 14.3.2; на вклейке). На нескольких пред­метных стеклах делают толстые мазки, высушивают, обрабаты­вают несколько минут 2—6 % серной кислотой и нейтрализуют. Затем стекла опускают во флаконы с гемолизированной цит-ратной кровью в разведении 1:4—1:8 и ставят в термостат. Через 7—14 дней извлекают стекла, фиксируют препарат, ок­рашивают по методу Циля—Нильсена и микроскопируют.

Идентификация микобактерий методом гибри­дизации ДНК ("ДНК-зондов"). Метод гибридизации ДНК применяют для быстрой идентификации чистой культуры микобактерий. Использование ДНК-зондов позволяет полу­чить окончательный ответ в течение суток после завершения культивирования и, таким образом, существенно сокращает общий срок исследования. На сегодня существуют ДНК-зонды для идентификации только наиболее клинически значимых и широко распространенных микобактерий, вызывающих забо­левания человека: комплекса M.tuberculosis, комплекса M.avium и M.kansassii. Таким образом, метод позволяет надежно иден­тифицировать представителей указанных видов и дифференци­ровать их от других патогенных микобактерий, а также от непатогенных сапрофитов, загрязняющих клинические образ­цы. Метод основан на гибридизации материала из чистой куль­туры с меченым ДНК-зондом, комплементарным видоспеци-фическим последовательностям в составе рРНК бактерий. Об­разовавшиеся в результате гибридизации ДНК-РНК-комплек­сы выявляют по наличию метки. Обычно используют флюоре­сцентную метку, присутствие которой легко обнаружить с по­мощью флюориметрии. Для надежной идентификации требу­ется не менее 10⁵ бактерий. При этом чувствительность и специфичность метода составляют 100 %.

При высоком содержании возбудителя в клиническом об­разце использование коммерческих систем культивирования в сочетании с гибридизацией ДНК позволяет получить оконча­тельный результат бактериологического исследования уже на 4—7-й день.

Идентификация микобактерий по липидному со­ставу (хе моидентификация). Анализ количественного и качественного состава липидов клеточной стенки микобакте­рий (миколовых кислот) осуществляют с помощью газожид­костной или жидкостной хроматографии. Метод позволяет осу­ществить идентификацию любого из известных 50 видов ми­кобактерий в течение 4 ч. Основными факторами, ограни­чивающими его широкое применение, являются необходимость использования дорогостоящего оборудования и техническая сложность интерпретации результатов.

Определение чувствительности возбудителя к антимикробным препаратам. Является обязательным эта­пом микробиологической диагностики туберкулеза и основой назначения адекватной этиотропной терапии. Традиционно опре­деление чувствительности микобактерий осуществляют методом серийных разведений препарата в питательной среде. Наиболее надежным считается использование плотных питательных сред с последующим подсчетом числа выросших колоний. Иссле­дование может занимать более 3 нед (до 3 мес), что обуслов­лено чрезвычайно низкой скоростью роста резистентных вари­антов. Клинические границы устойчивости М.tuberculosis (МПК): стрептомицин — 5 мкг/мл, ПАСК — 10 мкг/мл, туба-зид — 1 мкг/мл, циклосерин и этионамид — 30 мкг/мл. Бактерии считают резистентными в том случае, если более 1 % клеток чистой культуры сохраняет способность к образованию коло­ний в присутствии указанной концентрации препарата.

Применение современных методов контроля роста бактерий (см. выше) позволило существенно сократить срок исследова­ния (до 7—14 дней). Однако следует учитывать, что определе­ние жизнеспособности бактерий в присутствии антибиотика по интенсивности их метаболической активности не всегда позво­ляет надежно дифференцировать чувствительную культуру от смешанной, содержащей 1—10 % резистентных бактерий. В на­стоящее время осуществляется интенсивная разработка более надежных методов контроля жизнеспособности, основанных на прямом подсчете числа живых бактерий с использованием проточной цитофлюориметрии, позволяющих избежать подоб­ных ошибок.

Молекулярно-генетические методы определения чувствительности микобактерий к антимикробным препаратам. Методы ПЦР-диагностики позволяют обнару­жить наличие у возбудителя генов, контролирующих резис-тентность к определенному препарату. Уже разработаны тест-системы на основе ПЦР для определения резистентности к препаратам группы рифампицинов.

Биопроба. Ранее для диагностики туберкулеза применяли биопробу: чистую культуру М. tuberculosis выделяли из органов животного, зараженного исследуемым материалом. Исследуе­мый материал обрабатывают серной кислотой для освобожде­ния от посторонней микрофлоры, нейтрализуют и вводят под­кожно в количестве 2—3 мл морской свинке и кролику с отрицательными туберкулиновыми реакциями. Через 4 мес, если животное не погибнет, его забивают, проводят макро- и микроскопическое исследование органов и делают посевы. Ме­тод также применяется для определения вирулентности мико­бактерий. М.tuberculosis высокопатогенны для морских свинок и малопатогенны для кроликов. M.bovis высокопатогенны для кроликов. В настоящее время метод практически не применя­ется.

Экспресс-методы диагностики. Биохимические и молеку-лярно-биологические исследования. Исследуемый мате­риал, полученный из очага инфекции, используют для обнару­жения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. Метод позволяет обнаружить наличие видоспецифических нуклеиновых кислот микобактерий непосредственно в клиническом образце после обогащения. Исследование занимает около 4 ч. Существующие коммерческие тест-системы позволяют выявить в образце (мокроте, плевральном экссудате, пунктате лимфатических уз­лов и др.) присутствие МТС — бактерий комплекса М.tubercu­losis (М.tuberculosis, M.bovis/BCG, M.africanum) и надежно диф­ференцировать их от нетуберкулезных микобактерий. Последнее имеет принципиальное значение для раннего эмпиричес­кого назначения этиотропной терапии, поскольку нетуберку­лезные микобактерии, включая МЛ С, существенно отлича­ются от МТС по чувствительности к антимикробным пре­паратам.

Чувствительность метода приближается к 100 % только для образцов, в которых микобактерии были обнаружены бакте-риоскопическим методом, в других случаях она не превышает 90 %. Нельзя также исключить вероятность ложноположитель-ных результатов. Специфичность ПЦР по различным оценкам составляет 70—100 %. Таким образом, по чувствительности ме­тод ПЦР сопоставим с бактериологическим исследованием, однако позволяет получить результат в течение 24 ч от момента получения материала.

Результаты ПЦР-диагностики рекомендуется интерпретиро­вать в зависимости от данных бактериоскопического исследо­вания. Получение положительного ответа бактериоскопичес-ким методом и ПЦР позволяет диагностировать туберкулез и рекомендовать немедленное назначение противотуберкулезных препаратов по классической схеме. Отрицательный результат ПЦР при наличии кислотоустойчивых микобактерии в мазках позволяет исключить присутствие МТС и рекомендовать на­значение антимикробных препаратов, активных в отношении нетуберкулезных микобактерии. В других ситуациях рекомен­дуется ожидать результатов бактериологического исследова­ния.

Серодиагностика. Антитела к антигенам возбудителя в крови пациентов можно обнаружить с помощью РСК, РИГА и других серологических реакций. Необходимо иметь в виду, что поло­жительные результаты отмечаются не только при активном туберкулезном процессе в организме, но также при инфици­ровании М.tuberculosis и вакцинации, поэтому существенного диагностического значения не имеют.

Кожно-аллергическая проба. Ставится с туберкулином — очи­щенной белковой фракцией, полученной из фильтрата бульон­ной культуры М.tuberculosis. Используется для оценки течения туберкулезного процесса, определения эффективности вакци­нации и отбора контингентов для ревакцинации против тубер­кулеза. Туберкулин вводят внутрикожно в строго определенной дозировке (реакция Манту). Результаты (появление гиперемии и образование папулы в положительном случае) учитывают через 24—48 ч (см. рис. 10.4.1).

• Микробиологическая диагностика проказы

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: соскоб слизистой оболочки носа, кожные лепрозные узлы, пунктат лимфатичес­ких узлов, мокрота и др.

243

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование. Является основным ме­тодом лабораторной диагностики проказы, так как M.leprae на питательных средах не культивируется. В мазках, приготовлен­ных из материала и окрашенных по методу Циля—Нильсена, микобактерии располагаются скоплениями в виде пачек сигар или наподобие шаров.

Кожно-аллергическая проба (реакция Мицуды) ставится с лепромином. Учитывают реакцию через 24—48 ч по образова­нию инфильтрата на месте введения. Аллергическая реакция диагностического значения не имеет и применяется для харак­теристики клинического течения болезни.

• Микробиологическая диагностика актиномикоза

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: биоптаты ткани и пунктаты из глубоких очагов поражения, гнойное отделяемое^ экссудат, мокрота, промывные воды бронхов, моча.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование. Подозрительные плот­ные комочки из патологического материала переносят на пред­метные стекла в каплю 10—20 % раствора гидрокарбоната на­трия, слегка подогревают и готовят препарат "раздавленная" капля, который исследуют под микроскопом с объективами 8х и 40х. В положительном случае в препарате обнаруживают актиномицеты в виде друз — характерных зернистых образова­ний с плотным гиалиновым центром, окруженным лучистыми нитевидными клетками. Наряду с друзами встречаются отдель­ные грамположительные неравномерно окрашивающиеся вет­вистые бактерии (см. рис. 2.3.1). Друзы также могут быть обнаружены в гистологических срезах биоптатов органов, ок­рашенных стандартными (гематоксилин-эозин) или специаль­ными (окраска Брауна—Брена и др.) методами.

Бактериологическое исследование. Материал засевают на не­сколько питательных сред (тиогликолевую среду, кровяной агар, сердечно-мозговой агар, агар Сабуро и др.). Посевы ин­кубируют в анаэробных и аэробных условиях с добавлением 5 % СО₂. Через 18—24 ч на плотных питательных средах обра­зуются микроколонии, а через 1—2 нед — зрелые колонии. Характерным признаком является "паукообразная" структура микроколонии с многочисленными ветвящимися нитями по периферии. Зрелые колонии могут быть плоскими, морщинис­тыми, бугристыми или пленчатыми. Характер колонии и мор­фология клеток во многих случаях позволяет отнести иссле­дуемую культуру к роду Actinomyces. Окончательная идентифи­кация культуры до вида проводится на основании биохими­ческих и антигенных свойств. Для идентификации используют также методы ГЖХ.

244

Экспресс-методы диагностики. Иммунохимические ис­следования. Метод ИФ: для обнаружения возбудителя в па­тологическом материале фиксированные мазки обрабатывают специфическими флюоресцирующими антителами к антигенам актиномицетов. Свечение бактерий в образце свидетельствует о положительном результате.

Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих моле­кул можно поставить предварительный диагноз. Метаболиты возбудителя могут быть обнаружены в материале методом ГЖХ.

Серодиагностика. Ставится РСК с сывороткой крови боль­ного и антигеном, представляющим собой поливалентный ак-тинолизат. Положительная реакция наблюдается у 80 % боль­ных людей.

Кожно-аллергическая проба. Ставится с экстрактом из акти­номицетов.

• Диагностические, профилактические и лечебные препараты

Туберкулин сухой очищенный (PPD). Получен из фильтрата бульонной культуры микобактерий путем добавления химичес­ких веществ, осаждающих белок, с последующей очисткой и лиофилизацией. Применяют для постановки кожно-аллерги-ческой пробы.

Вакцина BCG. Живая лиофильно высушенная культура ави-рулентного штамма M.bovis BCG, полученного французскими учеными Кальметтом и Гереном. Применяется внутрикожно для активной специфической профилактики туберкулеза.

Лепромин. Гомогенизированная взвесь лепрозного узелка, инактивированного нагреванием. Применяют для постановки кожно-аллергической пробы при лепре.

Актинолизат. Фильтрат бульонной культуры спонтанно ли-зированных штаммов актиномицетов. Применяют для специ­фической иммунотерапии и в качестве антигена для постанов­ки РСК.

Актиномицетная поливалентная убитая вакцина. Готовится из спороносных штаммов актиномицетов. Применяют с лечебной целью.

Антибиотики. Для лечения туберкулеза: стрептоми­цин, ПАСК, производные ГИНК (тубазид, фтивазид, метазид и др.), этионамид, этамбутол, пиразинамид, рифампицин, цик-лосерин, канамицин, фторхинолоны и др. Обычно используют комбинации препаратов (не менее трех препаратов различных групп) с учетом чувствительности М.tuberculosis и клинической характеристики заболевания.

245

Микроорганизмы Заболевание (или синдром) Treponema pallidium Сифилис Neisseria gonorrhoeae Гонорея, бленнорея Haemophilus ducreyi Мягкий шанкр Chlamydia trachomatis серовары L1, Венерическая лимфогранулема L2,L3 Chlamydia trachomatis серовары D, Урогенитальный хламидиоз Е, F, G, И, I, J, К Calymmatobacterium granulomatis Паховая гранулема Mycoplasma hominis Урогенитальный микоплазмоз Ureaplasma urealyticum Уреаплазмоз Gardnerella vaginalis Гарднереллез (вагиноз, вагинит) Mobiluncus spp. Бактериальный (анаэробный) вагиноз

ражением других органов возможен для вирусов иммунодефи­цита человека, гепатита В, цитомегаловирусной инфекции. Мик­робиологическая диагностика урогенитальных инфекций, вы­званных простейшими, грибами и вирусами, излагается в со­ответствующих главах Руководства.