Главная страница
Навигация по странице:

  • Демонстрация

  • Задание студентам

  • Методические указания

  • Часть II ЧАСТНАЯ МЕДИЦИНСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ Глава 11 МЕТОДЫ КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

  • Тема 11.1. МЕТОДЫ КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОЦЕНКА ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ План Программа

  • Демонстрация 1. Образцы исследуемого материала (гной, экссудат, кровь, спинномозговая жидкость, моча и др.).Задание студентам

  • Глава 12 ВОЗБУДИТЕЛИ ГНОЙНО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ И РАНЕВЫХ ИНФЕКЦИЙ

  • Тец руководство. Руководство к практаческим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии под редакцией


    Скачать 2.14 Mb.
    НазваниеРуководство к практаческим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии под редакцией
    АнкорТец руководство.doc
    Дата28.01.2017
    Размер2.14 Mb.
    Формат файлаdoc
    Имя файлаТец руководство.doc
    ТипРуководство
    #290
    страница10 из 20
    1   ...   6   7   8   9   10   11   12   13   ...   20

    Тема 10.4. МЕТОДЫ ОЦЕНКИ КЛЕТОЧНОГО И ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА. ВАКЦИНЫ. ИММУННЫЕ СЫВОРОТКИ И ИММУНОГЛОБУЛИНЫ

    Иммунный ответ на инфекцию или иммунизацию вакцин­ными препаратами позволяет оценить функциональную актив­ность иммунной системы в целом. Выявление в организме продуктов иммунного ответа свидетельствует о том, что чело­век был инфицирован соответствующим возбудителем, что имеет большое эпидемиологическое значение. Нередко выяв­ление той или иной формы специфического иммунного ответа на конкретный антиген позволяет уточнить диагностику забо­левания.

    Оценка гуморального иммунного ответа базируется на вы­явлении специфических антител в сыворотке крови и других биологических жидкостях. Как правило, речь идет об опреде­лении количества антител (титра). Наиболее информативным считается определение количества антител в динамике инфек­ционного заболевания, так как именно нарастание титра анти­тел свидетельствует о текущей инфекции. Нарастание титра антител можно использовать и для оценки эффективности проведенной вакцинации. Диагностическую значимость имеет определение принадлежности специфических антител к тому или иному изотипу иммуноглобулинов: для первичной инфек­ции наиболее характерно накопление антител изотипа IgM, a рецидив инфекции сопровождается преобладанием антител изотипа IgG.

    Клеточно-опосредованный иммунный ответ оценивается чаще всего с помощью кожных проб. При внутрикожном вве­дении небольшой дозы экстракта из микроорганизма, содер­жащего его антигены, в положительном случае наблюдается покраснение, припухание и уплотнение (инфильтрат) на месте введения через 24—48 ч. Положительная реакция свидетельст­вует об инфицировании человека соответствующим микроор­ганизмом, которое привело к формированию в организме кло­на Т-лимфоцитов, способных распознать его антигены и акти­вироваться. Положительная кожная проба может быть резуль­татом эффективной вакцинации против соответствующей ин­фекции.

    План

    Программа

    Возможности методов серодиагностики при оценке гуморального иммунного ответа.

    Методы выявления иммунных комплексов.

    Кожно-аллергические пробы для оценки клеточного

    142

    иммунитета и реакции гиперчувствительности замед­ленного типа.

    Методы выявления специфической сенсибилизации Т-лимфоцитов.

    Получение и применение вакцин, анатоксинов.

    Получение и применение иммунных сывороток и им­муноглобулинов.

    Демонстрация

    Результаты теста торможения миграции лейкоцитов крови в присутствии причинного антигена.

    Набор ампулированных препаратов инфекционных аллергенов, вакцин, сывороток, иммуноглобулинов, диагностикумов.

    Задание студентам

    Протоколировать и оценить результаты развернутых ре­акций агглютинации, поставленных с парными сыво­ротками крови человека, иммунизированного бактериальной вакциной. Оценить эффективность вакцинации.

    Протоколировать и оценить результаты РСК, постав­ленных с парными сыворотками крови человека, им­мунизированного вирусной вакциной. Оценить эф­фективность вакцинации.

    Протоколировать и оценить результаты РСК, постав­ленной с сывороткой крови больного с бактериальной инфекцией для дифференциации первичной инфек­ции и рецидива.

    Методические указания

    1. Реакция торможения миграции лейкоцитов. В основе дан­ного метода лежит способность лимфоцитов после повтор­ного контакта с антигеном, к которому они были ранее
    сенсибилизированы, продуцировать различные лимфокины, в том числе влияющие на миграцию индикаторных клеток (гранулоциты, моноциты, макрофаги). Реакция торможе­ния миграции лейкоцитов (РТМЛ) периферической крови в присутствии причинного антигена позволяет выявить специфическую сенсибилизацию Т-лимфоцитов. РТМЛ ставят в ка­пиллярах или под слоем агарозы. Проводят инкубацию лейко­цитов крови в присутствии и в отсутствие причинного мик­робного антигена, после чего измеряют зоны миграции (в про­центах) в присутствии антигена по сравнению с контролем, принятым за 100 %.

    В случае выявления сенсибилизации к антигену на­блюдается торможение миграции лейкоцитов (индекс ниже 100 %).

    2. Постановка и оценка кожно-аллергической пробы. Для вы­явления специфической сенсибилизации (при туберкулезе, бруцеллезе и других инфекционных заболеваниях) ставят кожно-аллергические пробы. Например, при постановке про­бы Манту внутрикожно вводят раствор туберкулина опреде­ленной концентрации. Реакцию учитывают через 24—48 ч, оценивая степень выраженности гиперемии и инфильтрат вокруг места введения (рис. 10.4.1; на вклейке). В основе положительной кожной пробы лежит клеточная реакция гиперчувствительности замедленного типа, которая отражает специфическую сенсибилизацию организма к данно­му инфекционному аллергену. Она возникает в результате те­кущего, перенесенного заболевания, вакцинации или инфици­рования организма.

    3. Выявление нарастания титра антител в серологических ре­акциях с парными сыворотками больного или вакцинированного. Показателем развития гуморального иммунного ответа являет­ся нарастание титра специфических антител в сыво­ротке крови в течение 3—4 нед после инфицирования или вакцинирования. Это устанавливается в реакции с парными сыворотками, т.е. сыворотками, полученными от одного и того же человека в динамике инфекционного или вакцинального про­цесса (например, на 1-й и 3—4-й неделе). Появление антител в сыворотке человека, у которого ранее этих антител не было, называется сероконверсией. Диагностическое значение прида­ется, как правило, 4-кратному и более увеличению титра анти­тел.

    При бактериальных инфекциях или вакцинации бактери­альными вакцинами с парными сыворотками ставят реакции агглютинации, РИГА или РСК (табл. 10.4.1).

    Таблица 10.4.1. Результаты развернутой реакции агглютинации с бак­териальным диагностикумом и парными сыворотками человека, вакци­нированного бактериальной вакциной


    Сроки взятия крови

    Разведения сыворотки

    Конт­роль сы­воротки

    Конт­роль диа-гности-кума

    1:50

    1:100

    1:200

    1:400

    1:800

    До вакцинации ++

    Через 3 нед после +++ вакцинации

    При вирусных инфекциях или вакцинации вирусными вак­цинами с парными сыворотками ставят РСК, РТГА и реакцию нейтрализации вирусов (табл. 10.4.2).

    Нарастание титра антитоксических антител контролируют с помощью реакции флоккуляции или нейтрализации токсина.

    Сроки взятия Разведения сыворотки Конт- Конт-
    крови 1 1 1 1 роль сы- роль диа-
    1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 воротки гности-
    кума

    В самом начале + + — — — — — эпидемии Через месяц после + + + + — — — начала эпидемии




    Исследуе- Разведения сыворотки
    мая сыво- 1 1 1 1 1 1 1
    ротка 1:юо 1:200 1:300 1:400 1:500 1:600 1:700 1:800 1:1000

    После об- + + + ______ работки

    2МЕ

    Без обра- + + + + + + + + + ботки 2 ME

    воротке в результате обработки 2-меркаптоэтанолом свидетель­ствует в пользу первичной инфекции.

    Для определения принадлежности специфических антител к определенному классу (изотипу) иммуноглобулинов исполь­зуют также твердофазный иммуноферментный метод. Специ­фический антиген фиксируется на поверхности лунок планше­тов из полистирола и инкубируется с исследуемой сывороткой. После отмывания от несвязанных иммобилизованным антиге­ном белков сыворотки связанные антитела-иммуноглобулины идентифицируются с помощью антиизотипической антиглобу-линовой сыворотки или соответствующих МКАТ. Их связыва­ние в свою очередь устанавливается с помощью антииммуно-глобулиновой сыворотки с ковалентно прикрепленным фер­ментом.
    Часть II

    ЧАСТНАЯ МЕДИЦИНСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

    Глава 11
    МЕТОДЫ КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

    Основной задачей клинико-диагностических микробиоло­гических исследований является установление этиологического агента инфекционного заболевания — микроорганизма-возбу­дителя. Для решения этой задачи используют различные диа­гностические методы, которые можно подразделить на две группы в зависимости от подхода к определению возбудителя. Первая группа включает методы, направленные на обнаруже­ние присутствия в материале от больного самого возбудителя, а также его антигенов, нуклеиновых кислот (НК), характерных продуктов его жизнедеятельности или органических соедине­ний, входящих в его состав.

    Для обнаружения возбудителя применяют традиционные методы: микроскопические, микробиологические и биологи­ческие. Для выявления микробных антигенов используют им-мунохимические методы. Обнаружение НК и других биомоле­кул возбудителя осуществляют с помощью биохимических и молекулярно-биологических методов. Иммунологические, био­химические и молекулярно-биологические методы относятся к числу экспресс-методов диагностики инфекционных заболева­ний, поскольку позволяют получить результат в течение не­скольких часов.

    Вторая группа диагностических методов основана на выяв­лении специфической иммунной реакции на данного возбуди­теля со стороны макроорганизма: гуморальной — антител про­тив возбудителя (серодиагностика) или клеточной — ГЗТ (ал-лергодиагностика).

    Существующие методы диагностики отличаются друг от друга трудоемкостью, сроками проведения исследований, чув­ствительностью и специфичностью, а также информативнос­тью полученных данных. Выбор методов исследования зависит от предварительного клинического диагноза заболевания, его сроков и определяется биологическими свойствами микроорганизма-возбудителя и особенностями его взаимодействия с макроорганизмом в ходе инфекционного процесса.

    Тема 11.1. МЕТОДЫ КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОЦЕНКА ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

    План

    Программа

    Выбор, взятие и транспортировка исследуемого мате­риала.

    Оформление документации.

    Анализ результатов лабораторных исследований.

    Демонстрация

    1. Образцы исследуемого материала (гной, экссудат, кровь, спинномозговая жидкость, моча и др.).

    Задание студентам

    Заполнить типовые бланки для направления материа­ла в лабораторию.

    Изучить схемы и методы микробиологической диагностики основных групп микроорганизмов. При оценке результатов лабораторных исследований опре­делить патогенные и условно-патогенные микроорга­низмы.

    Методические указания

    • ОСНОВНЫЕ ПРАВИЛА ВЗЯТИЯ И НАПРАВЛЕНИЯ МАТЕ­РИАЛА В КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКУЮ МИКРОБИО­ЛОГИЧЕСКУЮ ЛАБОРАТОРИЮ

    Результаты микробиологических исследований во многом зависят от правильного выбора материала для исследования, соблюдения всех правил его получения и направления в лабо­раторию. Выбор материала определяется клинической карти­ной заболевания, предполагаемой локализацией возбудителя в организме на данном этапе инфекционного процесса и путями его выделения в окружающую среду.

    Материал берут в ранние сроки заболевания, до начала антимикробной терапии. Это повышает вероятность выделения возбудителя. Следует исключить попадание в образец антибио­тиков, антисептиков, дезинфектантов, а также частиц ваты, содержащей свободные жирные кислоты. Важным условием является достаточное количество материала для исследования (например, не менее 5—10 мл крови, 3—5 мл мочи и т.д.).

    Любой клинический материал для микробиологических исследований рассматривается как потенциально опасный для человека. Поэтому при получении, хранении и транспортировке материала в лабораторию строго соблюдают правила техни­ки бактериологической безопасности.

    3. Материал собирают, соблюдая правила асептики, для предупреждения его возможной контаминации нормальной микрофлорой организма больного и микроорганизмами окру­жающей среды. Используют стерильные инструменты и сте­рильную посуду, закрывающуюся пробками. После взятия ма­териала его в максимально короткие сроки доставляют в лабо­раторию. При отсутствии такой возможности материал со­храняют непродолжительное время, соблюдая определенные правила.

    Способ сохранения материала определяется свойствами предполагаемого возбудителя и самого материала. В большин­стве случаев возможно непродолжительное хранение в холо­дильнике при температуре 4 "С. Низкая температура препятст­вует размножению микробов нормальной микрофлоры, при­сутствующих в нестерильном материале (раневое отделяемое, мазки и смывы со слизистых оболочек, мокрота, моча, испраж­нения), а также способствует снижению активности микроби-цидных факторов организма (лизоцима, дефенсинов, компле­мента, клеток иммунной системы). При необходимости дли­тельного хранения материал можно подвергнуть глубокому за­мораживанию при температуре —20 °С и ниже.

    Если предполагаемый микроб-возбудитель чувствителен к действию низких температур, материал необходимо сохранять в термостате при 37 "С. Для подавления размножения сопутст­вующей микрофлоры можно использовать антимикробные препараты.

    Для предохранения микробов от высыхания материал реко­мендуется помещать в специальные транспортные среды, не содержащие питательных веществ, но обеспечивающие опти­мальные условия влажности, рН, осмолярности, ионной силы и т.д., необходимые для сохранения жизнеспособности возбу­дителя.

    При подозрении на анаэробную инфекцию необходимо со­здать бескислородные условия: поместить материал в электив­ные транспортные среды для анаэробов или в емкость, запол­ненную газовой смесью, не содержащей С^.

    Материал транспортируют в специальных биксах, пеналах или металлических контейнерах, которые после использования подвергают дезинфекции.

    Для серологического исследования у больного натощак берут кровь в количестве 5-6 мл из локтевой вены при соблю­дении правил асептики. Кровь ставят в термостат на 30-60 мин;
    образовавшийся кровяной сгусток отделяют от стенки стериль­ной стеклянной палочкой и оставляют материал в холодиль­нике на 18—20 ч. Отстоявшуюся сыворотку осторожно сливают в стерильную пробирку; в случае примеси эритроцитов ее центрифугируют. Сыворотка может храниться в стерильных условиях в холодильнике до 1 мес. Для более длительного, хранения ее замораживают при температуре от —20 до —70 °С.

    В микробиологической лаборатории все остатки патологического материала подлежат уничтожению (путем автоклавирования).

    Все материалы, направленные в лабораторию, должны иметь сопроводительный документ — направление на специальном бланке, где указаны фамилия, имя, отчество больного,
    возраст, вид материала, дата взятия, предполагаемый клини­ческий диагноз и другие сведения.

    • МЕТОДЫ КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ МИКРОБИО­ЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

    • Методы обнаружения возбудителя в материале от больного

    Для обнаружения возбудителя в материале от больного с диагностической целью применяют:

    микроскопические (бактериоскопические, микоскопические, вирусоскопические) методы;

    микробиологические (бактериологические, микологичес­кие, вирусологические) методы;

    биологические методы, или биопробы.

    1. Микроскопические методы. Микроскопические методы применяют для обнаружения возбудителей (бактерий, грибов, простейших, вирусов) непосредственно в исследуемом мате­риале.

    Для выявления бактерий (бактериоскопические ис­следования), а также грибов и простейших применяют све­товые методы микроскопии окрашенных или нативных пре­паратов, приготовленных из материала, полученного от боль­ного (см. тему 1.1 и главу 2).

    Преимущество микроскопических исследований состоит в быстроте (осуществление требует не более 30—60 мин), про­стоте и дешевизне. Основным недостатком метода является низкая специфичность — невозможность видовой идентифика­ции обнаруженных микроорганизмов, а в ряде случаев — их дифференциации между собой (например, эшерихий, сальмо­нелл и шигелл). Чувствительность также невысока: микроско­пический метод позволяет обнаружить возбудителя при его концентрации не менее 106 микробных клеток в 1 мл или 1 г исследуемого материала.

    В большинстве случаев микроскопический метод имеет ори­ентировочное значение и позволяет получить предварительные данные о микробах, присутствующих в материале, и наметить пути дальнейших исследований. Вместе с тем при некоторых бактериальных инфекциях, а также при микозах и протозойных инфекциях диагностическая ценность микроскопического исследования весьма велика и является основанием для поста­новки окончательного диагноза заболевания, например воз­вратного тифа, гонореи, дерматомикозов и др.

    Необходимо помнить, что некоторые бактерии (хламидии, микоплазмы) имеют малые размеры, лежащие за пределами разрешающей способности световой микроскопии, и не могут быть выявлены с помощью этих методов.

    Вирусоскопические исследования осуществляют с использованием электронной микроскопии (по причине малых размеров вирусов, см. тему 5.1). В сочетании с компьютерными системами анализа изображений эти методы позволяют осу­ществлять предварительную идентификацию вирусов по мор­фологии. К числу достоинств метода относится также возмож­ность обнаружения ранее неизвестных вирусов. Чувствитель­ность метода аналогична бактериоскопическому.

    Для диагностики инфекций, вызванных облигатными внут­риклеточными паразитами, применяют также цитологичес­кие методы, направленные на выявление характерного ЦПД в зараженных клетках, например внутриклеточных включе­ний — телец Бабеша—Негри при бешенстве, телец Пашена и Гварниери при оспе или цитомегалических клеток при заболе­ваниях, вызванных цитомегаловирусом (см. тему 5.2).

    2. Микробиологические методы. Основаны на выделении чистой культуры возбудителя из материала, полученного от больного, и ее последующей идентификации (см. главу 3). Микробиологические методы отличаются высокой чувстви­тельностью и специфичностью. Располагая чистой культурой возбудителя, можно определить его родовую и видовую при­надлежность и осуществить внутривидовое типирование, обна­ружить факторы вирулентности, а также определить чувстви­тельность к антибиотикам, что необходимо для рационального выбора этиотропной терапии.

    Для эпидемиологического анализа вспышек инфекционных заболеваний проводят типирование культур возбудителей, вы­деленных от разных больных и из внешних объектов — веро­ятных источников заражения (вода, пищевые продукты и т.д.), т.е. определение их биовара: серовара (серотипирование, см. тему 10.1), фаговара (фаготипирование, см. тему 5.3) и т.д. Кроме того, микробиологические исследования проводят для выявления носительства патогенных микробов среди детей и взрослых, а также среди работников медицинских учреждений, предприятий пищевой промышленности и общественного пи­тания.

    Бактериологическое исследование является ведущим в диагностике большинства бактериальных инфекций. Труд­ности метода могут быть связаны с низкой скоростью размно­жения бактерий-возбудителей, сложными ростовыми потребностями и требовательностью к условиям культивирования (га­зовому составу атмосферы и т.д.). Однако только выделение чистой культуры возбудителя из материала от больного при исключении контаминации имеет абсолютное диагностическое значение.

    Микологические исследования осуществляют реже, чем бактериологические, поскольку микроскопическая диа­гностика микозов достаточно надежна. Микологические иссле­дования являются обязательными при диагностике кандидозов, а также глубоких микозов.

    Вирусологический метод является наиболее достовер­ным для диагностики вирусных инфекций. Однако его приме­нение ограничивается трудоемкостью, что связано с особен­ностями хранения, транспортировки и обработки исследуемого материала, использованием культур клеток, сложностью и дли­тельностью культивирования многих вирусов, а также со срав­нительно частым получением отрицательных результатов. Идентификацию чистой культуры выделенного вируса осу­ществляют иммунологическими методами на основании его антигенной структуры, а также в ряде случаев с помощью биохимических и молекулярно-биологических методов (гибри­дизация НК, рестрикционный анализ и др., см. тему 3.2). Особое значение вирусологический метод приобретает в случае необходимости оценки чувствительности возбудителя к проти­вовирусным препаратам. В ряде случаев вирусологический ме­тод используют для ретроспективной диагностики вирусных инфекций.

    Все микробиологические методы имеют определяющее зна­чение в лабораторной диагностике инфекционных заболева­ний, являются наиболее информативными и достоверными. К числу недостатков можно отнести длительность (см. главу 3) и отсутствие методов культивирования некоторых микробов (например, возбудителей сифилиса и лепры).

    3. Биологические методы (биопробы). Биопробу осуществля­ют путем заражения лабораторных животных материалом, по­лученным от больного. Этот метод применяют для выделения чистой культуры возбудителя в тех случаях, когда микроорга­низмы не растут или плохо культивируются, когда микробио­логические методы не дают однозначно положительного ре­зультата, а также для дифференциации патогенных микроор­ганизмов и определения их вирулентности. Дифференциация возбудителей основана на неодинаковой чувствительности раз­ных лабораторных животных к определенным микроорганиз­мам. В настоящее время биопробы применяют только в случае крайней необходимости, что определяется в первую очередь гуманным отношением к животным, а также связано с повы­шенным риском заражения персонала диагностической лабо­ратории.

    • Иммунохимические методы диагностики: (методы обнару­жения антигенов возбудителя в материале от больного)

    1. Метод иммунофлюоресценции (ИФ). Дает возможностьобнаружить в материале от больного антигены микроба с по­мощью специфических антител, меченных флюорохромами
    (см. тему 10.1). Этот метод позволяет выявлять и идентифици­ровать по антигенной структуре возбудителей в материале, содержащем разнообразную микрофлору (например, в испраж­
    нениях), а также обнаруживать вирусные антигены в заражен­ных клетках. В настоящее время иммунофлюоресцентный ме­тод широко применяют для обнаружения разнообразных мик­
    роорганизмов в патологическом материале.

    Иммуноэлектронная микроскопия (ИЭМ). Позволяет зна­чительно повысить чувствительность и специфичность вирусоскопического метода. Исследуемый материал, содержащий
    свободные вирусные частицы, обрабатывают специфическими антителами. Образовавшиеся иммунные комплексы осаждают высокоскоростным центрифугированием и агрегаты вирусных
    частиц выявляют с помощью электронной микроскопии. Су­ществуют также твердофазные методы ИЭМ: специфические антитела фиксируют на специальных сетках для ЭМ, которые
    затем обрабатывают исследуемым материалом. Вирусные час­тицы специфически связываются с антителами, после чего их выявляют с помощью электронной микроскопии. В ряде слу­чаев применяют антитела, меченные частицами золота (см. тему 10.1).

    Другие серологические реакции. Растворимые антигены различных возбудителей (компоненты микробных клеток, вирионов, неструктурные вирусные белки, секретируемые зара­женными клетками, бактериальные экзотоксины и ферменты и т.д.) могут быть обнаружены в различных биологических жидкостях больного с помощью серологических реакций. Наи­более часто применяют иммуноферментный (ИФА) и радио­ иммунный (РИА) анализ в связи с их высокой чувствительнос­тью, реже используют методы преципитации в геле и непрямой агглютинации (см. тему 10.1).

    • Биохимические и молекулярно-биологические методы диа­гностики

    1. Метод газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Позволяет разделять сложные смеси органических соединений. Метод используют для обнаружения продуктов жизнедеятельности микроорганизмов в исследуемом материале (летучих жирных кислот, спиртов, нелетучих органических кислот и т.д.). Прин­цип метода основан на различной скорости движения соеди­нений, растворенных в инертном газе (подвижной фазе), через разогретую колонку, заполненную жидкими смолами (неподвижная фаза). На выходе колонки имеется детектор, регистри­рующий присутствие соединения. Идентификацию веществ производят путем сравнения со стандартами.

    2. Методы обнаружения нуклеиновых кислот возбудителя. Ну­клеиновые кислоты (НК) возбудителя можно обнаружить в исследуемом материале от больного с помощью методов гиб­ридизации НК (ДНК-зондов) и полимеразной цепной реак­ции — ПЦР (см. тему 3.2). Эти методы применяют преимуще- Ц ственно для обнаружения плохо- или некультивируемых воз­будителей, присутствующих в материале в малых количествах (ВИЧ, вирус гепатита В, М.tuberculosis и др.) в связи с их высокой чувствительностью: метод нуклеиновых "зондов" позволяет обнаруживать НК возбудителя в концентрации 10

    10 г/мл; ПЦР теоретически позволяет обнаружить единич­ные копии НК. Метод "зондов" является высокоспецифич­ным. При использовании ПЦР существует высокая вероят­ность получения ложноположительной реакции, что требует квалифицированной интерпретации полученных результатов. Не­обходимо также помнить о возможности контаминации материа­ла посторонними НК. ПЦР рационально использовать в качестве экспресс-метода для постановки предварительного диагноза, нуждающегося в обязательном подтверждении с помощью других более достоверных диагностических исследований.

    • Серодиагностика и аллергодиагностика

    1. Серодиагностика. Метод основан на обнаружении антител в сыворотке крови больного и определении динамики их на­растания в ходе заболевания. Для серодиагностики применяют различные иммунологические реакции (агглютинации, связы­вания комплемента, непрямой гемагглютинации и др., см. тему 10.2). В качестве стандартных антигенов используют живые культуры микроорганизмов (бактерий, вирусов, грибов) или диагностикумы — убитые взвеси микроорганизмов или экстра­кты из них, полученные химическим путем.

    Серодиагностические исследования часто проводят и для эпидемиологического анализа инфекционной заболеваемости. С этой целью определяют наличие специфических антител у здоровых лиц, что свидетельствует о перенесении ими инфек­ции или о контакте с соответствующим возбудителем. Кроме того, серологические реакции используют наряду с другими иммунологическими показателями для оценки эффективности вакцинопрофилактики.

    При серодиагностических исследованиях необходимо учи­тывать диагностический титр обнаруженных антител, т.е. такое разведение исследуемой сыворотки, начиная с которого поло­жительная реакция имеет диагностическое значение. Более вы­сокую информативность дают серологические исследования парных сывороток крови больного, взятых в начале болезни и через разные промежутки времени в ходе ее развития. Диагнос­тическое значение имеет нарастание титра в 4 раза и более в динамике заболевания.

    2. Аллергодиагностика. Кожно-аллергические пробы приме­няют для выявления гиперчувствительности к различного рода антигенам (аллергенам) при диагностике ряда инфекционных заболеваний (туберкулез, бруцеллез, туляремия и др.), а также различных неинфекционных аллергических состояний (атопии и др.).

    Кроме того, используют методы аллергодиагностики in vitro, позволяющие оценить состояние специфической сенсибилиза­ции лейкоцитов крови в отношении определенного антигена, например реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) в присутствии специфического антигена (см. тему 10.4).

    • ПРАВИЛА БИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РА­БОТЕ С ПАТОГЕННЫМИ МИКРОБАМИ

    При работе с патологическим материалом, содержащим микробы, и особенно при культивировании патогенных мик­робов во избежание заражения персонала лаборатории необхо­димо соблюдать правила техники биологической безопасности. В зависимости от степени патогенности и контагиозности воз­будителей принято выделять четыре уровня биологической опасности и соответствующих мероприятий, необходимых для предупреждения заражения в лаборатории.

    Первый уровень (работа с непатогенными микроорганиз­мами). Необходимо соблюдение стандартных правил (см. тему 1.1).

    Второй уровень (работа с низковирулентными микроорга­низмами). К числу дополнительных правил и мероприятий относятся использование лабораторной одежды и защитных перчаток; обязательное обеззараживание всех загрязненных от­ходов; ограничение доступа в лабораторию. Для предотвраще­ния попадания микробов в воздух рабочего помещения выпол­нение механических манипуляций, сопряженных с высокой вероятностью распыления микроорганизмов, необходимо осу­ществлять в специализированных закрытых легкодезинфици­руемых настольных боксах.

    Третий уровень (работа с высоковирулентными микроорга­низмами). К числу дополнительных правил и мероприятий относятся использование специальной защитной лабораторной одежды; контроль доступа в лабораторию. Все манипуляции с патологическим материалом необходимо осуществлять в спе­циализированных боксах.

    Четвертый уровень (работа с возбудителями ООН). Работа с возбудителями особо опасных инфекций (ООН) разрешена ис­ключительно в специализированных режимных лабораториях, имеющих оборудование, необходимое для эффективной защи* ты от патогенных микробов, их контроля и уничтожения. К числу дополнительных правил и мероприятий относятся наличие отдельных помещений для смены лабораторной одеж­ды и душевых, обязательное обеззараживание всех отходов лаборатории. Все манипуляции с патологическим материа­лом необходимо осуществлять в специализированных на­стольных боксах, снабженных системами стерилизации возду­ха (см. тему 7.1).

    • ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

    Обнаружение патогенных микроорганизмов, являющихся возбудителями заболеваний (например, микобактерии туберку­леза, гонококки и др.), имеет решающее значение для поста­новки диагноза.

    Выявление роли условно-патогенных микроорганизмов в этиологии и патогенезе заболеваний должно быть основано на строгой аргументации. Обязательным условием является кли­ническое, эпидемиологическое, микробиологическое и сероло­гическое исключение возбудителей инфекционных болезней (например, возбудителей кишечных инфекций, венерических болезней и др.). Для оценки роли условно-патогенных микро­организмов в патологии могут быть использованы следующие критерии.

    Выделение микроорганизмов из крови, спинномозговой жидкости или других жидкостей организма, которые в норме у здоровых людей являются стерильными.

    Обнаружение в исследуемом материале, особенно при дисбактериозах, условно-патогенных микроорганизмов в до­ статочно больших количествах (например, 105—107 микробных клеток в 1 мл). Для этого проводят количественное определе­ние микроорганизмов по числу КОЕ в 1 г или 1 мл испытуе­мого образца. Эти количественные показатели могут варьиро­вать в зависимости от вида микроорганизмов, типа исследуе­мого материала, характера и стадии заболевания.

    Повторное, многократное (в течение суток или через сутки) выделение одного и того же микроорганизма из одного и того же материала от больного (например, из крови при
    сепсисе и т.д.).

    Обнаружение идентичных условно-патогенных микроор­ганизмов в разных образцах материала (например, при пище­вых токсикоинфекциях — в промывных водах желудка, рвот­ных массах, испражнениях, пищевых продуктах).

    Нарастание титра антител в 4 раза и более в парных сыворотках крови больного в отношении условно-патогенного микроорганизма, который предполагается как возбудитель данного патологического процесса. В ряде случаев рекомендуется использовать в качестве антигенов аутоштаммы микроорганиз­мов, выделенные от больных.

    Положительные кожно-аллергические реакции у больных с аллергенами, приготовленными из условно-патогенных мик­роорганизмов.

    В случае внутрибольничных (нозокомиальных) инфек­ций — выделение идентичных культур микроорганизмов от группы больных.

    Совпадение данных лабораторного определения чувстви­тельности микроорганизмов к антибиотикам с эффективнос­тью антимикробной терапии в клинических условиях, под­
    тверждаемое улучшением состояния больного и уменьшением количества или элиминацией соответствующих микроорганиз­мов.

    Условно-патогенные микроорганизмы (синоним: оппор­тунистические) представляют собой большую группу микроор­ганизмов, занимающих различное систематическое положение.
    Они встречаются среди аэробных и анаэробных бактерий, гри­бов, простейших. В клинической микробиологии наиболее час­то встречаются условно-патогенные микроорганизмы, относя­
    щиеся к родам Staphylococcus, Streptococcus, Escherichia, Klebsiella, Proteus, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Pseudomonas, Haemophilus, Bacteroides, Veillonella, Vibrio, Peptococcus, Peptostreptococcus, Mycobacterium, Mycoplasma, Candida и др.

    • ОФОРМЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ЛАБОРАТОРНЫХ МИКРО­БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

    Результаты лабораторных исследований оформляют на спе­циальных бланках, которые передают лечащему врачу.

    В ответе прежде всего указывают наличие патогенных, а также условно-патогенных микроорганизмов, обнаруженных при микробиологическом исследовании. Сообщают также дан­ные лабораторного определения чувствительности микроорга­низмов к антибиотикам.

    При обнаружении микробных ассоциаций перечисляют все микроорганизмы, указывают доминирующие виды и коли­чественные микробиологические показатели.

    В соответствии с правилами международной номенкла­туры в ответах приводят видовые названия микроорганиз­мов, например: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa
    и т.д.

    С целью ускорения лабораторных исследований в ряде случаев при выделении условно-патогенных микроорганизмов вполне допустимо в ответе ограничиться указанием только
    родовой принадлежности обнаруженных микроорганизмов, например Proteus sp., Candida sp. и т.д.

    Глава 12

    ВОЗБУДИТЕЛИ ГНОЙНО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ И РАНЕВЫХ ИНФЕКЦИЙ

    Раневые и гнойные инфекции часто встречаются в хирур­гической, акушерско-гинекологической, терапевтической, пе­диатрической практике, а также других отраслях медицины. Нередко они носят характер внутрибольничной (госпитальной) инфекции. Возбудителями раневой и гнойной инфекции явля­ются бактерии, которые относятся к разным семействам, родам и видам. Среди них известны аэробные и анаэробные, грам-положительные и грамотрицательные бактерии.

    БАКТЕРИИ - ВОЗБУДИТЕЛИ РАНЕВОЙ И ГНОЙНОЙ ИНФЕКЦИИ

    Аэробные бактерии

    Грамположительные бактерии

    Chryseobacterium indologenes Chryseobacterium meningosepticum Enterococcus faecalis и другие виды Enterococcus Erysipelothrix rhusiopathiae Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus saprophiticus и другие виды Staphylococcus Streptococcus pyogenes Streptococcus agalactiae

    Грамотрицательные бактерии

    Burkholderia cepacia Citrobacter koseri Edwardsiella tarda Eikenella corrodens Enterobacter spp. Escherichia coli Haemophilus influence Klebsiella spp. Listeria monocytogenes Moraxella catarrhalis Proteus vulgaris Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas putida Pseudomonas fluorescens Salmonella enterica

    подвид enterica биовар typhimurium Serratia spp. Spirillum minus Streptobacillus moniliformis Vibrio vulnificus

    Анаэробные бактерии

    Неспорообразующие грамотрица­тельные анаэробы

    Bacteroides fragilis

    и другие виды рода Bacteroides

    Prevotella melaninogenica

    и другие виды рода Prevotella

    Porphiromonas spp.

    Fusobacterium spp.

    Veilonella spp.

    Неспорообразующие грамположи-тельные анаэробы

    Peptostreptococcus spp. Propionibacterium acnes

    Спорообразующие грамположи-тельные анаэробы

    Clostridium Clostridium Clostridium Clostridium Clostridium Clostridium Clostridium

    perfringens

    novyi

    septicum

    histolyticum

    ramosum

    sporogenes

    tetani

    Бактерии, перечисленные выше, вызывают гнойно-воспали­тельные процессы различной локализации, в том числе анги­ны, фурункулы, циститы и пиелиты, плевриты, перикардиты, сепсис и др. Многие из этих возбудителей встречаются в нор­мальной микрофлоре человека и проявляют свою патогенность только при нарушении нормальной экологии.

    Стафилококки, стрептококки, протей, эшерихии и анаэроб­ные бактерии нередко вызывают смешанную инфекцию как в разнообразных сочетаниях между собой, так и с другими мик­роорганизмами — вирусами, грибами.

    1   ...   6   7   8   9   10   11   12   13   ...   20


    написать администратору сайта