1-16 микра. Тема 1 Морфология микроорганизмов. Бактериоскопический метод диагностики
 Скачать 0.84 Mb.
|
|
Тема: Физиология бактерий. Методы культивирования бактерий. Бактериологический метод диагностики. План Питательные среды, классификация и требования, предъявляемые к ним. Материалы для бактериологического исследования и правила его забора. Выделение и идентификация чистой культуры бактерий. Принципы культивирования аэробных, факультативно-анаэробных и анаэробных бактерий. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний. Методы выделения чистой культуры. Идентификация микроорганизмов. Методы изучения биохимической активности бактерий. Факторы агрессии. Методы определения чувствительности к лекарственным препаратам. Применение антибиотиков. Принципы рациональной химиотерапии. Питательные среды, классификация и требования, предъявляемые к ним. Бактериологическое исследование основано на культивировании бактерий на питательных средах, выделении чистой культуры возбудителя и ее идентификации. Бактерии нуждаются в питательных веществах: источниках С, N, витаминах, минеральных и других веществах. Питание бактерий осуществляется через всю ее поверхность. Автотрофы используют СО2 и другие неорганические соединения. Гетеротрофы – питаются за счет готовых органических соединений. Сапрофиты питаются остатками отмерших организмов. Патогенные и условно-патогенные бактерии являются гетерохемоорганотрофами, питаются по законам осмоса. Питательные среды готовят из продуктов животного или растительного происхождения в зависимости от потребностей группы бактерий. Питательные среды должны отвечать следующим требованиям: - содержать основные питательные вещества в легкоусвояемой форме; - иметь опр. рН и окисл.- восстан.(ред-окс)потенциал; - обладать буферными свойствами; - быть влажными; - быть стерильными; - быть прозрачными. Среды различают: по консистенции (жидкие, полужидкие, плотные); по составу (простые, сложные); по назначению (основные, накопительные, селективные, дифференциально-диагностические, специальные, обогащенные, для хранения, консервирующие, транспортные), среды для анаэробов. Основные среды. МПБ, МПА, простые по составу для культивирования, большинства бактерий. Содержат: пептон, мясной экстракт, хлорид натрия. Для получения плотных сред к жидким добавляют агар-агар (2-3%) или желатин (10-15%). Сложные среды включают дополнительные компоненты к простым: кровь, гемин, сыворотку, асцитическую жидкость и др. Это обогащенные среды. Селективные (элективные) среды – для избирательного культивирования определенных следов бактерий при подавлении роста других. Дифференциально-диагностические среды используют для дифференциации бактерий по их биохимической активности и др.признакам. ( среды Эндо, Гисса, Левина, Рассела, Клигера и др.). Часто являются плотными, полужидкими. Транспортные и консервирующие среды – для временного сохранения м-ор-ов после взятия исслед.материала и при транспортировке его в лабораторию. Должны быть буферными, содержат соли. Среды для хранения культур – должны длительно поддерживать жизнеспособность м-ор-ов без изменения свойств культур. Материал для бактериологического исследования и правила его забора. При взятии материала для бактериологического исследования учитывать следующее: а) брать материал из очага инфекции или соответствующее отделяемое ( гной, мочу, желчь); при отсутствии локальных очагов – кровь; б) брать материал до начала антибактериальной терапии или через определенное время после выведения препарата из орг-ма; в) брать материал во время наибольшего содержания возбудителя ( н., в начале озноба); г) соблюдать правила асептики; д) отбор материала производить стерильно; е) в случае выделения строгих анаэробов материал получают путем пункции шприцем, из которого удален воздух, при исследовании тканей берут из глубины очага; ж) кол-во материала должно быть достаточным ( учитывать повторения); з) доставку материала осуществляют в короткие сроки в спец.биксах, пеналах и т.д.; если нет такой возможности – хранят в холодильнике; и) при транспортировке анаэробов материал защищают от воздействия воздуха; материал можно транспортировать в шприце, на кончик которого надета стерильная резиновая пробка; к) прилагается сопроводительный документ ( материал, Ф.И.О., название учреждения, номер истории болезни, предполагаемый диагноз, предшествующая антимикробная терапия, дата, время взятия образца, подпись врача, направляющего материал). Выделение и идентификация чистой культуры бактерий. Принципы культивирования аэробных, факультативно-анаэробных и анаэробных бактерий. а) Аэробные и факультативно-анаэробные бактерии. На I этапе из исследуемого материала готовят мазки, микроскопируют их, сеют материал на плотную среду в чашки Петри шпателем или бакт.петлей. Получается рост в виде изолированных колоний. Иногда исслед.материал сеют в жидкую накопительную среду, а затем пересевают на плотную в чашки Петри. Чашки с посевами инкубируют в термостате при 370С 18-24ч. На II этапе изучают культуральные свойства бактерий ( характер роста на пит.средах). Макроскопическое изучение колоний. Если колонии разные, их нумеруют и описывают каждую в отдельности выделяя свойства: величину колоний ( крупным > 4 мм, средние 2-4 мм, мелкие – 1-2 мм, карликовые – менее 1мм); форму колоний ( округлые, резоидная, розеткообразная и др); степень прозрачности (непрозрачная, полупрозрачная, прозрачная); цвет колоний; поверхность ( гладкая, блестящая, сухая, матовая, морщинистая); рельеф ( выпуклые, погруженные в среду, плоские, с валиком по краю, с куполообразным центром и т.д.). Микроскопическое изучение колоний. Чашку устанавливают вверх дном на столике микроскопа и при объективе 8х изучают колонии, фиксируя в протоколе их структуру ( гомогенная, аморфная, волокнистая и др.) и характер краев ( ровные, зазубренные, бахромчатые и др.). Из части колоний готовят мазки, окрашивают по Грамму и микроскопируют. При наличии однородных бактерий остаток колоний пересевают на скошенный агар для получения в достаточном количестве чистой культуры. Выращивают при 370С 18-24 часа. На III этапе из выросшей на скошенном агаре культуры делают мазки, окрашивают по Граму. О чистоте культуры судят по однородности роста, формы, размера и окраски бактерий. Для идентификации выделенной чистой культуры, кроме морфологических, тинкториальных и культуральных особенностей м-ор-ов, необходимо определить их ферментативные и антигенныые свойства, фаго- и бактериоциночувствительность, токсигенность и др.признаки их видовой специфичности. Ставят тест ОФ ( тест окисления / ферментации). Культуру засевают уколом в две пробирки с полужидкой средой, содержащей глюкозу и бромтимоловый синий; в одну вносят вазелиновое масло ( для создания анаэробиоза) и инкубируют обе пробирки при 370С. При образовании кислоты среда в обеих пробирках желтеет, что свидетельствует о ферментативной реакции. Образование кислоты в пробирке без масла свидетельствует об окислении глюкозы. Отсутствие кислоты в обеих пробирках свидетельствует о том, что тестируемые микроорганизмы относятся к «неферментирующим» видам. Для выявления нитратредуктазы ставят тест на восстановление нитрата в нитрит. Для определения каталазы используют 3% Н2О2 (наливают на поверхность культуры на скошенном агаре; при положительной реакции появляются пузырьки). Для выявления ферментов, расщепляющих глюкозу, используют диф.- диагн. среды Гиса. При ферментации углеводов с образованием кислоты цвет среды меняется за счет индикатора, что создает впечатление пестроты («пестрый» ряд). В зависимости от рода и вида бактерий подбирают среды с моно- и дисахарами ( глюкоза, лактоза, мальтоза, сахароза и др.), полисахаридами ( крахмал, гликоген, инулин и др.), высшими спиртами (глицерин, маннит и др.), в процессе ферментации которых образуются альдегиды, кислоты, газы (СО2 , Н2 , СН4 ). Протеолитические ферменты обнаруживают при посеве в столбик с желатином и через несколько дней выдержки при комнатной t (20-220С) определяют наличие разжижения, его характер (послойно, в виде гвоздя, елочки и т.д.). Показателем более глубокого расщепления белков является образование индола, аммиака, Н2S и др. соединений. Биохимические св-ва бактерий изучают с помощью специальных микротестсистем и микробиологических анализаторов (пластины с лунками, содержащими высушенные диф.- диагн.среды). При внесении испытуемой суспензии чистой культуры среда в лунках восстанавливается. При использовании анализаторов многие процессы автоматизированы(учет, посев, изменение мутности и цвета среды в лунке). ( встроен спектрофотометр). Антигенные свойства выделенной культуры изучают с помощью РА. Вирулентность определяют путем выявления факторов патогенности, заражения эксперим. животных, культур ткани или на эксп.моделях. Определяют чувствительность к антимикробным средствам высевом на жидкие и плотные среды. В отдельных случаях для выделения чистой культуры применяется биологическая проба (чума, сиб.язва, туляремия). Видовую принадлежность аэробных бактерий определяют путем сравнения морфологических, культуральных, биохимических, антигенных и др.св-в выделенной культуры со свойствами бактерий известных видов и вариантов. На IV этапе проводят учет результатов, анализ их и дают ответ по результатам посевов. б) Анаэробные бактерии. Основное требование при культивировании анаэробных бактерий – создание анаэробной атмосферы, удаление О2 из пит. среды и снижение ее редокс – потенциала. Создают эти условия след.методами: - применением спец. сред с редуцирующими веществами (среда Китта – Тароцци с кусочками печеночной ткани); - связыванием или замещением О2 в герметически закрытых сосудах - эксикаторах, анаэростатах, специальных пластиковых мешках; - изоляцией анаэробов в питательной среде от воздействия атм. О2 ( посев высоким столбиком в пробирку, заливка вазелинового масла на поверхность питат.среды, метод Перетца и др); - использованием специальных анаэробных боксов. На I этапе производят посев материала в среду Китта – Тароцци ( конц. МПБ или бульон Хоттингера – Мартена, с кусочками печени или фарша), посевы заливают вазелиновым маслом и инкубируют. На II этапе отмечают изменения в среде накопления (помутнение, газообразование). Готовят мазки, окрашивают по Грамму, делают пересев из среды накопления на спец.плотные среды для анаэробов. Получают изолированные колонии (метод Цейслера – посев на чашки с кровяным агаром) или метод последовательных разведений Вейнберга). На III этапе изучают выросшие изолированные колонии и из типичных делают мазки. Остатки колоний высевают на среду Китта – Тароцци, инкубируют при 370С. На IV этапе выросшую на среде Китта – Тароцци и культуру проверяют на чистоту и идентифицируют по морф., культ., биох., антигенным и др.свойствам. Иногда для идентификации выделенных культур ( или прямого обнаружения анаэробов в исследуемом материале) определяют газожидкостной хроматографией характерные метаболиты анаэробного «дыхания» - летучие жирные кислоты. На V этапе учитывают результаты исследования и анализируют их. 4. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний. Схема диагностики уже дана в 3 вопросе на примере культивирования аэробных и анаэробных бактерий. I этап инкубации – Микроскопирование и посев материала при 370С в течение 18-20 часов на плотные среды. II этап инкубации – Накопление чистой культуры, изучение культур. св-в изолированных колоний; микроскопирование (морф. и тинкт. св-ва); пересев на среду для накопления. III этап инкубации – Идентификация и изучение свойств чистой культуры: проверка чистоты выделенной культуры (мазки, окраски по Грамму; изучение биохимических свойств (ферментативной активности): сахаролитических, протеолитических; серотипирование; биотипирование; фаготипирование; генотипирование; определение токсигенности ( вирулентности); определение чувствительности к антибиотикам и др. антимикробным средствам инкубации. IV этап – Учет результатов. Определяют видовую принадлежность, сравнивая полученные результаты со свойствами бактерий известных видов и вариантов. 5. Методы выделения чистой культуры. Основаны на механическом разъединении микроорганизмов на поверхности питательной среды; это позволяет получить их рост в виде изолированных колоний. Исследуемый материал чаще всего сеют на плотную среду в чашки Петри шпателем или бактериологической петлей. Чашки инкубируют 18-24 ч при 37оС. полученную культуру исследуют по схеме (четыре фазы). На принципе механического разобщения м-ор-ов основаны след.методы: - серийных разведений в жидкой питательной среде (метод Пастера); - рассева по поверхности плотной питательной среды (метод Дригальского); - выделения чистой культуры из одной клетки с помощью микроскопа и микроманипулятора. 6.Идентификация микроорганизмов. 7.Методы изучения биохимической активности бактерий. 8. Факторы агрессии. Под факторами агрессии понимают приспособительные механизмы возбудителей инфекционных болезней к условиям макроорганизма. Для существования в макроорганизме микробы должны обладать адгезией, колонизацией, инвазивностью и агрессивностью, вызывать повреждения тканей и органов. Инфекционный процесс начинается с адгезии и колонизации. Адгезия обусловливает чувствительность хозяина к микробу и органотропность микробов. За прилипание к клеткам хозяина ответственны структуры микроба – адгезины. У гр(-) бактерий функцию адгезинов выполняют фимбрии ( пили 1 или общего типа), а также основные белки наружной мембраны. У гр(+) бактерий адгезины представляют собой белки и тейхоевые кислоты клеточной стенки; у микоплазм – макромолекулы выростов цитоплазматической мембраны. Колонизация зависит от дозы микробов и количества рецепторов на поверхности клеток макроорганизма. Если нет адгезинов и рецепторов, инфекционный процесс не развивается. Инвазивность – способность микробов проникать через кожные покровы и слизистые оболочки в организм хозяина и распространяться в нем. Агрессивность – способность противостоять защитным факторам организма и размножаться в нем, благодаря ферментам агрессии и инвазии. К ним относятся: -гиалуронидаза – фермент, разрушает гиалуриновую кислоту - основное межклеточное вещество соединительной ткани, помогая микробам проникнуть в глубь тканей макроорганизма; - нейраминидаза (сиалидаза) – фермент, расщепляет нейраминовую (сиаловую) кислоту на поверхностных рецепторах клеток слизистых оболочек, делая их доступными микробам и их токсинам; - фибринолизин – фермент, растворяет сгусток фибрина, образующийся в процессе воспаления и препятствующий проникновению микробов в органы и ткани; - коллагеназа – фермент, разрушает коллаген мышечных волокон, расплавляет мышечные ткани; - лецитиназа С – фермент, действует на лецитин мембран мышечных волокон, эритроцитов и др.клеток; - коагулаза – фермент, свертывает плазму крови; - ДНК –аза – дезоксирибонуклеаза – фермент,деполимеризует ДНК; - протеазы – ферменты, разрушают белки – иммуноглобулины. Данные ферменты, расщепляя высокомолекулярные соединения на низкомолекулярные, выполняют трофическую функцию, истощают макроорганизм. Жгутики бактерий также способствуют проникновению микробов в макроорганизм. Попав в макроорганизм, микробы, размножаясь, должны противостоять фагоцитозу. Клетки, фагоцитирующие микробы, могут мигрировать, способствуя распространению микробов по организму. Антифагоцитарной активностью обладают капсульные полисахариды и полипептиды микробов, К- и Vi-антигены микрокапсул энтеробактерий и др.структуры, которые создают механический барьер фагоцитозу. Антифагоцитарные свойства микробов проявляются также в синтезе ими веществ, подавляющих фагоцитоз, а также антигенная мимикрия, т.е. сходство антигенных детерминант у микроба и организма хозяина, когда микроб не распознается иммунной системой как чужеродный и остается в организме, а также способность микробов в процессе размножения в организме изменять свою антигенную структуру и «уходить» от действия специфических факторов иммунной системы. Наиболее важная роль в развитии инфекционного процесса принадлежит токсинам, экзотоксинам и эндотоксинам. Экзотоксины - белки бифункциональные – имеют транспортную группу, взаимодействующую со специфическим рецептором клеток, и токсическую группу (активатор), которая проникает внутрь клетки и блокирует жизненно важные процессы. Есть бактерии (Clostridium botulinum), которые образуют протоксины – нетоксичные, но под действием протеолитических ферментов превращаются в токсичную бифункциональную структуру. Экзотоксины по степени связи с бактериальной клеткой делятся на 3 класса: Класс А – токсины, секретируемые во внешнюю среду (н., Corynebacterium diphteriae продуцирует гистотоксин, Bac. Anthracis – отечный и летальный токсины). Класс В – токсины, частично секретируемые и частично связанные с бакт.клеткой ( н., тетаноспазмин Clostridium tetani, нейротоксин Clostridium botulinum). Класс С - токсины, связанные с микробной клеткой и попадающие в окружающую среду при аутолизе клетки ( н., цито-, энтеро-, нейро- и нефро- токсин Shigella dysenteriae). По механизму действия белковые токсины делят на 5 групп: повреждающие клеточные мембраны; ингибирующие синтез белка; активирующие метаболизм; протеазы; суперантигены – активирующие иммунный ответ макроорганизма. Экзотоксины термолабильны. Если микроб остается в месте входных ворот инфекции, такие инфекции называются токсинемическими ( дифтерия, столбняк, ботулизм, газовая анаэробная инфекция). Клинические проявления связаны с действием белкового токсина. Для лечения применяют анатоксины и антитоксические сыворотки. Эндотоксины имеются только у гр(-) бактерий, представлены белково-липополисахаридным ЛПС комплексом клеточной стенки, выделяются в окружающую среду при лизисе бактерий. Термостабильны, неспецифичны, оказывают воспалительное и пирогенное действия, индуцируют синтез биологически активных веществ ( более 20), обулавливающие нарушения в различных органах и тканях. Обладают антигенными свойствами, повышая неспецифичную резистентность организма ( активизируют синтез интерферона, систему комплемента – обладают свойствами адъювантов). 9. Методы определения чувствительности к лекарственным препаратам а). Определение фагочувствительности. Для определения видовой и родовой принадлежности бактерий используют чувствительность фагов к бактериям как один из признаков для их идентификации. Для этого чашки Петри с плотной питательной средой засевают газоном исследуемую культуру, посев подсушивают и на его поверхность наносят петлей или пастеровской пипеткой капли фага определенного разведения. Ставят в термостат на 12-18 часов. Литическое действие фага учитывают по появлению прозрачных «негативных»пятен, что позволяет исследуемые бактерии отнести к соответствующему виду или роду. Определение фаговаров бактерий. Проводится для эпидемиологического анализа и установления источников инфекции ( при кишечных, стафилококковых, дифтерийных и др.инфекциях). Чашки с МПА расчерчивают с обратной стороны на квадраты по количеству фагов и маркируют. Чашку засевают 3-4 часовой бульонной культурой бактерий газоном, подсушивают, на каждый квадрат наносят копию соответствующего фага в тест- разведении и инкубируют в термостате 12-18 часов. Учитывают чувствительность бактерий к определенному фагу по литическому действию. Это фаготипирование. Определение титра бактериофага. Количество фаговых частиц в исследуемом материале определяют методом агаровых пластинок по Грациа. Присутствие бактериофагов в материале является косвенным показателем наличия соответствующих бактерий. Чашку с агаром засевают смесью разведенного фага и индикаторных бактерий в расплавленном агаре. Негативные колонии фага соответствуют количеству фаговых частиц. Т.обр, бактериофаги применяют в лабораторной диагностике для идентификации бактерий с целью выявления источника инфекции( эпидемиологическое маркирование). Кроме диагностических бактериофагов, имеются лечебно- профилактические, применяемые для лечения и профилактики заболеваний ( дизентерия, холера и др.). б). Определение чувствительности м-ор-ов к антибиотикам. Для определения чувствительности культур возбудителей к антимикробным препаратам применяют диско – диффузионный метод, метод серийных разведений, метод Е-тестов, пограничных концентраций и др. Часто используют резистограмму штаммов – по их устойчивости / чувствительности к химиопрепаратам для оценки идентичности штаммов, выделенных из разных источников. Чувствительность м-ор-ов к антибиотикам и др. ХТП необходимо определять в каждом случае инфекции – в начале болезни и периодически – в ходе лечения. Наиболее обширную группу составляют противобактериальные антибиотики. Главным показателем чувствительности является минимальноая ингибирующая концентрация – МИК мкг/мл, т.е. концентрация антибиотика, задерживающая рост микроба – возбудителя в стандартном опыте. М-ор-зм считается чувствительным, если есть хороший терапевтический эффект. Устойчивым, если возбудитель имеет механизмы резистентности к данному антибиотику и нет клинического эффекта при лечении даже максимальными дозами. Микроорганизм умеренно устойчивый, если по своей чувствительности занимает промежуточное положение между чувствительными и устойчивыми штаммами и хороший эффект достигается при использовании высоких доз препарата. Метод серийных разведений – МИК определяют по мин.конц.антибиотика, задерживающей рост, содержащих убывающие концентрации антибиотика. ( стр.43, табл.3). Диско – диффузионный метод. Чистую культуру возбудителя засевают «газоном»на питат.агар стандартизированной суспензией. Затем на поверхность агара укладывают станд.бумажные диски, пропитанные антибиотиками ( на чашку диаметром 90 мм – 6 дисков). По диаметру зоны определяют степень чувствительности к антибиотику: чувствительны S, умеренно- устойчивые J и устойчивые R. Для S – достаточно трехкратного превышения МИК; для J – максимальные дозы, для R - данный антибиотик неэффективен. Метод Е – тестов – используют бумажные полости, пропитанные рядом убывающих концентраций определенного антибиотика (128, 64, 32, 16 …мк/мл), укладывают на поверхности питательного агара, заселенного культурой в виде «газона». Зона задержки роста сужается в области малых концентраций и пересекает полоску на уровне МИК (рис.1.14, стр.45). При массовых исследованиях используют автоматизированные методы определения чувствительности к антибиотикам( чаще – методы серийных разведений в планшетах и пограничных концентраций – микрометоды). 10. Применение антибиотиков. Химиотерапевтические средства – антибиотики – действуют на микробы, известны также противоопухолевые антибиотики, синтетические химиопрепараты – действуют на микробы и вирусы. Основоположник химиотерапии немецкий ученый П.Эрлих, лауреат Нобелевской премии (НП), получил первый химиотерапевтический препарат против сифилиса «Сальварсал», соединение мышьяка безвредное для макроорганизма. Другой выдающийся английский ученый А.Флеминг открыл пенициллин в 1928г., который продуцирует гриб р.Penicillium. Очищенный пенициллин был получен в 1940 г., Г.Флори и Э.Чейн. В 1945 г. А.Флеминг, Э.Чейн и Г.Флори получили НП. У нас в стране антибиотиками занимались З.В. Ермольева и Г.Ф.Гаузе, ими получены ряд антибиотиков. Основными продуцентами антибиотиков являются микроорганизмы. Антибиотики для них – средство борьбы за существование в себе подобными. Различают 6 групп антибиотиков в зависимости от происхождения: 1 – антибиотики, полученные из грибов р.Penicillium, p.Cephalosporium и др. 2- антибиотики, полученные из актиномицетов; представители p. Streptomyces являются продуцентами стрептомицина, левомицетина, эритромицина, нистатина и др. 80% антибиотиков получено из актиномицетов. 3 - антибиотики бактериального происхождения, p. Bacillus и p. Pseudomonas; 4 – антибиотики животного происхождения; 5 – антибиотики растительного происхождения ( фитонциды чеснока и лука); 6 – синтетические антибиотики. 3 способа получения антибиотиков: 1) Биологический синтез – используют штаммы микроорганизмов, продуцирующие наибольшее количество антибиотика, и специальные питательные среды. 2) Химический синтез – получены все синтетические антибиотики этим способом. 3) Комбинированный способ – сочетает биологические и химические синтезы. Антибиотики, полученные этим способом, называются полусинтетическими, они более экономичны, к ним более длительное время чувствительны микроорганизмы, устойчивые к природным антибиотикам. Спектр активности химиопрепаратов: а) антибактериальные, противогрибковые, противопротозойные – действуют на клеточные формы микроорганизмов. Узкий спектр действия – препарат активен в отношении только небольшого количества разновидностей (гр+) или (гр-) бактерий; широкий - когда препарат действует на достаточно большое количество разновидностей бактерий; б) противовирусные химиопрепараты; в) противоопухолевые Различают два типа антимикробного действия антимикробных химиопрепаратов – бактерицидное или фунгицидное – вызывает гибель бактерий или грибов, и бактериостатическое или фунгиостатическое - задерживает рост и развитие бактерий или грибов. По механизму действия различают 4 группы антибиотиков и синтетических препаратов: 1- вызывает нарушение синтеза клеточной стенки бактерий (пенициллин, циклосерин); 2 группа – нарушает структуру и синтез клеточных мембран (ЦПМ) (полимиксины); 3 группа – нарушает синтез белка (тетрациклины, аминогликозиды, хлорамфеникол); 4 группа - ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот (хинолоны; рифампицин; сульфаниламиды); Побочное действие антимикробных препаратов в том, что они действуют как на микроорганизмы, так и макроорганизмы. а). Осложнения антибиотикотерапии со стороны макроорганизма: Iгруппа осложнений – токсические реакции (поражения печени, почек, крови); II группа – вызывает дисбиозы (макроорганизм становится более чувствительным к инфекциям); III группа – отрицательно воздействует на иммунитет (возникают аллергические реакции; анафилактический шок; иммунодепрессивное действие – подавляются синтез антител, фагоцитоз). б). Изменения микроорганизмов, вызванные антибиотиками, могут быть нежелательные для человека изменения самих микроорганизмов: I – появление атипичных форм микроорганизмов – изменяются морфологические, биохимические и др. свойства, могут образоваться L – формы бактерий – такие микробы трудно идентифицировать, а следовательно, сложно поставить диагноз больному. II – формирование антибиотикоустойчивости, приобретенной в результате терапии антибиотиками, в отличие от врожденной, видовой устойчивости. Наиболее антибиотикорезистентны – стафилококки, шигеллы, кишечная палочка. Антибиотикоустойчивость отсутствует у стрептококков и гонококков. Иногда образуются антибиотикозависимые формы. Антибиотикоустойчивые бактерии появляются вне зависимости от применения антибиотика. Возникновение резистентности к антибиотикам связано либо со спонтанными мутациями в бактериальной клетке, либо с приобретением бактериальной клеткой R–плазмид. В обоих случаях резистентность передается другим клеткам в результате размножения или генетического обмена. Через 1-3 года после создания нового антибиотика появляются устойчивые к нему бактерии, а через 10-20 лет формируется полная резистентность к антибиотику. Устойчивость возникает к каждому антибиотику. В результате мутаций бактерия приобретает устойчивость к одному антибиотику; в случае с R–плазмидой – возникает устойчивость к 5-6 антибиотикам, а если бактериальная клетка имеет несколько R – плазмид, возникают полирезистентные штаммы. 11. Принципы рациональной антибиотикотерапии: I–Микробиологический принцип: применять антибиотики только по показаниям, по антибиотикограммам использовать метод бумажных дисков, метод разведений, определяют минимально подавляющую концентрацию МПК. II–Фармакологический принцип. Правильная дозировка, продолжительность лечения, методы введения, возможности сочетания лекарственных препаратов. При длительном лечении для предупреждения формирования антибиотикорезистентности применяют комбинацию химиотерапевтических препаратов. III - Клинический принцип. При назначении антибиотиков учитывают состояние больного, пол, возраст, иммунный статус, сопутствующие заболевания. IV - Эпидемиологический принцип. При подборе антибиотика необходимо знать устойчивые к нему микробы в окружающей больного среде. V–Фармацевтический принцип. Учитывать срок годности и правила хранения препарата; в противном случае возможны деактивация и деградация с образованием токсичных продуктов. Тема 3. Генетика микробов План Строение и репликация генома бактерий Изменчивость генома бактерий а) Мутации у бактерий б) Рекомбинация у бактерий (конъюгация, трансдукция, трансформация) 3. Особенности генетики вирусов 4. Применение генетических методов в диагностике инфекционных болезней 5. Генная инженерия. Методы генной инженерии. Практическое применение 1.Строение и репликация генома бактерий Наследственную функцию у бактерий выполняет ДНК; молекула ДНК состоит из двух полинуклеотидных цепей. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания (пуриновые - аденин, гуанин, пиримидиновые – тимин, цитозин), сахара дезоксирибозы и фосфатной группы. Каждый нуклеотид – полярный, у него дезоксирибозный 31-конец и фосфатной 51-конец. Нуклеотиды соединены в полинуклеотидную цепочку фосфодиэфирными связями между 51- концом одного нуклеотида и 31- концом другого. Цепочки соединены водородными связями комплементарных азотистых оснований: аденин-тимин, гуанин-цитозин. Размеры двухцепочечной ДНК характеризуются числом пар нуклеотидов (н.n.). Наследственная информация хранится в последовательности нуклеотидов ДНК: их последовательность определяет последовательность аминокислотных остатков в молекуле белка. Каждому белку соответствует свой ген, т.е. дискретный участок на ДНК, отличающийся числом и специфичностью последовательности нуклеотидов. Совокупность все генов называется геномом (генотип). Внешнее проявление генома называется фенотипом. Геном состоит из генетических элементов, способных к самостоятельной репликации, репликонов. Репликация – создание себе подобной структуры: синтез на каждый из нитей молекулы ДНК (РНК) парной ей нити лежит в основе передачи наследственной информации. Репликонами являются бактериальная хромосома и плазмиды. Бактериальная хромосома представлена одной двухцепочечной молекулой ДНК. Размеры её разные у различных представителей Procaryotae от 3х108 до 2,5х109н.n. бактериальная хромосома имеет гаплоидный набор генов, кодирует функции клетки. Плазмиды бактерий – двунитевые молекулы ДНК размером от 103 до 106н. n. Плазмиды сообщают бактериальной клетке устойчивость к антибиотикам, способствуют расщеплению сложных органических соединений, помогают продуцировать факторы патогенности. Количество плазмид в бактериальной клетке от 1 до 200. Некоторые плазмиды могут встраиваться в бактериальную хромосому и функционировать как единый репликон, такие плазмиды называются интегративными. Другие плазмиды способны перемещаться из одной бактериальной клетки в другую – их называют трансмиссивными – конъюгативными. Многие R – плазмиды придают бактериям устойчивость к антибиотикам, благодаря ферментам которые разрушают антибиотики. Бактериальные штаммы, несущие R-плазмиды, являются факторами «госпитальных инфекций» (хирургические отделения, родильные дома и т.д., но не инфекционные отделения). Есть Ent – плазмида – определяет развитие инфекционного процесса при сибирской язве, чуме, кишечном иерсиниозе и др. – связана с плазмидами патогенности, синтезирует энтеротоксины. Плазмиды используются в генной инженерии. Подвижные генетические элементы входят в состав бактериального генома, бактериальной хромосомы и плазмиды. Они содержат гены только для перемещения, перемещаются только с одного участка репликона на другой, а так же между репликонами; они обеспечивают: 1- синтез специфических молекул (н, токсинов);2- обеспечивают устойчивость к антибиотикам. В состав бактериального генома, бактериальной хромосомы и плазмиды, входят подвижные генетические элементы. Вставочные последовательности – это участки ДНК, перемещаются от одного участка репликона в другой и между репликонами. Они содержат гены перемещения. Транспозоны – это сегменты ДНК, обладают теми же свойствами, что и вставочные последовательности, но имеют гены, обеспечивающие синтез молекул (токсинов) или обеспечивают устойчивость к антибиотикам. Подвижные генетические элементы, перемещаясь по репликону или между репликонами, вызывают: инактивацию генов в участках ДНК, куда встроились; повреждения генетического материала; слияние репликонов, т.е. встраивание плазмиды в хромосому; распространение генов в популяции бактерий, изменяя их биологические свойства, смену возбудителя инфекции; эволюцию среди микробов. Воспроизведение генетического материала бактерий осуществляется в процессе репликации по полуконсервативному механизму. Каждая из двух цепочек ДНК хромосомы или плазмиды является матрицей для синтеза комплементарной дочерней цепочки ДНК при участии комплекса ферментов. Репликация начинается с расплетения двухцепочечной ДНК; формируются две репликативные вилки, которые двигаются в противоположных направлениях, пока встретятся. Формирование новой дочерней цепи происходит при участии фермента ДНК- полимеразы она присоединяет комплементарные матрице нуклеотиды к свободному 31-концу (дезоксирибозному) растущей цепочки. Для реакции полимеризации нуклеотидов на матрице родительской цепочки ДНК-полимеразе требуется праймер (затравка), представляющий собой короткую нуклеотидную цепочку, комплементарную матричной со свободным 31-концом. На этом свойстве ДНК-полимеразы основан новый диагностический метод ПЦР-полимеразная цепная реакция; позволяет обнаружить микроб в исследуемом материале по наличию ДНК микроба без выделения этого микроба в чистую культуру. 2.Изменчивость генома бактерий Изменения генома бактерий, а следовательно свойств бактерий, могут происходить в результате мутаций и рекомбинаций. а) Мутации у бактерий Мутации – это изменения в последовательности нуклеотидов ДНК, которые приводят к появлению дефектных, т.е. не свойственных микробу белков или к отсутствию их синтеза. Фенотипические изменения в форме мутаций могут быть связаны с морфологией бактериальной клетки, появляется потребность в факторах роста, т.е. ауксотрофность; в устойчивости к антибиотикам; изменяется чувствительность к t0; снижается вирулентность (аттенуация). Мутации бывают спонтанными, возникающими самопроизвольно, без воздействия из вне, и индуцированными. Спонтанные мутации появляются в результате ошибок репликации (повторения) ДНК и вследствие перемещения подвижных генетических элементов в популяции бактерий. Индуцированные мутации возникают под влиянием мутагенов-факторов воздействия, это физические (УФ-лучи, радиация), химические и биологические (транспозоны). Мутации бывают точковыми, когда повреждения ограничиваются одной парой нуклеотидов, и протяженными, т.н. аберрации, когда выпадает несколько пар нуклеотидов. Это явление выпадения нескольких пар нуклеотидов называется делецией; добавление нуклеотидных пар-дупликация. б) Рекомбинации у бактерий Генетическая рекомбинация – это взаимодействие между двумя геномами, т.е. ДНК, обладающими различными генотипами; оно приводит к образованию рекомбинаций ДНК, дочернего генома с генами обоих родителей. В процессе рекомбинации бактерии условно делятся на клетки – доноры, которые передают клеткам - реципиентам генетический материал. В клетку реципиент проникает не вся, а только часть хромосомы клетки – донора, один или несколько генов. Образуется только один рекомбинант, генотип которого представлен в основном генотипом реципиента с включениями одного или нескольких генов донора. Рекомбинация гомологичная, если участки ДНК обладают высокой степенью гомологии. Есть еще сайт - специфическая рекомбинация, она происходит в определенных участках – сайтах генома и не требует высокой степени гомологии ДНК; имеет место при включении плазмиды в хромосому бактерии. Рекомбинация – конечный этап передачи и обмена генетического материала между бактериями, осуществляется конъюгацией, трансдукцией и трансформацией. Конъюгация – передача генетического материала от клетки – донора в клетку – реципиент при контакте клеток. Трансдукция – это передача бактериальной ДНК посредством бактериофага. В процессе репликации фага внутри бактерий фрагмент бактериальной ДНК проникает в фаговую частицу и переносится в бактерию – реципиент во время фаговой инфекции. в) Трансформация – передача генетической информации через выделенную из клетки – донора ДНК, в природе может происходить самопроизвольно у некоторых видов бактерий (чаще гр+) – суть её в том, что выделенная из погибших клеток ДНК захватывается реципиентными клетками. Трансформация широко применяется в генной инженерии. 3. Особенности генетики вирусов Наследственная информация генома вирусов может быть записана как в ДНК, так и РНК. Мутации у вирусов могут происходить спонтанно, а также индуцировано под влиянием тех же факторов, мутагенов, что и у бактерий. Фенотипические мутации вирусного генома – это изменения в антигенной структуре, неспособность вызывать продуктивную информацию в чувствительной клетке, чувствительность к t0, изменения формы и размеров бляшек в культуре клеток под агаровым слоем. Свойства вирусов изменяются при одновременном заражении несколькими вирусами чувствительной клетки, как в результате обмена генетическим материалом (генетическая рекомбинация и генетическая реактивация), так и без него (комплементация и фенотипическое смешивание). Генетическая рекомбинация имеет место чаще у ДНК – содержащих вирусов. Среди РНК содержащих вирусов у тех, которые обладают фрагментированным генотипом (вирус гриппа). При рекомбинации происходит обмен между гомологичными участками генома. Генетическая реактивация наблюдается между геномами родственных вирусов, имеющих мутации в разных генах. При перераспределении генетического материала формируется полноценный дочерний геном. Комплементация – наблюдается в том случае когда один из двух вирусов, инфицирующих клетку, в результате мутации синтезируют нефункциональный белок. Другой вирус, немутантный, синтезирует полноценный белок, восполняет его отсутствие у мутантного вируса. Фенотипическое смешивание возникает при смешанном заражении чувствительной клетки двумя вирусами – часть потомства приобретает фенотипические признаки, присущие двум вирусам, но генотип их не изменяется. 4. Применение генетических методов в диагностике инфекционных болезней а) Метод молекулярной гибридизации позволяет выявить степень сходства различных ДНК; основан на способности двухцепочечной ДНК при определенных условиях (при пов. t0900 С), в щелочной среде денатурировать, т.е. расплетаться на две нити, а при понижении t0 на 100 вновь восстанавливаться в двухнитевую структуру. Используют меченые зонды. Зондом называется одноцепочная молекула нуклеиновой кислоты, меченная радионуклидами, с которой сравнивают исследуемую ДНК. Применяют для идентификации микробов. б) Полимеразная цепная реакция ПЦР – позволяет обнаружить микроб в исследуемом материале по наличию в нем ДНК без выделения микроба в чистую культуру. Применяют для диагностики вирусных и бактериальных инфекций. ПЦР основана на амплификации, т. е. увеличении количества копий специфического (маркерного) гена возбудителя. Для этого двунитевую ДНК, выделенную из исследуемого материала, денатурируют («расплетают» при нагревании) и достраивают (при охлаждении) к расплетенным нитям ДНК новые комплементарные нити. В результате из одного гена образуется два. Этот процесс копирования генов повторяется многократно. Достраивание новых комплементарных нитей ДНК происходит при добавлении к искомым генам праймеров (затравки из коротких однонитевых ДНК, комплементарных 3¹- концам ДНК искомого гена), ДНК – полимеразы и нуклеотидов. 5. Генная инженерия. Методы генной инженерии. Практическое использование. В основе генной инженерии лежит процесс получения рекомбинантных ДНК, содержащих, помимо присущего «хозяйской» ДНК набора природных генов, «чужой» ген или гены, взятые из другой ДНК. Напомним: генетическая рекомбинация – перегруппировка генетического материала (ДНК) родительских генетических структур (хромосом, плазмид и др.), приводящая к появлению новых сочетаний генов у потомства. Основной механизм генетической рекомбинации – кроссинговер (перекрест хромосом), т. е. происходит разрыв участков двух генетических структур , их обмен и восстановление. У микроорганизмов генетическая рекомбинация осуществляется в результате обмена участками двух молекул ДНК либо их фрагментов. Получение рекомбинантных ДНК состоит из нескольких этапов: выделение ДНК из организма; получение гибридных (рекомбинатных) молекул ДНК путем встройки в исходную ДНК «чужого гена», выделенного из другой ДНК или полученного химическим синтезом; введение рекомбинантной ДНК в живую клетку ( бактерий, дрожжей, растительных или животных клеток, клеток человека); создание клеток для проявления (экспрессии) генов рекомбинантной ДНК в живой клетке и секреции нового продукта, кодируемого «чужим» геном. Клонированный, т.е. выделенный из ДНК клетки природный или химически синтезированный ген целевого продукта (н., инсулина, интерферона) встраивается в ДНК (н., в плазмиду бактерии или в ДНК вируса) после расщепления ДНК ферментами рестриктазами. Вставленный в расщепленную ДНК ген «сшивается» с этой ДНК ферментами лигазами. Полученная рекомбинантная ДНК бактерий или вируса вводится в эту же бактерию или вирусную частицу, из которой была взята, и таким образом получают рекомбинантный штамм бактерий или вирусов. При культивировании такого штамма он синтезирует не свойственный ему продукт, кодируемый встроенным чужеродным геном (н., инсулин, интерферон). На этом принципе получены сотни рекомбинантных штаммов бактерий, дрожжей, вирусов, продуцирующие различные бав: антигены, антитела, ферменты, гормоны, иммуномодуляторы и др. Культивированием штаммов занимается биотехнология. На основе генной инженерии получены сотни препаратов: гормоны, антикоагулянты, тромболитики, вакцины (дрожжевая вакцина против генотипа В), иммуномодуляторы (интерфероны α, β, γ, интерлейкины 1,2 и др., фактор некроза опухолей, пептиды тимуса, миелопептиды), ферменты (уреаза), моноклональные антитела, диагностические препараты ( на ВИЧ – инфекцию, вирусные гепатиты и др). Генная инженерия оправдана в тех случаях, когда: вещество не возможно получить другим способом; технология более эффективна и экономична; экологически более безопасна. За генной инженерией большое будущее. В будущем позволит получить поливалентные живые (векторные) вакцины, более эффективные лекарственные препараты, регуляторные белки, осуществить генодиагностику и генотерапию. Большое будущее генной инженерии открывает расшифровка генома человека, которая позволит решить проблему генотерапии, генопрофилактики и генодиагностики инфекционных и неинфекционных болезней. Программа «Геном человека» разрабатывается во многих странах, особенно в США, Японии, России. Из 100000 генов, содержащихся в хромосомах человека, расшифровано около 5000 генов и уже это позволило приступить к успешной генотерапии некоторых болезней. |