1-16 микра. Тема 1 Морфология микроорганизмов. Бактериоскопический метод диагностики
 Скачать 0.84 Mb.
|
|
Тема 4. Диагностические препараты План Диагностические препараты. Антигены микроорганизмов. Получение и использование антигенов для диагностики. Получение и использование сывороток для диагностики. 1.Диагностические препараты. Диагностические препараты относятся к иммунобиологическим препаратам, их действие основано на иммунобиологических принципах и реакциях. Диагностические препараты, системы, наборы широко используют для диагностики инфекционных и неинфекционных болезней, индикации и идентификации бактерий, вирусов, грибов и простейших, для определения иммунного статуса, аллергий, иммунопатологий, иммунологической совместимости тканей, иммунных взаимоотношений матери и плода и т. д. Диагностикумы применяют для определения специфических антигенов и антител, аллергенов, сенсибилизированных иммунокомпетентных клеток (В-, и Т- лимфоцитов), факторов естественной резистентности (комплемента, интерферона, белков, сыворотки крови) иммунорегуляторов. В зависимости от назначения диагностические препараты содержат специфические антигены, антитела, аллергены, факторы естественного иммунитета и т.д., которые используют для выявления в реакциях или тест- системах. Иммунологические методы специфичны, высокочувствительны и достоверны, находят широкое применение в медицине. Эффективность этих методов возросла благодаря использованию моноклональных антител, очищенных и конц. антигенов. 2.Антигены микроорганизмов Антигены – полимеры органической природы, содержащиеся в микроорганизмах и других клетках или выделяемые ими, которые несут признаки генетически чужеродной информации и при введении в организм вызывают развитие специфических иммунных реакций. Под антигенами понимают вещества, вызывающие появление антител, и вещества, реагирующие с антителами. Это разные характеристики антигена. Важнейшие качество антигена –индуцировать образование антител (и другие формы иммунного ответа), т.е. антигенность определяется чужеродностью. Все антигены обладают специфичностью. Для медицинской микробиологии наибольший интерес представляют антигенные свойства бактерий, токсинов и вирусов. Их используют в практике для получения высокоэффективных иммуногенных препаратов, а также для идентификации возбудителей болезней. Бактериальная клетка представляет собой целый комплекс антигенов. Антигенными свойствами обладают жгутики, капсула, клеточная стенка, ЦПМ, рибосомы и др. компоненты цитоплазмы , а также различные белки, выделяемые бактериями во внешнюю среду, токсины, ферменты. Основные антигены: соматические О-антигены; жгутиковые Н-антигены; поверхностные или капсульные К-антигены. Соматические О- антигены в основном термостабильны, выдерживают нагревание до 80-100ºС. Антигенную специфичность гр(-) бактерий определяют полисахариды, содержащиеся в ЛПС клеточной стенки. По О- антигенам вид бактерий подразделяется на подвиды. Жгутиковые Н- антигены, имеющие белковую природу (состоят из белка флагеллина) термолабильны, разрушаются при 60-80 ºС. Тоже отличаются высокой специфичностью. Позволяют выделить различные серологические варианты. Например, группа сальмонелл на основании особенностей строения О- и Н- антигенов подразделяется на 2200 сероваров. Капсульные К- антигены располагаются на поверхности клеточной стенки, встречаются у бактерий, образующих капсулу, состоит из полисахаридов. Капсульным антигеном является Vi – антиген - антиген вирулентности (на поверхности многих энтеробактерий, обладающих высокой вирулентностью). Антигенными свойствами обладают бактериальные белковые токсины, ферменты и др. вещества, которые секретируются бактериями в окружающую среду (например, туберкулин). При взаимодействии со специфическими антителами токсины, ферменты и др. биологически активные молекулы бактериального происхождения теряют свою активность. Столбнячный, дифтерийный и ботулинический токсины относятся к сильным полноценным антигенам, поэтому их используют для получения анатоксинов для вакцинации людей. Протективные антигены – антигены, с сильно выраженной иммуногенностью, могут обеспечивать иммунитет макроорганизма ко всему инфекционному агенту( пример, возбудитель сибирской язвы). Перекрестно реагирующие антигены –установлено наличие общих антигенов у человека и возбудителей инфекционных болезней., т.н. антигенная мимикрия Макроорганизм тогда не способен вырабатывать иммунитет, и болезнь протекает более тяжело. Возможно, длительное носительство и неэффективность вакцинации являются следствием общности антигенов микроба с антигенами тканей человека. Суперантигены – активизируют Т- лимфоциты с секретированием избыточного количества интерлейкина – 2, который вызывает отравление. Избыток Т –лимфоцитов может привести к различным аутоиммунным заболеваниям и подавлению иммунной системы. 3.Получение и использование антигенов для диагностики Биологическая промышленность выпускает различные биологические препараты: вакцины, лечебно- профилактические иммунные сыворотки и иммуноглобулины , диагностические антигены и аллергены, бактериофаги. Принцип и методика получения диагностических антигенов аналогичны приготовлению инактивированных вакцин. Антигены содержат убитые целые микробные клетки или экстракты, полученные из соответствующих микроорганизмов. Аллергены в качестве диагностических препаратов представляют собой экстракты из бактериальной массы. Их используют при аллергических диагностике туберкулеза (туберкулин), бруцеллеза ( бруцеллин) туляремии (тулярин), сибирской язвы (антраксин). 4. Получение и использование сывороток для диагностики Диагностические иммунные сыворотки получают или от иммунизированных животных (гетерологичные сыворотки), или переболевших, а также вакцинированных людей (гомологичные сыворотки). Гетерологичные сыворотки готовят путем гипериммунизации лошадей и др. животных, т.е. многократного введения животным больших доз антигена по схеме и на пике антителообразования у иммунных животных забирают кровь, освобождают её от форменных элементов и фибрина, фильтруют, стандартизируют по концентрации антител (антитоксинов, агглютининов вируснейтрализирующих антител и т. д.), содержанию белка и др. свойствам. Такая нативная сыворотка содержит много балластных белков и имеет низкую концентрацию антител. Из нее получают иммуноглобулины путем выделения, очистки и концентрирования их ферментативным способом в сочетании с диализом, осаждением, хроматографией. Для получения гомологичных иммуноглобулинов и их активных фрагментов используют кровь иммунных (вакцинированных, переболевших) людей или специально вакцинированных доноров, плацентарную и абортную кровь. Иммунные сыворотки, иммуноглобулины, их фрагменты подразделяются на антитоксические, антибактериальные и противовирусные. К антитоксическим относятся сыворотки против дифтерии, столбняка, газовой гангрены, ботулизма, т.е. сыворотки, содержащие в качестве антител антитоксины, нейтрализующие специфические токсины. Антибактериальные сыворотки содержат агглютинины, преципитины, комплементсвязывающие и др. антитела к возбудителям болезней (дизентерия, коклюш, чума). Противовирусные сыворотки (гриппозная, коревая, антирабическая и др.), содержат вируснейтрализирующие, комплементсвязывающие и др. противовирусные антитела. Тема 5. Серологический метод лабораторной диагностики План лекции Реакции антиген-антитело и их практическое применение. Виды серологических реакций. Реакции агглютинации, их применение. Реакции преципитации, их виды, применение. Реакция нейтрализации. Реакции лизиса (РЛ) и связывания комплимента (РСК), их применение. Реакции иммунофлюоресценции. Иммуноферментный анализ. Реакции антиген-антитело и их практическое применение. Виды серологических реакций Взаимодействие антигена с антителом проявляется в форме различных иммунных, или серологических (от лат. Serum — сыворотка) реакций. В связи с их высокой чувствительностью и специфичностью они нашли широкое применение в диагностике болезней. Серологические реакции применяют для двух целей. Во-первых, по известному антигену — диагностикуму, определяют в исследуемой сыворотке наличие и количественное содержание специфических к данному антигену антител титрованием. Титр иммунной сыворотки — максимальное разведение, которое дает положительную реакцию. Во-вторых, с помощью известного антитела, т.е. диагностической иммунной сыворотки, определяют наличие в исследуемом материале специфического микробного антигена или осуществляют серологическую идентификацию выделенного возбудителя. Реакции агглютинации (РА), их применение. При РА происходит склеивание антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов, частиц латекса и др.). Образуется осадок (агглютинат) или хлопья. В РА участвуют антитела, относящиеся к IgG и IgM. РА используют для определения антител в сыворотке крови или бруцеллезе (реакция Райта, Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (реакция Видаля) и др. инфекционных болезнях, а также для определения возбудителя, выделенного от больного, для определения групп крови. Варианты реакции агглютинации: развернутая, ориентировочная, непрямая и др. Развернутая РА — для определения у больного антител: к разведениям сыворотки крови больного добавляют диагностикум (взвесь убитых микробов), инкубируют при 370С и отмечают наибольшее разведение (титр) сыворотки, при котором призошла агглютинация, т.е. образовался осадок. Характер и скорость агглютинации зависят от вида антигена и антител. Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) основана на исспользовании эритроцитов (или латекса) с адсорбированными на их поверхности антигенами и антителами, взаимодействие которых с соответствующими антителами или антигенами сыворотки крови больных вызывает склеивание и выпадение эритроцитов в осадок (в пробирке или ячейке). Эритроциты участвуют пассивно. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на блокаде, подавлении вирусов антителами иммунной сыворотки и вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты. РТГА применяют для диагностики вирусных болезней, вирусы которых (вирусы гриппа, краснухи и др.) могут агглютинировать эритроциты различных животных. 3. Реакции преципитации (РП), их виды, применение Преципитация — процесс, когда происходит агрегация с растворимыми антигенами; если же антиген представлен корпускулами, специфическая агрегация таких антигенов называется агглютинацией. В РП осадок комплекса антиген-антитело называется преципитатом. Реакцию провоят в пробирках, наслаивая растворимый антиген на иммунную сыворотку. На границе двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата (реакция кольцепреципитации). Если в качестве антигенов в реакции кольцепреципитации используют прокипяченные и профильтрованные водные экстракты органов или тканей, такая реакция называется реакцией термопреципитации (реакция Асколи). Реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони выполняется на агаровых пластинках, в лунках которых диаметром 2-3 мм раздельно помещают антигены и иммунные сыворотки, они диффундируя в агар, в месте «встречи» образуют преципитат в виде полосы. При постановке реакции радиальной иммунодиффузии вносится сыворотка в агаровый гель. В лунки геля коллоидный раствор антигена, который диффундируя в гель, образует кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена. Используют для определения содержания в крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента и др. Иммуноэлектрофорез — сочетание метода электрофореза и иммунопреципитации: смесь антигенов разделяется в геле электрофорезом, затем паралельно зонам электрофореза вносят иммунную сыворотку, антитела которой диффундируют в гель и в месте «встречи» с антигеном образуют линии преципитации. Реакция флоккуляуии (по Рамону) — появляется опалесценция или хлопьевидная масса (иммунопреципитация) при реакции токсин-антитоксин или анатоксин-антитоксин. Применяется для определения активности анатоксина или антитоксической сыворотки. 4. Реакция нейтрализации (РН) Ее проводят путем введения смеси антиген-антитело животным или чувствительным тест-объектам (эмбрионам, культуре клеток). Отсутствие повреждающего действия у них свидетельствует о специфичности взаимодействия комплекса антиген-антитело, о нейтрализующем действии иммунной сыворотки. 5. Реакции лизиса (РЛ) и связывания комплимента (РСК), их применение Лизирующее действие проявляется в реакциях лизиса и связывания комплемента. В основе РЛ — взаимодействие антигенов со специальными антителами. Иммуноглобулины при содействии комплемента разрушают эритроциты, выходит гемоглобин и смесь из мутной становится прозрачной. Реакция называется реакцией гемолиза. Могут лизироваться и бактерии. Реакции с участием комплемента основаны на активации комплемента комплексом антиген — антитело. В РСК при соответствии друг другу антигенов и антител образуется иммунный комплекс ИК, к которому через Fc — фрагмент антител присоединяется комлемент С, т.е. происходит связывание комплемента комплексом антиген-антитело, комплемент остается свободным. РСК проводят в две фазы: 1ф- инкубация смеси антиген+антитело+комплемент; 2ф- (индикаторная)-выявление в смеси свободного комплемента добавлением к ней гемолитической системы из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1ф при образовании комплекса антиген-антитело происходит связывание ими комплемента, и тогда во 2ф не произойдет гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов (реакция +). Если антиген и антитело не соответсвуют друг другу (в исслед. образ. нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2ф присоединится к комплексу эритроцит-антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз (реакция -). РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней (сифилис, реакция Вассермана). Реакция радиального гемолиза — ставят в лунках геля из агара, содержат эритроциты барана и комплемент. При внесении в лунки гемолитической сыворотки вокруг них образуется зона гемолиза в результате радиальной диффузии. Таким образом определяют активность комплемента и гемолитической сыворотки, а также антитела в сыворотке крови больных гриппом, краснухой, клещевым энцефалитом. Для этого на эритроцитах адсорбируют соответствующие антигены вируса, а в лунки геля с данными эритрацитами добавляют сыворотку крови больного. Противовирусные антитела взаимодействуют с вирусными антигенами, адсорбированными на эритроцитах, образуют комплекс, к которому присоединяются компоненты комплемента и наступает гемолиз. Реакция иммунного прилипания основана на активации системы комплемента корпускулярными антигенами (бактериями, вирусами), обработанными иммунной сывороткой. Активизируется третий компонент комплемента С3б, который присоединяется к корпускулярному антигену в составе иммунного комплекса. На эритроцитах, тромбоцитах, макрофагах имеются рецепторы, для С3б и при смешивании этих клеток с иммунными комплексами, несущими С3б, происходит их соединение и агглютинация. 6. Реакции иммунофлюоресценции РИФ- (метод Кунса) — основана на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминисцентного микроскопа (прямой метод). Обработанные специфической сывороткой бактерии светятся по периферии клетки в виде зеленой каймы. Разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Метод Кунса является экспресс- диагностикой для выявления антигенов микробов или определения антител. 7. Иммуноферментный анализ (ИФА) — выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных ферментом-меткой (пероксидазой, щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат и хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и продукты расщепления изменяют цвет хромогена -интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. ИФА применяют для диагностики бактериальных, вирусных и паразитарных болезней (ВИЧ, гепатита В и др.), определения БАВ в очень низких концентрациях. Радиоиммунологический анализ (РИА) — высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген — антитело с применением антигенов или антител, меченных радионуклидом 125J, 14C, 3H, 51Cr и др.). Иммуноблоттинг — высочувствительный метод, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Тема 6. Молекулярно-генетический метод лабораторной диагностики инфекционных заболеваний План лекции Метод молекулярной гибридизации. Этапы постановки ПЦР. Применение ПЦР в диагностике бактериальных и вирусных инфекций. Современные методы Саузерн- и Нозерн- блоттинг. 1. Метод молекулярной гибридизации Позволяет выявить степень сходства различных ДНК. Применяется для идентификации микробов для их точного таксономического положения. Основан на способности двухцепочечной ДНК при t 900C в щелочной среде денатурировать, т.е. расплетаться на две нити, а при понижении t на 100C вновь восстанавливать исходную двунитевую структуру. Метод требует наличия зонда, т.е. одноцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты, меченной радионуклидами, с которой сравнивают исслед.ДНК. Молекулярную гибридизацию проводят так. Расплетают молекулу исслед. ДНК, одну нить закрепляют на специальном фильтре, который помещают в раствор с радиоактивным зондом. Образуются двойные спирали. При наличии комплементарности между зондом и исследуемой ДНК они образуют двойную спираль. 2. Этапы постановки ПЦР. Применение ПЦР в диагностике бактериальных и вирусных инфекций Полимеразная цепная реакция ПЦР позволяет обнаружить микроб в исследуемом материале по наличию в нем ДНК без выделения микроба в чистую культуру. Применяется для диагностики вирусных и бактериальных инфекций. ПЦР основана на амплификации, т.е. увеличении количества копий специфического (маркерного) гена возбудителя. Для этого двунитевую ДНК, выделенную из материала, денатирируют («расплетают» при нагревании 94ºС 1 мин — стадия «плавления») и достраивают (при охлаждении 45-65ºС в течение 1-1,5 мин) к расплетенным нитям ДНК новые комплементарные нити. Используют праймеры, комплементарные определенному участку ДНК возбудителя. Праймеры получают из известных генов различных возбудителей в аппаратах -синтезаторах, сост. из 20-30 аминокислотных остатков. Нужно знать нуклеот. последовательность объекта исследования (вирус, бактерия и т.д.). Имеются данные о геноме различных патогенных микробов и ими пользуются при постановке ПЦР. Для ПЦР необходимо два праймера, каждый из которых комплементарен одной из цепей двуцепочечной молекулы ДНК. Присоединение («отжиг») праймеров происходит так: к образовавшимся в результате денатурации одноцепочечным ДНК присоединяются праймеры — один к 3' — концу выбранного для удвоения участка, второй — к 5' — концу. Этот этап называют «отжигом». Поддерживается температура 72°С оптим. t для полимеразы, применяемой в ПЦР. Фермент достраивает комплементарные цепи ДНК, начиная с 3'- концов праймеров навстречу друг другу. Этот этап называется «элонгация» (удлинение). С каждым циклом количество ДНК удваивается. Цикл повторяется при указанных t режимах (94º, 45-65º и 72º) автоматически с помощью амплификаторов (термоциклеров). Проводится 30 циклов, что позволяет получить 230 копий участка ДНК возбудителя. 3. Современные методы Саузерн- и Нозерн- блоттинг — высокочувствительный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Используют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др. Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их (блоттинг) из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Есть такие бумажные полоски с «блотами» антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Инкубируют, затем отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс (антиген+антитело больного+антитело против Ig человека) выявляют с помощью субстрата хромогена, изменяющего окраску под действием фермента. |