Тема 1 Морфология микроорганизмов. Бактериоскопический метод диагностики.
План:
Предмет и задачи медицинской микробиологии.
Мир микробов, распространенность микробов. Связь микробиологии с иммунологией.
Оснащение и режим работы бактериологической лаборатории.
Стерилизация и дезинфекция.
Строение микроскопа.
Бактериоскопия.
Принципы классификации микроорганизмов.
Морфология микроорганизмов.
Структура бактериальной клетки.
Методы окраски микроорганизмов.
Приготовление препарата для микроскопии.
Предмет и задачи медицинской микробиологии.
Микробиология – фундаментальная биологическая наука со своими разделами, которые отделились в самостоятельные научные дисциплины со своими целями и задачами: это общая микробиология, промышленная, сельскохозяйственная, ветеринарная, космическая и др. Наибольшее значение для человечества имеет медицинская микробиология, которая занимается изучением биологии болезнетворных микробов и особенностей взаимодействия их с организмами человека. Задачей медицинской микробиологии является выяснение этиологии инфекционных заболеваний, разработка специфических методов их диагностики, профилактики и лечения. Здесь достигнуты большие успехи, благодаря бурному развитию иммунологии, вирусологии, иммуногенетики, целью которой является генопрофилактика и генотерапия иммунодефицитов – ВИЧ-инфекций, онкозаболеваний, аллергий.
Микробы обитают в почве, воде, атмосфере, в организме человека, животных, растений даже в космосе. Видовой состав бактерий более 100 000 видов; грибов – до 250 000 видов. В организме человека обитает до 1013-14 только бактерий, составляют его микроэкологию, которые играют большую роль как в обеспечении нормальной его жизнедеятельности, так и в патологии человека. Количество микробов в окружающей среде огромно и влияет на биологические и природные процессы на Земле, особенно на санитарное состояние среды обитания человека. Общая биомасса микробов превышает биомассу растений и животных. Между микробами живой и неживой природой существует взаимосвязь – биогеоценоз –в почве, водоемах, атмосфере, организме человека, животных, растений. Вирусы могут существовать только в клетках человека, животных, растений или в клетках бактерий. Поэтому их подразделяют на вирусы человека, вирусы животных, растений или вирусы бактерий. Такое же подразделение применимо и к бактериям, грибам и простейшим – одни обитают в организме человека другие в организме животных, третьи– в растениях.
Все живые существа делятся на две большие группы: макромир и микромир. Макромир - растения, животные, насекомые, человек, т.е., организмы видимые невооруженным глазом, микромир – представители живого мира, которые можно увидеть лишь с помощью оптических и др. приборов. Это вирусы, бактерии, грибы, простейшие. Размеры их от 0,01 - 0,4 мкм, или 10-400 нм – 10 мкм и более. Их можно объединить словом – «микробы». Термин ввел французский ученый Седийо в конце XIX-в. К микробам относятся одноклеточные и многоклеточные микроорганизмы, имеющие ядро – эукариоты (от греческого karyon – орех, ядро); доядерные микроорганизмы, не имеющие оформленного ядра – прокариоты; сложно устроенные вирусы, представляющие собой комплекс нуклеиновых кислот, белков ферментов, инфекционные макромолекулы ДНК и РНК, инфекционные белки – прионы. Микромир имеет сложный геномный состав. Геном бактерий и грибов включает до 5000 генов, вирусов - до 100 генов, простейших 5000-10 000 генов. Для сравнения геном человека включает 35-40 тысяч генов.
Патогенных для человека микробов насчитывается 3500 видов, из которых 1000 видов являются вирусами. Человека подвержен примерно 10 000 болезней, на долю инфекционных приходится одна треть всех болезней человека.
«Микробиология – наука о строении, жизнедеятельности и экологии микробов – мельчайших форм жизни, не видимых невооруженным глазом» (А.А.Воробьев и др. 1994,1998г.). Разнообразие мира микробов обусловило дифференциацию науки микробиологии на ряд направлений. Медицинская микробиология изучает микробов (бактерий, грибов, вирусов, простейших), патогенных для человека; ветеринарная микробиология изучает микробов, патогенных для животных, с.-х. микробиология изучает микробов вредителей растений; морская микробиология изучает микробов – обитателей морей, океанов и др. водоемов. В последние годы выделилась и космическая микробиология. Биотехнология использует микробов для получения вакцин, диагностикумов, ферментов, антибиотиков и т.д.
Особенно тесно микробиология связана с иммунологией, которая зародилась в недрах микробиологии. Иммунология решает проблемы профилактики, диагностики и лечения как инфекционных, так и неинфекционных болезней, в основе которых лежат нарушения иммунной системы.
История развития микробиологии.
Микробы – одни из древнейших живых существ на планете, появившиеся раньше животных и человека. Патогенные микробы существовали и в древние времена, о чем свидетельствуют останки древних захоронений, мумий. Историю микробиологии можно разбить на пять периодов:
1). эвристический,
2). морфологический
3). физиологический
4). иммунологический
5). молекулярно-генетический
1). Эвристический период III-IV в. до нашей эры, еще Гиппократ высказал догадку (эвристика - догадка, домысел) предположение о том, что болезни, передающиеся от человека к человеку, вызываются какими-то невидимыми, неживыми веществами «миазмами». Еще до открытия микробов люди пользовались плодами деятельности микробов- виноделием, пивоварением, сыроделием выпечкой хлеба и т.д.
В XV-XVI в.в. врач и поэт Джералимо Фракасторо (1476-1553) высказал мнение, что болезни вызываются «живыми контагиями, которые передают болезни через воздух или через предметы, что необходима изоляция больного, уничтожение контагий, окуривание можжевельником и т.д. Фракасторо за его работы считают основоположником эпидемиологии, т.к. он впервые высказал, что болезни человека вызываются невидимыми живыми существами.
2). Морфологический период охватывает конец XVII и XVIII вв., когда голландский естествоиспытатель Антоний ван Левенгук (1632-1723) открыл бактерии с помощью микроскопа, который он сконструировал. Микроскоп давал увеличение в 300 раз. Рассматривал различные настои, налет с зубов, кровь, воду и т.д., Левенгук опубликовал свои данные в труде «Тайны природы, открытые Левенгуком» в 1695 г. Открытие Левенгука положило начало морфологическому периоду в развитии микробиологии. Петр I навестил Левенгука, будучи в Голландии, привез микроскоп в Россию. Первый русским микробиологом был врач Тереховский М.М. (1740-1796). С 1695 г. началось победное шествие микробиологии. Открывались все новые бактерии, грибы, простейшие, а в конце XIX-в., были открыты и вирусы. Данила Самойлович (1724-1810) был следующим выдающимся эпидемиологом, который работал с возбудителями чумы, заразил себя чумой. Были и другие выдающиеся исследователи (Мечников И.И., Заболотный Д.К., Гамалея Н.Ф., Чумаков М.П. и др.), которые участвовали в опытах по самозаражению возбудителями инфекционных болезней. В 1892 г. русский ботаник Ивановский Д.И. открыл вирусы. В 1992 г. отмечалось 100 лет со дня открытия вирусов. За последние 20-30 лет открыто около трех десятков новых или измененных вариантов уже известных микробов. Это т.н. эмерджентная группа, т.е. опасных непредсказуемых инфекций. Это вирусы иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусы геморрагических лихорадок (Марбург, Эбола, Ласса и др.), патогенные бактерии, вызывающие болезнь легионеров, лихорадку Лайма, Корона - вирусы, вызывающие атипичную пневмонию и др. Многие бактерии и вирусы в результате генетических трансформаций приобрели новые свойства, стали патогенными для человека (вирус оспы обезьян, хеликобактер пилори, вызывающий язвы желудка и двенадцатиперстной кишки и др.), получили распространение парентеральные гепатиты, туберкулез, хламидиоз. Некоторые микробы исчезли – натуральная оспа, ставится задача ликвидации полиомиелита и др. возбудителей. В будущем человека ожидают новые или измененные возбудители инфекционных болезней – вирусов Т-клеточного лейкоза, вирусов гепатита, хламидий, прионов, онковирусов и др.
3). Физиологический период начался с XIX-в. и продолжается до наших дней. Выдающуюся роль сыграли труды Луи Пастера (1822-1895), химик по образованию, организатор науки, сделал во многих отраслях науки основополагающие открытия.
Л Пастер открыл: а) природу брожения, б) анаэробиоз, в) основал принципы стерилизации, г) разработал принципы вакцинации и способы получения вакцин (вакцина против бешенства и др.). Немецкий бактериолог Р.Кох (1843-1910) разработал способ получения чистых культур, ввел в практику твердые питательные среды, окраску бактерий, микрофотосъемку, а также знаменитую триаду, получившую название триада Генля-Коха, по установлению этиологии роли микробов в инфекционном заболевании. Для этого необходимы три условия:
1. чтобы микроб обнаруживался у больного
2. получение чистой культуры микроба
3. микроб должен вызвать аналогичное заболевание у животных при заражении.
Но не всегда болезнь укладывается в эту триаду (ВИЧ-инфекции).
4). Иммунологический период. В конце XIX-в. и начале XXв. микробиология переживала взлет. В этот период работали выдающие ученые: Пастер, Мечников, Кох, Ру Эрлих и многие другие в институте Пастера, показав всему миру пример искреннего сотрудничества, несмотря на разные взгляды на проблемы. Иммунологический период в микробиологии начался со второй половины XIX-в. Еще 200 лет назад английский врач Эдуард Дженнер (1749-1823) нашел способ создания невосприимчивости к натуральной оспе человека путем прививки человеку вируса коровьей оспы, человек не заболевал. Это было величайшее открытие, но носило эмпирический характер. И только Л.Пастер в конце XIX-в. научно обосновал принцип вакцинации и способ получения вакцин, показав, что ослабленный различными способами (температурными воздействиями, неблагоприятными условиями для роста, пассажи через невосприимчивый организм) возбудитель холеры кур, бешенства, сибирской язвы, потерявший вирулентные патогенные свойства при введении в организм создает специфическую невосприимчивость к возбудителю. Пастер впервые получил из мозга кроликов больных бешенством собак путем многочисленных пассажей живую аттенуированную вакцину против бешенства, создал прививочные пункты; распространил способ вакцинации на многие страны. В России пастеровские прививочные станции были созданы в Одессе в 1886 г. и Перми Мечниковым И.И. и его учеником Гамалеей Н.Ф.
В 1886 г благодарное человечество, за сделанные великим французом открытия, на собранные средства, построило в Париже Пастеровский институт, успешно продолжающий работать и в наши дни. Забегая вперед, в 1983г. Люкс Монтанье открыл вирус иммунодефицита человека одновременно с американским ученым Робертом Галло.
В Пастеровском институте работали выдающиеся ученые. И.И. Мечников (26 лет был заместителем Пастера), Э. Ру, А. Кальметт и К. Герен (создал вакцину БЦЖ), А. Лаверан (открыл плазмодии малярии), А.М. Безредка (предложил метод десенсибилизации – уменьшение или устранение повышенной чувствительности - сенсибилизации), Ж. Борде (иммуно – химик), Г. Рамон (получение анатоксинов), Н.Ф. Гамалея (по вакцинации), С.Н. Виноградский (почвенная микробиология). Особо остановлюсь на И.И. Мечникове. Он внес огромный вклад в развитие иммунологии, обосновав учение о фагоцитозе и фагоцитах, доказал, что фагоцитоз – универсальное явление для живых, заложив фундамент теории клеточного иммунитета и процесса иммуногенеза в целом с учетом клеточных и гуморальных факторов. Оппонентом Мечникова был П.Эрлих – автор гуморального иммунитета, полагавший, что только антитела играют роль в процессе иммунитета. Мечников и Эрлих оба удостоены Нобелевской премии в 1908 г. И.И. Мечников, будучи разносторонним ученым, внес вклад в развитие геронтологии, учения о дисбактериозах. В середине XX-в. были открыты основные формы реагирования иммунной системы и основные факторы иммунитета.
Еще в 1900 г Р.Кох открыл гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ), в 1902 – 1905 г.г. Ш. Рише, Ж. Портье, Г.П. Сахаров – гиперчувствительность немедленного типа (ГНТ). В 1950-х годах П. Медовар и М. Гашек – открыли толерантность (устойчивость) к антигенам, а Ф. Бернет – иммунологическую память. В середине XX-в. многочисленные исследования были посвящены изучению лимфоцитов, их роли в иммунитете, кооперативным взаимодействиям между Т- и В- лимфоцитами и фагоцитирующими клетками, киллерной функции лимфоцитов и т.д. Была изучена структура иммуноглобулинов, открыты интерфероны (А. Айзекс и Ж. Линдеман), интерлейкины идругие иммуномодуляторы.
5). Молекулярно – генетический период. Развитие биологической науки во второй половине XX-в. дало новый толчок к развитию микробиологии и иммунологии, особенно молекулярных и генетических аспектов этих наук. Была расшифрована молекулярная структура многих бактерий и вирусов, строение и состав их генома, структура антигенов и антител, факторов патогенности бактерий и вирусов, факторов иммунной защиты (комплемент, интерфероны, иммуномодуляторы и др.). достигнуты большие успехи в изучении иммунокомпетентных клеток (Т – и В – лимфоцитов, фагоцитов), механизмов функционирования и взаимодействия между собой и другими факторами иммунной защиты, явления апоптоза лимфоцитов, учение о стволовых, дендритных клетках и т.д. Расшифровка генов бактерий и вирусов, их синтез позволили искусственно синтезировать рекомбинантные ДНК и получать на их основе с помощью генной инженерии рекомбинантные штаммы бактерий и вирусов, которые нашли широкое применение в биотехнологии для получения различных биологических антибактериальных веществ (интерферонов, интерлейкинов, антигенов, антител, гормонов, лекарств и др.), вакцин. На повестке дня – иммуногенетика, целью которой является генопрофилактика и генотерапия иммунодефицитов, онкозаболеваний. Широко применяется в микробиологии генодиагностика (ПЦР-полимеразная цепная реакция), достигнуты заметные успехи в изучении системы гистосовместимости для решения проблемы преодоления иммунологической несовместимости в трансплантологии.
Вклад отечественных ученых в развитие микробиологии и иммунологии
О многих выдающихся ученых, внесших мировой вклад в развитие микробиологии и иммунологии я уже говорила. Это Мечников И.И. и его ученики: А.М. Безредка, Н.Ф. Гамалея, Л.А. Тарасевич, Н.Г. Габричевский, С.Н. Виноградский, Д.И.Ивановский. Отечественными учеными созданы многие диагностические, профилактические и лечебные иммунобиологические препараты применяемые во всем мире: (это живые вакцины против сибирской язвы, туляремии, полиомиелита, кори, Ку-лихорадки, гриппа и др.), а также полианатоксины, вакцины пероральные для массовых способов иммунизации, всего у нас производится до 1000 иммунобиологических препаратов. Ученые, к которым человечество питает благодарность за все это: М.П.Чумаков, Н.Н.Гинзбург, П.Ф.Здродовский, В.Д.Тимаков, Л.А.Зильбер и многие другие, о которых мы вспомним в соответствующих разделах курса.
Зачем врачу нужны знания по микробиологии и иммунологии?
Микробиология и иммунология проникают во все медицинские дисциплины: хирургию, терапию, онкологию, нервные болезни, урологию, эндокринологию, инфекционные болезни и т.д. Почти во всех специальностях используются микробиологические и иммунологические методы для диагностики, лечения и профилактики инфекционных и неинфекционных болезней. Любой врач и медицинский работник должны знать основы микробиологии и иммунологии. Только инфекционные болезни составляют 70% всех болезней человека, так что делайте вывод, будущие врачи.
Оснащение и режим работы бактериологической лаборатории.
Микробиологическая лаборатория включает следующие помещения: 1)препараторскую для подготовки лабораторной посуды, приготовления питательных сред и др. вспомогательных работ; 2) моечную; 3) автоклавную, в которой стерилизуют питательные среды и лабораторную посуду; 4) комнату для взятия материала от больных и носителей; 5) комнаты для микроскопических и микробиологических исследований с 1 или 2 боксами; 6) помещения для обеззараживания отработанных материалов. Для биологических проб отдельные помещения – виварии для животных.
Для посева материала, заражения тканевых культур, эмбрионов используют специальные помещения – боксы, которые до и после работы обрабатывают дезинфицирующими растворами и облучают бактерицидными лампами.
Основное оборудование бактериологической лаборатории: приборы для различных видов микроскопии, нагревательные приборы ( газовые и спиртовые горелки, электропечи и др.), холодильники, термостаты, аппараты для стерилизации ( стерилизатор – автоклав, печь Пастера, свертыватель и др.), центрифуга, дистиллятор и др., автоматические пипетки или пипетки с резиновой грушей, бактериологические петли, препаровальные иглы, пинцеты и др.
Стерилизация и дезинфекция.
Стерилизация – обеспложивание, т.е. полное уничтожение вегетативных и споровых форм микроорганизмов в различных материалах. Проводят физическими методами: 1) воздействие высокой t; 2) ультрафиолетовым облучением; 3) механически – фильтрованием жидкостей через бактериальные фильтры, а также химическими методами.
Физические методы стерилизации.
1. Прокаливание в пламени спиртовки или газовой горелки. Для стерилизации бактериологических петель, препаровальных игл, пинцетов. 2. Стерилизация кипячением. Стерилизуют шприцы, мелкий хирургический инструмент, предметные и покровные стекла и др. В воду добавляют 1-2% бикарбоната натрия, кипятят не менее 30 мин. Данный метод не обеспечивает полной стерилизации, т.к. некоторые вирусы ( н., вирус гепатита) и споры бактерий могут остаться жизнеспособными.
3. Стерилизация сухим жаром в сушильном шкафу (печи Пастера). При t 165 – 1800С стерилизуют стеклянную посуду: чашки Петри, пробирки, пипетки и др. При более высокой t обугливаются ватные пробки и бумага, в которую завернута посуда.
4. Стерилизация паром под давлением в автоклаве. Стерилизуют питательные среды, перевязочный материал, белье при давлении 1 атм. В течение 15 – 20 мин, питательные среды с углеводами – при 0.5 атм в течение 15 мин; обеззараживание инфицированного материала проводят при 1,5 – 2 атм в течение 20-25 мин.
5.Стерилизация текучим паром в аппарате Коха или в автоклаве. Применяется для стерилизации питательных сред с витаминами, углеводами, погибают вегетативные клетки. Для полного обеспложивания применяют дробную стерилизацию, т.е. стерилизуют материал при 100оС (или 80-90оС) в течение 20-30 мин. 3 дня подряд. Вегетативные клетки погибают, а споры сохраняются и за сутки прорастают. Двукратное прогревание обеспечивает надежную стерильность материала.
6. Тиндализация. Дробная стерилизация при 56 – 58 о С в течение часа 5-6 дней подряд; применяется для легко разрушающихся при высокой t веществ (сыворотка крови, витамины и др.).
7. Пастеризация. Нагревание материала производится при t 50-65оС в течение 15-30 мин или 70-80оС в течение 5-10 мин с последующим быстрым охлаждением. Погибают вегетативные клетки. Пастеризуют напитки и пищевые продукты ( молоко, вино, пиво, соки и др.).
8. Стерилизация УФ – лучами. УФ – лучи длиной волны 260 – 300 нм используют для стерилизации воздуха в операционных, боксах, детских учреждениях и др. ( бактерицидные лампы БУВ -15, БУВ – 30).
9. Стерилизация ионизирующим излучением. ( «холодная стерилизация») – наиболее перспективный способ стерилизации. Стерилизацию проводят в товарной упаковке. Установка представляет собой бетонную камеру с толстыми стенами для защиты персонала от излучения. Этим способом стерилизуют хирургический инструментарий, изделия из пластмасс (шприцы), вакцины, лечебные сыворотки, лекарства.
10. Фильтрование. Для стерилизации жидкостей используют фильтры из коллодия, диаметр пор которых меньше размеров вирусов. Этот метод применяют в биотехнологии при изготовлении вакцин, иммунных сывороток, растворов антибиотиков, бактериофагов и других материалов, не пригодных для тепловых или других методов стерилизации. Фильтрование через бактериальные фильтры (асбестовые, целлюлозные) не является в строгом смысле стерилизующим, т.к. через их поры могут проходить вирусы и фильтрующиеся формы бактерий.
11. Химические методы стерилизации. Стерилизация растворами химических средств, является вспомогательным для изделий, которые нельзя стерилизовать др. методами. Пример: 6% р-р Н2О2 в течение 6 часов для полимерных материалов; 4,8% р-р первомура ( для лигатурного шовного материала) в течение 15 мин. Изделия полностью погружаются в р-р, затем все манипуляции проводятся с соблюдением асептики. Если изделия используются не сразу, хранят их в условиях стерильности ( не более 3 суток).
Газовая стерилизация. Применяется для обработки оптики, сложной техники (кардиостимуляторов, аппаратов искусственного кровообращения), изделий из полимеров, металла, стекла. Используют окись этилена или смесь ОБ (окись этилена с бромистым калием), озон, пары р-ра формальдегида в этиловом спирте, которыми наполняют стационарные газовые стерилизаторы или портативные анаэростаты. Ведут контроль стерилизации (с помощью биотестов).
Дезинфекция – это комплекс мероприятий, направленных на уничтожение в объектах окружающей среды патогенных микробов. Используют физические и химические методы дезинфекции.
Физические методы: 1) механические ( вытряхивание, проветривание, влажная уборка, стирка); 2) действие высокой t ( глажение, кипячение, пастеризация); 3) УФО (облучение бактерицидными лампами).
Химические методы. Дезинфицирующие вещества:
Хлорсодержащие препараты (хлорная известь, хлорамин и др.)
Окислители ( Н2О2, КМпО4);
Фенолы (карболовая к-та, лизол);
Йод и йодофоры (йод + ПАВ);
Соли тяжелых металлов (сулема, диоцид);
ПАВ – поверх.акт. вещ-ва (сульфанол);
Четвертичные аммониевые соединения;
Спирты (70% этанол);
Формальдегид (формалин);
Красители (бриллиантовый зеленый, метиленовый синий);
Кислоты (борная, салициловая и др.);
Альдегиды (глютаровый).
Выбор метода дезинфекции определяется устойчивостью конкретных микроорганизмов, контаминировавших объект, а также свойствами самого объекта. Выделяют 5 групп возбудителей инфекций: вирусных, бактериальных, туберкулеза, кандидоза, дерматомикозов по устойчивости к действию дезинфицирующих средств. От этого зависит выбор вещ-ва, его концентрация и время экспозиции.
От дезинфекции следует отличать асептику и антисептику.
Асептика – это система профилактических мероприятий, направленных на предотвращение попадания микроорганизмов в рану, лекарственные препараты, питательные среды и др. объекты. Она включает стерилизацию материалов, обработку рук, использование стерильных халатов, масок, перчаток, исключение разговоров, влажную уборку с дезинфицирующими средствами и др.
Антисептика - это комплекс мероприятий, направленных на уничтожение микробов, попавших в рану, лекарственный препарат или др. объект. Различают антисептику:
механическую (удаление из раны инфицированных и некротированных тканей);
физическую (наложение повязок, использование сухого тепла, УФО, лазера и т.д.);
химическую (применяют химические в-ва, бактерицидные и бактериостатические);
биологическую (применяют антибиотики, бактериофаги, иммуноглобулины, средства, стимулирующие защитные силы организма).
4. Строение микроскопа.
Микроскоп состоит из механической (подсобной) и оптической (главной) частей.
Механическая часть – это штатив, предметный столик и тубус (труба).
Штатив в виде подковы имеет колонкутубусодержатель в форме дуги. Для регуляции положения тубуса есть макровинт для предварительной ориентировочной установки изображения объекта и микровинт для четкой установки на фокус.
Предметный столик - служит для размещения на нем препарата; столик вращается во взаимно перпендикулярных плоскостях с помощью винтов. Для закрепления препарата имеются клеммы – зажимы; в центре столика круглое отверстие для освещения препарата снизу.
Тубус (труба) – оправа, в которой заключены элементы оптической системы микроскопа. В нижней части тубуса объективодержатель – револьвер с гнездами для объективов, в верхней части – окуляры.
Оптическая часть микроскопа состоит из объектива и окуляра и вспомогательной осветительной системы – зеркала и конденсора.
Зеркало и конденсор располагаются под предметным столиком. Зеркало отражает падающий на него свет в конденсор.
Конденсор, состоящий из 2 – 3 короткофокусных линз, собирает лучи, идущие от зеркала, и направляет их на объект. Линзы конденсора вмонтированы в металлическую оправу и перемещаются вверх и вниз специальным винтом. Интенсивность освещения регулируется ирисовой (лепестковой) диафрагмой, состоящей из стальных пластинок. Конденсор необходим при работе, прежде всего с иммерсионной системой.
Объектив – наиболее важная часть микроскопа, от него зависит изображение объекта. В гнездах револьвера располагаются объективы с обозначениями на их оправе величины увеличения объекта (8х, 40х, 90х). Исследование препарата начинают с малого увеличения ( 8х ), затем меняют объектив на 40х или 90х.
Объективы рассчитаны на работу с покровным стеклом толщиной 0,17 ± 0,1мм.
Окуляр служит непосредственным продолжением «линз» (хрусталиков) глаз человека.
Окуляр состоит из двух линз – верхней и нижней, заключенных в металлическую оправу. Нижняя линза собирает лучи, идущие от объектива, и они проходят через маленькое отверстие глазной линзы.
Назначение окуляра – прямое мнимое увеличение изображения, которое дает объектив.
Увеличение окуляра выгравировано на его оправе. Рабочее увеличение в пределах от 4х до 15х. окуляры бывают разных типов. Бинокулярные насадки более удобны в работе.
Кратность увеличения объекта определяется умножением показателя объектива на увеличение окуляра.
Бактериоскопия.
Для микробиологической диагностики инфекций используют различные методы:
Бактериоскопические – изучают возбудителя по морфологическим признакам в нативных или окрашенных препаратах;
Бактериологические - предполагают культивирование возбудителя, изучение его культуральных и физиологических свойств, выделение чистой культуры, идентификацию и типирование возбудителя;
Биологические – изучают особенности взаимодействия микроба с экспериментальными животными;
Серологические – основаны на изучении антигенных свойств возбудителя и реакций макроорганизма на эти антигены (серологическая и аллергологическая диагностика; антигенная идентификация микроорганизмов или их компанентов);
Молекулярно – генетические - обнаружение фрагментов генома возбудителя при помощи молекулярной гибридизации ДНК или РНК и ПЦР.
Метод бактериоскопического исследования приобретает особое значение, если микроб имеет морфологические и тинкториальные особенности или особую локализацию в тканях, клетках организма. Иногда бывает достаточно морфологического исследования для диагностики. Но для большинства инфекций микроскопия имеет лишь ориентировочное значение.
Применяются не только обычные методы оптической микроскопии в проходящем свете, но и специальные: в темном поле зрения, фазово – контрастный, люминесцентный и электронный.
Световая микроскопия. Световой микроскоп имеет сухой и иммерсионный объективы. Сухой объектив применяется для изучения относительно крупных биологических объектов. При изучении микроорганизмов используют иммерсионный («погружной») объектив (увеличение 60х – 100х). В качестве иммерсии используют масло кедровое, персиковое, «иммерсиол» и др., в которое погружают объектив. Разрешающая способность иммерсионного объектива около 0,2 мм. Макс.увеличение 2000х – 3000х.
Микроскопия в темном поле зрения. Используется для обнаружения в неокрашенных (нативных) препаратах возбудителей сифилиса, лептоспироза, возвратного тифа и др. болезней, а также для изучения подвижности микроорганизмов. Используют сухой объектив (40х).
Фазово – контрастная микроскопия. Помогает выявить детали структуры живых микроорганизмов, влияние на них различных факторов ( в-в, антибиотиков и др.).
Люминесцентная микроскопия. Люминесценция или флюоресценция - способность некоторых объектов и красителей при попадании ультрафиолетовых или других коротковолнистых лучей света испускать лучи видимой части спектра (зеленые, желтые, оранжевые). Препараты готовят обычным способом, фиксируют 5 – 10 мин. в этаноле или ацетоне и наносят на 20-30 мин. флюорохром, промывают, накрывают покровным стеклом и микроскопируют.
Преимущества люминесцентной микроскопии: цветное изображение, контрастность, обнаружение бактерий, вирусов и их АГ и др.
Электронная микроскопия. Вместо света используется поток электронов - источник электронная пушка. Вместо линз – электромагниты. Эл.микроскопы дают возможность видеть частицы величиной 0,2 – 2,0 нм (вирусы), исследовать срезы тканей, клеток, микроорганизмов, полученных с помощью ультрамикротома.
Принципы классификации микроорганизмов.
Микробы, как и все другие организмы, систематизированы по их сходству, различиям и взаимоотношениями между собой. Раздел систематики, изучающий принципы классификации, называется таксономией (от греческого taxis – расположение, порядок). В основу таксономии микроорганизмов положены их морфологические, физиологические, биохимические и молекулярно-биологические свойства. Различают таксономические категории: царство, подцарство, отдел, класс, порядок, семейство, род, вид, подвид и др.
В категории выделяют таксоны – группы организмов, объединенные по определенным свойствам. Название микроорганизмов регламентируется Международным кодексом номенклатуры (зоологической, ботанической номенклатуры бактерий, вирусов). К Царству прокариот относят бактерии; к Царству vira - вирусы. Грибы и простейшие являются эукариотами. Основная таксономическая категория – вид (spesies). Вид - это совокупность особей, объединенных по близким свойствам, но отличающихся от других представителей рода. Совокупность однородных микроорганизмов, выделенных на питательной среде, характеризующихся сходными морфологическими, тинкториальными, культуральными, биохимическими и антигенными свойствами называется чистой культурой. Чистая культура микроорганизмов, выделенных из разных источников, объектов, и отличающихся от других представителей вида, называется штаммом: (например, кишечная палочка, выделенная из разных объектов). Штамм – более узкое понятие, чем вид или подвид. К штамму более близко понятие клона. Клон – это совокупность потомков, выращенных из одной клетки. Совокупности микроорганизмов могут отличаться по тем или иным свойствам, тогда употребляется суффикс var - (разновидность) – морфовары (отличаются морфологически), резистентовары – (отличаются по устойчивости к антибиотикам), серовары – (отличие по антигенам), фаговары – (отличие по чувствительности к бактериофагам), биовары – (отличие по биологическим свойствам), хемовары – (отличие по биохимическим свойствам), и т.д.
Для бактерий применяют таксономические категории: тип, класс, порядок, семейство, род, вид. Название вида соответствует бинарной номенклатуре, т.е., состоит из двух слов, например, возбудитель сифилиса Тreponema pallidum, первое слово – название рода, пишется с прописной буквы, второе слово обозначает вид - пишется со строчной буквы. При повторном написании вида родовое название сокращается до начальной буквы, например, Т – pallidum. Бактерии относятся к прокариотам, т.е., доядерным организмам, у них примитивное ядро без оболочки, ядрышка, гистонов, органелл (митохондрий, аппарата Гольджи, лизосом и др.). Согласно 2-му изданию (2001 г) Определителя Берджи, бактерии делятся на два домена («империи»): «Bacteria» (эубактерии) и «Archaea» (архебактерии).
Архебактерии – одна из древних форм жизни, не содержат пептидогликанов в клеточном стенке, имеют особые рибосомы и рибосомы РНК (р РНК), среди них нет возбудителей инфекционных болезней.
В домене «Bacteria» следующие бактерии:
1. грациликуты – бактерии с тонкой клеточной стенкой (гр-)
2. фирмикуты – бактерии с толстой клеточной стенкой (гр+)
3. тенерикуты – бактерии без клеточной стенки - микоплазмы – Mollicutes
Морфология микробов:
(бактерий, риккетсий, хламидий, микоплазм, актиномицетов, нокардий).
Основные формы бактерий – кокковидные, палочковидные, извитые и ветвящиеся. Кокковидные бактерии (кокки) – шаровидные клетки размером 0,5-1,0 мкм, которые в зависимости от расположения делятся на микрококки, диплококки, стрептококки, тетракокки, сарцины и стафилококки.
Микрококки – отдельно расположенные клетки.
Диплококки - парные кокки (пневмококк, гонококк, менингококк), после деления не расходятся.
Стрептококки – (от греческого streptos – цепочка) – клетки округлой или вытянутой формы, клетки после деления не расходятся, образуя цепочки.
Сарцины – (от лат. sarcina – связка, тюк) располагаются в виде пакетов из 8 кокков и более, образуя при делении клетки в трех взаимноперпендикулярных плоскостях.
Стафилококки – (от греческого staphyl – виноградная кисть) – кокки располагаются в виде грозди винограда в результате деления в разных плоскостях.
Палочковидные бактерии (палочки) – различаются по размерам, форме концов клетки и взаимному расположению клеток. Длина клеток 1,0-8,0 мкм, толщина 0,5-2,0 мкм.
Правильной формы (кишечная палочка) и неправильной формы (коринебактерии), ветвящиеся (актиномицеты). Очень мелкие палочки – риккетсии. Концы палочек – обрезанные (сибиреязвенная бацилла), закругленные (кишечная палочка), заостренные (фузобактерии), утолщенные похожие на булаву (коринебактерии дифтерии). Слегка изогнутые палочки называются вибрионами (холерный вибрион), имеют один изгиб. Большинство палочковидных бактерий располагаются беспорядочно, т.к. после деления расходятся. Клетки после деления могут не расходиться, тогда они располагаются под углом друг к другу (коринебактерии дифтерии) или образуют цепочку (сибиреязвенная бацилла). К этой группе могут относиться и вибрионы.
Извитые формы - спиралевидные бактерии, спириллы, штопоровидные извитые клетки. Представитель: возбудитель содоку (болезнь укуса крыс); кампилобактерии и хеликобактерии с изгибами как у крыла летящей чайки, (число завитков от 2-3).
К извитым бактериям относятся и спирохеты. Спирохеты – тонкие, длинные, извитые спиралевидной формы бактерии, подвижные. Число завитков (до 12 и более). Примеры: возбудитель сифилиса, в полости рта возбудитель кариеса, возбудитель лептоспироза.
Риккетсии – мелкие гр(-) палочковидные бактерии размером 0,35-2,0 мкм, облигатные внутриклеточные паразиты. У человека риккетсии вызывают сыпной тиф (Rickettcia prowazekii).
Хламидии – облигатные внутриклеточные кокковидные гр(-) бактерии. У человека хламидии вызывают трахому, орнитоз, пневмонию и др.
Микоплазмы – мелкие бактерии без клеточной стенки, окружены ЦПМ. Патогенные микоплазмы вызывают хронические инфекции (Mycoplasma pneumoniae).
Актиномицеты – ветвящиеся гр(+) бактерии (от греч. аctis – луч, mykes гриб) – лучистые грибы. Образуют в пораженных тканях друзы из переплетенных нитей в виде лучей от центра и заканчиваются колбовидными утолщениями. Актиномицеты подобно грибам образуют мицелий – переплетающиеся нити. На субстрате образуют воздушный мицелий. Актиномицеты могут делиться путем фрагментации мицелия на палочковидные или сферические клетки. На воздушных гифах образуют споры, которые размножаются.
Нокардии – относятся к актиномицетам (нокардиоподобные), но менее дифференцированы. Воздушный мицелий у них отсутствует или развит слабо, способны септироваться на палочковидные фрагменты, переходящие в дальнейшем в палочки, чаще в кокки.
Структура бактериальной клетки
Бактериальная клетка состоит из клеточной стенки, ЦПМ, цитоплазмы с включениями и нуклеоида.
Клеточная стенка придает форму бактериальной клетке, вместе с ЦПМ сдерживает высокое осмотическое давление в клетке, участвует в делении и транспорте метаболитов. Толщина стенки гр(-) бактерий 15-20нм, гр(+) – 50нм и более. В клеточной стенке гр(+)бактерий содержится небольшое количество полисахаридов, белков, липидов.
Основной компонент клеточной стенки гр(+) бактерий полимер пептидогликан (муреин), составляет 40-90% массы клеточной стенки, а также тейхоевые кислоты (от греч. teichos – стенка). Гр(-) бактерии содержат меньше пептидогликана (5-10% массы кл. стенки). При окраске бактерий по Граму гр(+) бактерий окрашиваются в сине-фиолетовый цвет ; это связано со способностью многослойного пептидогликана взаимодействовать с красителем генциановым фиолетовым и удерживать краску. Гр (-) бактерии неспособны удерживать краситель генциановый фиолетовый из-за меньшего количества пептидогликана, поэтому они окрашивается в цвет дополнительной краски - фуксина - красный. В состав клеточной стенки (гр-) бактерий входит наружная мембрана, основным компонентом этих мембран служит бимолекулярный (двойной)слой липидов. С внешней стороны наружной мембраны расположен липополисахарид ЛПС, с которым связаны представления об О-антигене, по которому дифференцируют бактерий (при изменении биосинтеза компонентов ЛПС появляются R-формы колоний). R-колонии шероховатые и неровные, в отличие от «гладких» S-форм колоний. При нарушении синтеза клеточной стенки бактерий под влиянием лизоцима, пенициллина, защитных факторов организма и др. соединений образуются клетки с измененной, часто шаровидной формой: протопласты – полностью лишенные клеточной стенки; сферопласты – с частично сохранившейся клеточной стенкой. После устранения ингибитора измененные клетки могут реверсировать, т.е. восстанавливают полноценную клеточную стенку и исходную форму. Сферопласты и протопласты, утратившие способность к синтезу пептидогликана под влиянием ингибиторов (антибиотики и др. факторы) и способные размножаться, называются L-формами (от названии института имени Листера). L-формы могут возникнуть и в результате мутаций. L-формы образуют многие патогенные микробы. Цитоплазматическая мембрана, окружающая наружную часть цитоплазмы бактерий, представляет собой четырехслойную мембрану, состоит из двойного слоя фосфолипидов, пронизанного белками. Часть белков - пермеазы –участвующие в транспорте веществ ЦПМ – мобильная структура, регулирует осмотическое давление, участвует в транспорте веществ и энергетическом метаболизме клетки (за счет ферментов).
При избыточном росте (по сравнению с ростом клеточной стенки), ЦПМ образует инвагинаты (впячивания) – мезосомы. Менее закрученные структуры ЦПМ называются внутрицитоплазматическими мембранами. Эти структуры являются энергетическими центрами клетки.
Цитоплазма занимает основной объем клетки и состоит из белков, рибонуклеиновых кислот, включений и рибосом, ответственных за синтез (трансляцию) белков, размер их 20нм и коэффициент седиментации 70 S в отличие от 80 S – рибосом эукариотов. Поэтому некоторые антибиотики, связываясь с рибосомами бактерий, подавляют синтез бактериального белка, не влияя на синтез белка эукариотов. Рибосомы бактерий диссоциируют на 50 S и 30 S. В цитоплазме имеются различные включения – гликоген, полисахариды, полифосфаты (волютин) – запасные вещества. У дифтерийной палочки характерное расположение зерен валютина по полюсам клетки.
Нуклеоид –эквивалентен ядра у бактерий, расположен в центре клетки в виде двунитевой цепочки ДНК, замкнутой в кольцо – не имеет ядерной оболочки, ядрышка и гистонов (белки). В бактериальной клетке обычно одна хромосома, представленная замкнутой в кольцо молекулой ДНК. Кроме нуклеоида, представленного одной хромосомой, имеются внехромосомные факторы наследственности – плазмиды, представляющие замкнутые кольца ДНК.
Капсула слизистая структура, связанная с клеточной стенкой, обнаруживается чаще из патологического материала, в чистых культурах - реже. Состоит из полисахаридов, иногда из полипептидов (Bac. аnthracis); она гидрофильна и препятствует фагоцитозу бактерий. Многие бактерии образуют микрокапсулу. От капсулы следует отличать слизь из мукоидов.
Жгутики – органы передвижения, представляют собой тонкие длинные нити, длиннее самой бактериальной клетки. Длина их 3-12 мкм, толщина - 12-20 нм. Бактерия с одним жгутиком –монотрих, с пучком жгутиков на одном конце – лофотрих, если на обоих концах – амфитрих, по всему периметру – перитрих. Жгутики состоят из белка – флагеллина, обладают антигенной специфичностью.
Ворсинки, или пили ( фимбрии) - более короткие и тонкие, состоят из белка пилина, обладают антигенной активностью, адгезивными свойствами, т.е.способностью закрепляться на пораженной клетке; половые (F- пили) или коньюгационные пили.
Споры – образуются в покоящихся клетках, в неблагоприятных условиях, способствуют сохранению вида. Аэробные бактерий, образующие споры, у которых размер споры не превышает диаметр клетки, называют – бациллами. Спорообразующие анаэробные клетки, у которых размер споры превышает диаметр клетки, называются – клостридиями (от лат. clostridium – веретено). Спорообразование, форма и расположение спор в клетке (вегетативной) являются видовым признаком бактерий. По форме – овальные, шаровидные, по расположению в клетке – терминальное, т.е. на конце палочки (возбудитель столбняка), субтерминальное – ближе к концу палочки (возбудитель ботулизма, газовой гангрены) и центральное (сибиреязвенная бацилла). Стадии прорастания споры: активация, инициация, вырастание. Из 1-ой споры образуется 1-бактерия. Активация – готовность к прорастанию при t 60-800С. Инициация прорастания – несколько минут, стадия вырастания – быстрый рост, оболочка разрушается и выходит проросток.
9.Методы окраски микроорганизмов.
Препараты микроорганизмов окрашивают красителями. Окраска бактерий – сложный физико – химический процесс. Отношение микроорганизмов к красителям называют тинкториальным свойством.
Простые методы окраски позволяют определить наличие бактерий в препарате, их форму, размеры, взаиморасположение.
Наиболее широко применяются следующие красители: красные (фуксин основной, фуксин кислый, конго красный, сафранин нейтральный красный); синие (метиленовый синий); фиолетовые (генциановый); желтокоричневые (везувин, хризоидин).
Простые методы окраски. Фиксированный мазок окрашивают каким – либо одним красителем, например, фуксином водным (1-2 мин) или метиленовым синим (3-5 мин), промывают водой, высушивают и микроскопируют.
Сложные методы окраски. Используют несколько красителей. К ним относят окраску по Граму, Цилю – Нильсену, Нейссеру, Романовскому – Гимзе и др. Дифференцирующий метод, используемый для классификации бактерий - метод окраски по Граму. Все бактерии подразделяются на гр (+) и гр (-), это облегчает диагностику и выбор средств антимикробной терапии. Все болезнетворные кокки, кроме гонококка и менингококка, являются гр (+); вибрионы, трепонемы, кампилобактеры и энтеробактерии – гр (-), все патогенные бациллы и клостридии – гр (+).
Другие методы сложной окраски.
Окраска по Романовскому – Гимзе. Препараты из исследуемого материала (кровь, гной, тканевая жидкость и др.), культуры клеток окрашиваются красителем Р. – Г., состоящим из метиленового синего, эозина и азура. цитоплазма простейших окрашивается в голубой цвет, ядра – в красный; элементы крови: эритроциты в розовый, ядра лейкоцитов – в фиолетовый, цитоплазма – в голубой, базофильная зернистость – в синий, эозинофильная – в красный, нейтрофильная – в сиреневый.
Окраска по Цилю – Нильсену. Для кислотоустойчивых микробактерий (возбудит. туберкулеза, лекры, микобактериозов), актиномицетов и др. Используют две краски – фуксин и метиленовый синий. Кислотно-устойчивые окрашиваются в красный цвет, неустойчивые – в сине-голубой цвет.
Окраска спор по методу Ожешко (в основе метод Циля - Нильсена). Препараты протравливают кислотой, затем окрашивают. Споры окрашиваются в красный цвет, вегетативные клетки – в синий.
Окраска по методу Нейссера. Зерна волютина окрашиваются в темно – синий цвет, цитоплазма – в желтый цвет.
Окраска по методу Бури – Гинса. Используются две краски – черная тушь и фуксин. Капсула не окрашивается, образуется ореол вокруг красной клетки. По методу Бури используют тушь. На темном фоне неокрашенные капсулы.
Окраска по Морозову методом серебрения. Метод применяется для выявления путем импрегнации серебром спирохет, вирусов и микроструктур бактерий (жгутиков, включений).
10.Приготовление препарата для микроскопии
Для световой микроскопии микроорганизмов готовят препараты – мазки из культуры бактерий, выращенных на плотной и жидкой питательной среде, из исследуемого материала – гноя, мокроты, крови, препараты – отпечатки из внутренних органов, мяса. Соответствующим образом для каждого случая приготовленные препараты высушивают, фиксируют, окрашивают и микроскопируют с иммерсионной системой.
Изучение микроорганизмов в живом состоянии используют для определения их подвижности, т.е.наличия у них жгутиков. Препараты готовят методами раздавленной или висячей капли и микроскопируют с сухим или иммерсионным объективом. Более четкие результаты получают при микроскопировании в темном поле им фазово-контрастной микроскопии.
Лекция 2
|
Скачать 0.84 Mb.