Практикум по клин. диагностики. Учебные пособия для студентов высших учебных заведений
 Скачать 5.61 Mb.
|
|
З ан яти е ОПРЕДЕЛЕНИЕ В КРОВИ ЦВЕТОВОГО ПОКАЗАТЕЛЯ И СРЕДНЕГО СОДЕРЖАНИЯ ГЕМОГЛОБИНА ВОДНОМ ЭРИТРОЦИТЕ Цель занятия. Овладеть методикой количества в крови, научиться вычислять цветовой показатель приобрести навыки диагностической оценки данных анализов. Материальное обеспечение мерные на 1 л, градуированные пипетки на 5 мл, капиллярные пипетки на (0,02 пробирки (с 0,1 н. раствор соля- кислоты, трансформирующий раствор (0,5 мл 200 мг 1 г гидрокарбоната дол дистиллированной воды, стандартный гемиглобинцианида венгерской фирмы (концентрация 59,75 мл, что соответствует 15 г гемоглобина на 100 мл крови, или 150 г/л). Определение содержания гемоглобина в крови Применяют и методы метод В градуированную пробирку гемометра (рис. 60) вносят глазной Рис. 60 Схема гемометра ГС — корпус стойка 2 — крышка 3 — два винта — две запаянные пробирки со стандартной жидкостью градуированная пробирка 6 — матовое ' стекло и пипеткой до метки «2» 0,1 н. раствор соляной кислоты. Капиллярной пипеткой набирают 20 мкл (0,02 мл) крови, кончик пипетки вытирают ватой и кровь осторожно выдувают на дно пробирки в раствор кислоты, промывая им раза пипетку для удаления остатков крови. Перемешивают и оставляют стоять на 5 мин (при исследовании крови на 15 мин). Вследствие образования солянокислого гематина (хлоргемина) раствор в пробирке приобретает коричневую окраску. Добавляют по дистиллированную воду, помешивая стеклянной палочкой до тех пор, пока окраска жидкости в пробирке не сравняется с цветом стандартных пробирок. Количество гемоглобина в граммах на 100 мл крови устанавливают по делению шкалы, которое совпадает с уровнем жидкости в пробирке. Если найденное по шкале гемометра количество гемоглобина умножить на коэффициент, то можно определить концентрацию гемоглобина метод метод МЛ. Пимен о вой и Г. В Для исследования используют опытную, холостую и стандартную пробы пробу ставят следующим образом. К 5 мл трансформирующего раствора добавляют 20 мкл (0,02 мл) крови (разведение враз, тщательно размешивают, оставляют на мини затем колориметрируют при зеленом светофильтре (длина волны нм) в кювете с толщиной слоя 10 мм против холостой пробы. В качестве последней берут трансформирующий раствор. Стандартная это стандартный раствор гемиглобинцианида, который исследуют без разведения трансформирующим раствором также, как и опытную пробу. Содержание гемоглобина г мл по формуле где — оптическая плотность опытной пробы — оптическая плотность пробыв стандартном рас (59,75 мл К — коэффициент крови (251); 0,001 коэффициент для (для в полученное по формуле количество гемоглобина умножают на У здоровых животных содержание гемоглобина крови составляет (г у крупного рогатого скота овец — лошадей — свиней собаку кур Содержание гемоглобина находится в пределах у крупного рогатого скота — овец — коз лошадей — свиней — собаку кур Увеличение количества гемоглобина в крови наблюдают при поносах, рвоте, потливости, образовании экссудатов и транссудатов, миоглобинурии, эмфиземе легких. Уменьшение содержания гемоглобина в крови встречают при анемиях различной этиологии. Определение цветового показателя. При заболеваниях может изменяться насыщенность эритроцитов гемоглобином, что учитывают определением цветового показателя который вычисляют по формуле где — среднее количество гемоглобина в норме (г мл, или г/л); количество гемоглобина у исследуемого животного (г мл, или гл количество в норме (млн/мкл, или EZ — ство эритроцитов у животного или Цветовой показатель крови у здоровых животных у крупного рогатого овец — коз — лошадей свиней собаку Отклонение цветового показателя наиболее от нормы свидетельствует о состава крови, что учитывают при дифференциальной диагностике анемий. Повышение цветового показателя регистрируют при гемолитических анемиях. Понижение цветового показателя отмечают при ане- миях. З ан яти е ПОДСЧЕТ КЛЕТОК КРОВИ Цель занятия. Овладеть методикой подсчета количества эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов. Материальное обеспечение счетные камеры Горяева, шлифованные покровные стекла для и торные пробирки с пипетки, градуированные на 1 и 5 мл Сали; натрия, жидкость Тюрка, раствор трилона Б (50 г 50 мл раствора формальдегида мл раствор (90 г хлорида натрия, химически 5 г трилона Б, 15 мл раствора ного формальдегида, 10 л дистиллированной воды раствор сапонина. Подсчет количества эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов. Для подсчета количества указанных клеток крови используют счетные камеры и электронно-счетные приборы. Число эритроцитов можно определить также с помощью и фотоэлектроколориметров. П од счет лейкоцитов и ц и тов в счетной При подсчете числа клеток крови применяют различные счетные камеры (Горяева, Пред- теченского, Бюркера, бауера, Тюрка и др. Наибольшее распространение получила счетная камера Горяева. Счетная это толстое предметное стекло с четырьмя поперечными между которыми образуются три поперечные полосы. Средняя полоса на 0,1 мм тоньше боковых и разделена продольным желобком на две равные половины, на каждой из которых выгравирована сетка Горяева (рис. Если на боковые полоски наложить и притереть шлифованное покровное стекло появления радужных то над средней полоской образуется пространство той 1/10 мм. Сетка Горяева 9 (3X3 мм больших квадратов из которых разделены имеет площадь на ней нанесены (15X15), на 16 маленьких квадратиков Площадь маленького квадратика составляет мм, а объем камеры над мм). При эритроцитов кровь разводят разбавителем или в меланжере, или смесителе (рис. 62) для эритроцитов чаще практикуется пробирочный метод по Н. Николаеву (1954). Если кровь Рис 61 Счетная камера Горяева сверху, 2 — вид сбоку, 3 — сетка Горяева, — малый и 5 — большой квадраты разводят в меланжере, тов капилляр его набирают кровь метки «0,5», кончик капилляра протирают ваткой и затем в смеситель до метки «101» разбавляющую жидкость или раствор хлористого натрия раствор цитрата натрия раствор йода йод кри- 0,3 г, калия 0,4 г, натрия цит- 2 г, дистиллированная мл. Смеситель с обоих концов закрывают большими средним пальцами руки и встряхивают мин. В данном случае получается разведение крови Из меланжера вначале удаляют на ватку первые три капли разведенной крови, а последующую каплю наносят на среднюю полоску счетной камеры вблизи от края притертого покровного стекла. Капля разведенной крови попадает под стекло в пространство и заполняет камеру. Если кровь разводят в пробирке, тов пробирку Флоринского берут 4 мл или раствора хлористого натрия, вносят 0,02 мл крови пипеткой от гемометра Сали (разведение крови 1 и смешивают. Пастеровской пипеткой набирают разбавленную кровь и заряжают счетную камеру. Выждав мин, подсчитывают эритроциты под микроскопом при объекте и окуляре в левом верхнем большом квадрате (разделенном на 16 маленьких а затем еще в четырех больших квадратах по диагонали сетки (всего в пяти квадратах). Подсчет клеток в большом квадрате начинают с левого верхнего маленького квадратика, ада- лее переходят во второй, третий и V четвертый квадратики (рис. После верхнего ряда считают эритроциты в нижерасположенном ряду, Рис. 62 Смесители Рис. 63. Подсчет эритроцитов в боль - для эритроцитов 2 - для лейкоцитов шом квадрате счетной камеры Горяе- ва начиная с первого правого квадратика, и т. д. Эритроциты внутри маленьких квадратиков, а также на верхней и левой сторонах большого квадрата считают, а эритроциты на нижней и правой сторонах не учитывают. Количество эритроцитов (X, в 1 мл крови) определяют по формуле ВГ где А — число эритроцитов, подсчитанное в пяти больших квадратах (например Б — разведения крови (200); маленьких квадратиков в пяти больших квадратах Г — счетной камеры маленьким квадратиком (Число эритроцитов в 1 л крови вычисляют по формуле При подсчете лейкоцитов в меланжер для лейкоцитов наса- сывают кровь до метки «0,5», а затем до метки «11» набирают жидкость Тюрка (3 раствор уксусной мл %-ный раствор генциана фиолетового или метиленового сине 1 мл. Встряхивают 2 мин. Уксусная кислота разрушает эритроциты, а генциан фиолетовый (или синий) окрашивает лейкоциты. Получают разведение крови 1 Первые три капли выпускают на ватку (или фильтровальную бу- а следующей каплей заполняют счетную камеру. Для разведения крови в пробирке берут 0,4 мл жидкости Тюрка и 0,02 мл крови пипеткой от гемометра Сали (разведение крови 1 Пастеровской берут смесь и заряжают счетную камеру. Через мин после оседания лейкоцитов на дно камеры начинают подсчет клеток, который проводят под микроскопом при объективе Хи окуляре в 100 больших квадратах, не имеющих дополнительных линий и расположенных по сетке Горяева группами по четыре квадрата. Количество лейкоцитов (X, в 1 мкл крови) определяют по формуле ВГ 1600 где Л — число лейкоцитов в 100 больших квадратах (например Б — степень разведения крови (20); В — количество маленьких квадратиков в 100 больших квадратах Г — объем счетной камеры маленьким квадратикам (1/4000 мкл). Для числа лейкоцитов в 1 л крови используют формулу Для подсчета тромбоцитов (по Хауке) в шприц емкостью мл берут 0,5 мл 1 раствора трилона Б и 0,5 мл венозной крови, смешивают (разведение и сразу переносят в силиконированную пробирку, которую закрывают пробкой Кровь в пробирке до подсчета может несколько часов. Перед подсчетом кровь в пробирке смешивают, набирают в меланжер для лейкоцитов до метки «1», а затем до метки «11» насасывают 1 раствор оксалата аммония (разведение крови Смешивают и меланжер оставляют на 20 мин (идет гемолиз Меланжер встряхивают мин, выпускают на ватку три капли смеси, а следующей заряжают счетную камеру, которую ставят на 10 мин во влажную камеру (чашка Петри с влажной ваткой) для оседания тромбоцитов а дно камеры. Тромбоциты подсчитывают в пяти больших квадратах, разделенных на 16 маленьких квадратиков, при объективе Х40, окуляре Хи синем светофильтре. Число тромбоцитов (X, в 1 мкл крови) считают по формуле ВГ 80 А — тромбоцитов в пяти больших квадратах (крови В — маленьких в пяти больших квадратах Г — счетной камеры над маленьким квадратиком (1/4000 мкл). Число тромбоцитов в 1 л крови определяют по формуле П од счет эритроцитов иле й ко ц и тов см о щ ь юс чет чик о в В нашей стране используют приборы шведской фирмы типа модели 101, 202, 302, французской фирмы Франсе С. А типа модели и немецкий ЦГ2; венгерской фирмы типа отечественного производства типа а также ЦМК-2 (рис. Изменения количества клеток крови Число эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов в крови у разных видов животных приведено в таблице Повышенное содержание эритроцитов встречается сравнительно редко, что связано с потерей организмом воды при обильном потении, поно- сах, образовании транссудатов и экссудатов плевриты, перитониты, водянка грудной и брюшной полостей кишечника (механические а также хронической альвеолярной эмфиземе легких, при декомпенсации сердца. Уменьшенное содержание эритроцитов в крови регистрируют при анемиях, обусловленных недостаточным или неполноценным кормлением (особенно Рис. 64. Схема устройства кондуктометрического датчика — пробирка 2 — микроотверстие; 3 — стакан с пробой 4 — источники электроды управляющий кран 8 ник разрежения 9 расширение для ртути 10, 11, 12 — контакты 13 — ный сосуд Рис. 65. Кондуктометрический счетчик частиц «Целлоскоп> (модель 302) Заказ № 1227 6. Количество эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов в крови у взрослых здоровых животных Животные Эритроциты, млн мкл или л Крупный рогатый скот Овцы Козы Лошади Свиньи Собаки Куры Лейкоциты, тыс мкл, или Тромбоциты ТЫС МКЛ, ИЛИ л при недостатке белков, железа, витамина инфекционных болезнях (инфекционная анемия лошадей и интоксикациях (вследствие длительных и септических процессов, отравлениях гемолитическими ядами, инвазионных болезнях, пироплазмидозах, лейкозах, злокачественных новообразованиях, обильных кровопотерях. Повышение числа лейкоцитов в крови (лейкоцитоз может быть при беременности (незадолго до родов и сразу после них, у новорожденных (впервые дни после рождения, после приема корма (пищеварительный лейкоцитоз выявляют у животных с однокамерным желудком, ау животных с многокамерным желудком, где процесс пищеварения носит непрерывный характер, его практически нет, после тяжелой физической нагрузки лейкоцитоз медикаментоз- после парентерального введения животным белковых препаратов, вакцин, сывороток, алкалоидов, жаропонижающих, адреналина, эфирных масел при лихорадоч- но-воспалительных процессах, инфекциях, лейкозах. Снижение числа лейкоцитов (лейкопению наблюдают при некоторых вирусных болезнях (чума свиней, инфекционный энцефаломиелит лошадей, повальное воспаление легких, саль- телят, стахиботриотоксикозе, истощении защитных сил организма, лучевой болезни. Увеличение количества кровяных пластинок в крови (тром- встречается при мыте, воспалении легких, плеврите, саркоме, миоглобинурии. Уменьшение количества тромбоцитов в крови пения, происходит при большинстве остро протекающих инфекционных болезней, геморрагических диатезах (кровопятнистая болезнь, стахиботриотоксикозе, лейкозах (в клиническую стадию болезни, лучевой болезни, воспалении пироплазмозе и т. д Занятие ФИКСАЦИЯ И ОКРАСКА МАЗКОВ КРОВИ Цель занятия. Овладеть предметных стекол при- навыки по приготовлению, фиксации и окраске мазков крови. Материальное обеспечение. Предметные стекла, шлифованные предмет- стекла, приборы для массовой окраски выпарительные чашки, стеклянные рамки, глазные пипетки смесь этанола с этиловым эфиром, гематоксилин раствор гидрокарбоната натрия; раствор уксусной кислоты, фабричный краски дистиллированная Приготовление мазков. Мазки лучше готовить из свежей крови. Из цитратной и оксалатной крови мазки можно приготовить спустя 6 ч после взятия ее, а из 24 ч. Мазки крови готовят на предметных стеклах предметных еще не бывшие в употреблении, промывают в водопроводной, затем в дистиллированной воде, высушивают и закладывают в банку с притертой крышкой в смесь равных количеств этилового эфира и этилового спирта (смесь Никифорова). Перед работой стекла извлекают пинцетом При необходимости подготовленные таким образом стекла складывают в пакеты, заворачивают в бумагу и закладывают на хранение в полиэтиленовые мешочки, которые хорошо завязывают. Бывшие в употреблении предметные стекла (смазками крови) для удаления кедрового масла протирают или керосином и моют щеткой в теплой мыльной воде. Затем стекла выдерживают 24 ч в хромовой (кл серной кислоты добавляют при помешивании 500 г бихромата калия, растертого до состояния мелкого порошка) или 12 ч в растворе натрия (едкой щелочи или стирального порошка) с последующим кипячением в том же растворе в течение мин. После этого стекла промывают 12 раз водопроводной водой и 4 раза дистиллированной водой, просушивают и закладывают в смесь равных количеств спирта и эфира. Через ч стекла протирают полотенцем и хранят в полиэтиленовом Т е х ник а приготовления Предметное стекло помещают между большими указательным пальцами левой руки. Отступя на 1 см от края стекла, лежащего к указательному пальцу, наносят небольшую (диаметром мм) каплю крови. Поверхностью предметного стекла касаются капли крови на месте ее появления после прокола кожи. При изготовлении мазков из взятой в пробирки, каплю ее наносят с помощью глазной или пастеровской пипетки или пробки. Затем правой рукой устанавливают вблизи от 195 Рис 66 Приготовление мазка крови капли крови шлифованное стекло под углом и осторожно продвигают его до соприкосновения края стекла с каплей крови (рис 66) После этого, плавно и не очень быстро, продвигая справа налево шлифованное стекло по предметному, делают мазок Мазок должен начинаться на см от края предметного стекла и заканчиваться в см от другого его края, составляя примерно длины стекла Мазок должен быть уже предметного стекла, с боков на стекле должны оставаться свободные поля шириной около 1 см Мазок не должен иметь перерывов, пустот, на всем протяжении должен быть одинаковым толщине (рис Хорошие мазки получаются при подогревании предметных стекол на резиновой грелке с теплой водой на элек- трообогревательном столике к микроскопу, на стерилизаторе с горячей водой, закрытом крышкой, на этих же приспособлениях можно высушить изготовленные мазки В холодное время необходимо предупреждать паров воды на мазках крови, что может вызвать ее гемолиз На высушенном мазке в начальной его части простым карандашом или иглой от шприца пишут номер животного порядковый номер записи исследуемых и дату взятия крови Приготовить мазки можно обычными писчими С. Кондратьев). Для этого на предметном стекле пером» Рис 67 Мазки крови — приготовленный на плохо обезжиренном стекле 2 короткий неравномерный толстый правильно которое предварительно погружают в пробирку с кровью, без нажима проводят поперечные или продольные мазки-штрихи Фиксация мазков Мазки крови в течение 2 дн после изготовления необходимо зафиксировать или окрасить Нефиксиро ванные мазки через месяц теряют способность правильно окрашиваться Для фиксации мазки погружают в метиловый слирт этиловый спирт (30 этиловый спирт и этиловый эфир поровну мин) или денатурированный спирт (30 мин. Мазки помещают в кюветы с фиксатором и закрывают крышкой Они не должны соприкасаться друг с другом После фиксации мазки высушивают на воздухе Окраска мазков Качество окраски мазков зависит от многих факторов, в том числе и от рН воды, применяемой для разведения красок Дистиллированная вода для разведения красок и промывания мазков должна иметь нейтральную реакцию Для определения реакции воды с помощью гематоксилина в два химических стаканчика берут по 100 мл дистиллированной воды В один из них прибавляют несколько крупинок гематоксилина, а другой остается в качестве контроля Появление слабой розово-фиоле- товой окраски в течение мин указывает на нейтральную реакцию воды Если окрашивание произошло раньше 1 мин, то она щелочная, а если позже 5 кислая. Определение реакции воды с рН метра проводят по тем же правилам, что и жидкостей организма (желудочного сока, мочи и др Для нейтрализации воды с кислой реакцией по каплям до- Рис 68 Ванна для окраски мазка крови на предметном стекле бавляют 1 раствор гидрокарбоната натрия, пока розо- во-фиолетовая окраска не начнет появляться в течение 1 — 5 мин. Для нейтрализации щелочной воды добавляют 1 %-ный раствор уксусной кислоты. По методу фиксированные препараты кладут мазком вниз на стеклянный мостик в кювете и наливают под них рабочий раствор краски (к 1 мл дистиллированной воды добавляют две капли фабричного раствора краски Рома Окрашивание продолжается мин, что зависит от окружающей температуры (чем холоднее, тем продолжительнее окраска) и качества красителя. В заключение мазки промывают дистиллированной водой и сушат на воздухе. Для окраски мазков можно пользоваться специальным прибором (рис. Хорошо окрашенные мазки розово-фиолетового цвета, недо- розовато-красноватого, а тем- но-фиолетового. |