технология лек 2. Учебник соответствует учебной программе и предназначен для студентов фармацевтических высших учебных заведений и факультетов
 Скачать 5.32 Mb.
|
|
этилацетатно-спиртовая смесь противотоком извлекает фламин из водного концентрата и поступает в сборник. В процессе экстракции плавно устанавливают скорость подачи смеси и водного концентрата. После установления режимных скоростей подачи растворов для достижения заданной степени истощения водного концентрата продолжают сбор водного концентрата в промежуточный сборник, после чего слив уже истощенного водного концентрата переклю- чают в сборник-отстойник. По окончании процесса экстракции перекрывают подачу смеси и водного концентрата и отключают установку. С помощью вакуума освобождают центробежные экстракторы от остатков растворов в промежуточный сборник. Этилацетатно-спиртовые извлечения из сборника подают с помощью вакуума в разделительную воронку для отстаивания. Отстоявшиеся извлечения подают для упарки в циркуля- ционный вакуум-выпарной аппарат. 206 Глава 9. ПРОИЗВОДСТВО ПРЕПАРАТОВ ИЗ КУЛЬТУРЫ ТКАНЕЙ И КЛЕТОК РАСТЕНИЙ Культивирование клеток и тканей растений — сравнительно молодая отрасль биотехнологии. Как известно, в природных условиях клетки растений находятся в тканях и органах и защищены от механических воздействий внешней среды. Кроме того, эти клетки нуждаются во множестве компонентов минеральной и органической природы для метаболизма и роста, поэтому эксперименты культивирования этих клеток in vivo в прошлом завершались неудачно. Сначала к минеральным средам добавляли экстракты растений или сыворотку, и лишь в 1922 г. Роббинсу удалось на синтетической питательной среде осуществить рост меристемы кончиков корней томатов и кукурузы. Начало практического культивирования тканевых культур растительного происхождения можно отнести к 1955 г. В качестве примера приведен состав среды, мг/л, для культи- вирования клеток воробейника (табл. 9.1). Как видно из приведенных данных, для растительных клеток важное значение имеют соли азота, калия, магния, фосфора и ряд микроэлементов. Из органических веществ, помимо углеводов, важны отдельные аминокислоты, витамины и фитогормоны (индолилуксусная кислота, кинетин), ауксины, цитокинины, гиббереллиновая кислота и др.). В настоящее время растительные клетки культивируют, как правило, в виде каллуса. Каллусные клетки получают из фрагмен- тов тканей разных органов высших растений, помещая кусочки такой ткани в питательную среду (пробирки, колбы, чашки Петри). В природных условиях каллусная ткань образуется в травмированных местах для анатомической регенерации пострадавшего органа. От инфекции каллусную ткань в природных условиях защищают иммунные механизмы организма. В искусственных условиях необходимо соблюдать стерильность всеми доступными средствами. Обычно эксплантат обрабатывают дезинфицирующими растворами и промывают очищенной водой. Затем его помещают в раствор, содержащий ферменты (целлюлоза, гемецеллюлоза и пектиназа), разрушающие клеточные стенки, при этом образуются тысячи одиночных «голых» клеток, протопластов, не имеющих клеточных стенок. В питательном растворе протопласты образуют новые клеточные стенки, клетки начинают делиться. Для соблюдения стерильности среду, посуду и аппаратуру стерилизуют традиционными средствами (автоклавирование, ультрафильтрация, облучение). Чтобы обеспечить развитие 207 каллусных клеток в питательных средах, содержащих необхо- димые для роста вещества, клетки тканей, запасающей паренхимы, корня и стебля, мезофилла листа и других тканей должны терять способность дифференцировки. Не дифференцированному развитию клеток способствует прединкубация эксплантатов на среде без гормонов в течение 3—6 сут. Через 4—6 нед. культивирования трансплантата возникает первичный каллус, который необходимо перенести на свежую питательную среду. При культивировании агаризованной среды (твердофазный способ культивирования) кусочек каллуса должен иметь массу 60—100 мг на 30—40 мл свежей среды. Каллусная ткань, выросшая на поверхности твердой питательной среды, Таблица 9.1 Состав среды, мг/л, для культивирования клеток воробейника 208 имеет аморфную структуру, представляющую собой массу тонко- стенных паренхимных клеток. Для длительной пересадки каллусные ткани, имеющие первоначально белую, желтоватую, зеленую или красную пигментацию, могут терять окраску, а структура ткани становится более рыхлой. Химический состав каллусной ткани обычно отличается от состава соответствующего органа растения (табл. 9.2). Каллусные клетки после ряда делений переходят на обычный для данного растения цикл развития, т. е. начинается дифференциация. Этот процесс регулируют гормоны. Культивирование клеток растений на твердых средах осущест- вляют также в различных механизированных установках. Схема одной из современных установок конструкции ВНИИбиотехника для твердофазного культивирования изображена на рис. 9.1. Аппарат представляет собой вертикальный сосуд цилиндричес- кой формы с коническим днищем, снабженный рубашкой и змее- виками для охлаждения культуры. Внутри он разделен перфори- рованными пластинами. Субстрат перемешивается с помощью лопастных мешалок, установленных в каждой секции на вертикальном валу. Засеянную питательную среду загружают че- рез верхний люк, а готовую культуру выгружают через нижний. Культура пода- ется с верхних секций на нижние путем п е р и о д и ч е с к о г о п е р е в о р а ч и в а н и я п е р ф о р и р о в а н н ы х пластин на 90 °С вокруг горизонталь- ной оси. В каждую секцию под перфори- рованные пластины поступает стерильный воздух. Перемешивание субстрата в данном аппарате позволяет вести процесс культи- вирования клеток в толстом слое субстра- та (300—500 мм), при выращивании в кюве- тах — 20—30 мм. Это существенно по- вышает удельную производительность установки. Рис. 9.1. Схема аппарата конструкции ВНИИбиотехника для поверхностного выращивания продуктов биосинтеза: 1 — люк для выгрузки; 2 — валик секции; 3 — опора; 4 — коллектор стерильного воздуха; 5 — змеевик; 6 — лопасть мешалки; 7 — коллектор отработанного воздуха; 8 — крышка; 9 — бобышка манометра; 10 — штуцер; 11 — воздушник; 12 — шестерня привода вала; 13 — вал; 14 — люк для загрузки 209 Процесс получения культуры клеток твердофазным способом требует использования слишком большой площади, не гарантирует стерильности и дает низкий выход продукта. 9.1. Глубинное суспензионное культивирование Для глубинного культивирования необходимо получить линии клеток, образующих небольшие агрегаты (по 5—10 клеток). Более пригодны рыхлые каллусные ткани. Трансплантат желательно обрабатывать пектиназой. Рекомендуется использовать среды, содержащие 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту и не содержащие ионы Са. В таких средах агрегаты клеток не образуются. Перед пересевом первичную культуру фильтруют через два слоя марли или через сита (нейлоновые, металлические), чтобы отделить крупные агрегаты каллусной ткани и остатки трансплантата. На образование клеточных агрегатов также оказывает влияние интенсивность перемешивания среды, так как клетки чрезвычайно чувствительны и быстро лизируются. Большинство клеток погибает. Глубинное культивирование можно осуществлять в колбах на качалках при частоте вращения 100—120 об/мин. На 60—100 мл среды используют 2—3 г свежей каллусной ткани. Для культивирования растительных клеток используют также специальные металлические или стеклянные ферментаторы различной конструкции (с мешалками или барботажного типа). Режим ферментации периодический или непрерывный, главным образом хемостатный. Таблица 9.2 Химический состав, %, биомассы культуры ткани и корня женьшеня 210 Биосинтез проводят в аппарате объемом от 0,1 до 63 м 3 и более (рис. 9.2). При управлении процессом выращивания клеток важно иметь гомогенную систему. Аэрацию культуральной биомассы осуществляют стерильным воздухом через барботер. Воздух стерилизуют, как правило, путем фильтрации на двух—трех последовательно установлен- ных фильтрах. В ходе культи- вирования клеток растений регулируют температуру (25— 37 °С), рН и окислительно- восстановительный потенциал. Процесс культивирования ведут до тех пор, пока идет интенсивный синтез целевого продукта и в среде не будут исчерпаны питательные ве- щества. При определении кон- ца культивирования необхо- димо учитывать данные мик- роскопического контроля сос- тояния культуры, отсутствие посторонней микрофлоры, концентрацию основных пита- тельных веществ, биомассы, целевого продукта, рН. Необходимо отметить, что растительные клетки растут и размножаются значительно медленнее, чем клетки микро- организмов. Время их удвоения 1—3 сут. Процесс культи- вирования растительных клеток занимает 2—3 нед., что повышает требования к обеспечению асептических условий. В настоящее время методом культивирования клеток в промышленных условиях получают вещества вторичного метабо- лизма. Практический интерес представляют алкалоиды, гликозиды, полисахариды, терпеноиды, полифенолы, эфирные масла, пигменты и др. Некоторые вторичные метаболиты, получаемые при культивировании растительных клеток, перечислены в табл. 9.3. Как в любом биотехнологическом процессе, при получении метаболитов с помощью клеток растительного происхождения, важное значение имеет активность продуцента. Последние достижения клеточной инженерии показали, что в ряде случаев метаболиты, активно продуцирующие растительные клетки, можно получить методом слияния протопластов двух исходных Рис. 9.2. Схема ферментатора с комбинированным подводом энергии для глубинного культивирования: 1 — вал; 2, 3, 6 — мешалки; 4 — статор; 5 — барботер 211 растительных клеток. При этом гибридные клетки продуцируют не только метаболиты исходных растений, но и совершенно иные. Гибридизацию растительных протопластов успешно осуществ- ляют методом электростимуляции слияния клеток или прямым микроинъекцированием ДНК одной клетки в другую. Ямомото получил таком образом гибрид- ные клетки из Coptus japonica и Euphorbia millii, которые активно продуцировали алкалоид берберин — антибактериальное и противотифозное вещество. Концентрация берберина в культу- ральной жидкости достигает 1,39 г/л. 9.2. Промышленное производство БАВ из культуры клеток растений В основе промышленного производства БАВ из культуры клеток растений лежит ряд последовательных стадий и операций: получение высокопродуктивных продуцентов, разработка наиболее благоприятных условий культивирования продуцента БАВ с максимальным биосинтезом этого вещества, подбор и внедрение в практику соответствующих методов выделения и очистки БАВ, создание готовых препаратов и контроль качества. Работа на каждом из этих этапов должна проводиться квалифицированными специалистами (технологами, биотехнологами, генетиками). 9.2.1. Подготовка среды для культивирования продуцента и посевного материала (первая стадия) Подготовка среды. Для каждого продуцента БАВ, для каждого вновь образуемого каллуса и суспензионной культуры растений разрабатывается своя оптимальная среда, которая должна отвечать Таблица 9.3 Продукты вторичного метаболизма, получаемые при культивировании растительных клеток 212 следующим основным требованиям: а) обеспечивать хороший рост биомассы и максимально возможное образование БАВ (алкалоиды, гликозиды, полисахариды, терпеноиды и др.); б) содержать доступные по стоимости компоненты; в) обеспечивать применение наиболее экономичных и эффективных приемов выделения и очистки БАВ. Среда для культивирования. Компоненты среды для выращивания каллусных и суспензионных культур можно разделить на шесть групп, что обычно отражает порядок приготовления концентрированных исходных растворов: 1) основные неорганические питательные вещества (макроэлементы); 2) микроэлементы; 3) источники железа; 4) органические добавки (витамины); 5) источники углерода; 6) регуляторы роста растений. Составы некоторых питательных сред приведены в табл. 9.4. — 9.6. Среды Мурасиге-Скуга и Шенка-Хильдебрандта относятся к наиболее употребляемым в работе с культурами клеток растений и оказались эффективными для роста различных одно- и двудольных растений. Их считают средами с высоким содержанием солей (по сравнению с низкосолевой средой Уайта). Среда ШХ от других сред отличается очень высоким, десяти- кратным содержанием мезоинозита. Среды МС и ШХ содержат железо в хелатированной форме в комплексе с ЭДТА. Это обеспечивает его доступность при рН до 8,0 в течение всего периода роста культуры, тогда как при отсутствии характеризующего агента недостаток может возникнуть очень быстро. В реактор с мешалкой с помощью вакуума вносят поочередно приготовленные растворы, соблюдая следующий порядок: — раствор макросолей; — агаризованный раствор; — раствор хелата железа; — раствор микроэлементов; — раствор кальция нитрата; — раствор сахара. Смесь тщательно перемешивают в течение 15 мин, затем 1— 2 мин ведут вертикальное перемешивание путем барботажа при включенной мешалке. Обязательно отбирают контрольные пробы для определения рН среды (рН должно быть в пределах 5,6—6,2, температура раствора 152±2,5 °С). Стерилизация питательных сред в промышленных условиях осуществляется двумя основными методами: периодическим и непрерывным. 213 Таблица 9.4 Среда Мурасиге-Скуга Периодический метод стерилизации. Применяют при использовании небольших объемов среды. Он заключается в том, что среда, нагретая до определенной температуры (120—125 °С) непосредственно в ферментаторах или в специальных паровых стерилизаторах ГПСД-1700, выдерживается при этой температуре в течение 30—60 мин (в зависимости от объема среды или от ее состава), после чего охлаждается до 27—30 °С. 214 Непрерывный метод стерилизации целесообразно применять при использовании больших объемов среды. Приготовленная среда из специального сосуда с помощью насоса подается в стерили- зационную колонну, через которую пропускается острый пар (давление пара около 5 атм). Пар подается сверху по внутренней трубе, имеющей щелевидные прорези, благодаря чему пар поступает в среду и быстро ее нагревает. Среда в колонну подается снизу и движется по спирали вокруг внутренней трубы. Нагретая в колонне до необходимой для стерилизации температуры (около 125 °С), среда поступает в специальный аппа- рат — выдерживатель, где она выдерживается при температуре 120—125 °С. Время выдерживания зависит от состава среды и Таблица 9.5 Модифицированная среда Шенка-Хильдебрандта (рН 6,7) 215 Таблица 9.6 Состав других сред, широко используемых для культивирования клеток растений 216 составляет 5—10 мин. Из выдерживателя стерильная среда поступает в змеевиковый холодильник. Здесь она охлаждается до 30—35 °С (на выходе) и поступает в ферментатор. Непрерывный метод стерилизации имеет ряд преимуществ перед периодическим методом: возможность автоматического регулирования процесса, быстрый и равномерный нагрев среды, обеспечение более полной стерильности среды и другие факторы. Подготовка посевного материала — одна из ответственных операций в цикле биологического метода получения БАВ из культуры тканей. Культуру ткани (коллекцию культуры) завода получают из академий и университетов. Каждая культура имеет паспорт с подробным описанием морфологии, физиологии, характеристики среды для культивирования и хранения. Для твердофазного метода культуру ткани выращивают на агаризованной стерильной питательной среде в колбах вместимостью 0,25 л в термостатируемом помещении или термостате с температурой 27±1 °С. На 38—46 сут роста ткань материнской культуры режут таким образом, чтобы инокулюм состоял из вертикального столба (верхний слой, средний и часть нижнего слоя безагаризованной среды). Нельзя допускать воздействия на культуру дезсредств, бактерицидных ламп, так как это приводит к инактивации роста. Из одной материнской культуры пересаживают 7—9 дочерних культур и через 38—46 сут роста в термостатируемом помещении отбирают колбы с культурами тканей лучших ростовых признаков. Для таких культур характерны быстрый рост, максимальное использование питательной среды, цвет ткани от светло-желтого до молочного, отсутствие некротических включений. Для глубинного (суспензионного) метода культуру ткани предварительно выращивают на агаризованной стерильной среде в пробирке, затем из пробирок высевают в колбы с жидкой питательной средой и проводят две генерации глубинного выращивания на качалках в течение 38—46 сут для каждой гене- рации. Из второй генерации культуры (в колбе) делают посев в небольшой (10 л) инокулятор, а затем хорошо развивающуюся культуру переносят в основной ферментатор. Для посева в основ- ном ферментаторе используют от 5 до 10 объемных процентов посевного материала (инокулята). 9.2.2. Биосинтез БАВ (вторая стадия) Стадия биосинтеза — основная биологическая стадия процесса получения БАВ из культуры тканей. Задача этой стадии — обеспечение для продуцента БАВ таких условий развития, которые бы способствовали максимальному уровню биосинтеза БАВ. Эффективность стадии биосинтеза 217 зависит от уровня образования БАВ из культуры ткани и определяется генетическими особенностями организма, составом питательной среды, режимом развития продуцента. Она также зависит от времени максимального образования БАВ, стоимости компонентов среды, пеногасителей и энергетических затрат, связанных с процессом развития организма — продуцента БАВ. В настоящее время производство БАВ из культуры тканей осуществляют двумя способами ферментации: культивирование на поверхности твердой среды (твердофазная ферментация) и погруженное глубинное культивирование (суспензионное). Развитие организма-продуцента БАВ в ферментаторах. Процесс развития организма-продуцента БАВ в ферментаторах проходит при строгом контроле всех стадий, очень точном выполнении разработанного регламента условий накопления БАВ. Большое внимание уделяется поддержанию заданной температуры культивирования, активной кислотности среды рН, степени аэрации и скорости работы мешалки. Учитывая потребление организмом основных питательных компонентов субстрата (источников углевода, азота, калия, магния, фосфора, аминокислот, витами- нов), контролируется образование БАВ. |