технология лек 2. Учебник соответствует учебной программе и предназначен для студентов фармацевтических высших учебных заведений и факультетов
 Скачать 5.32 Mb.
|
|
Выделение гликозидов в индивидуальном состоянии основано, главным образом, на адсорбционно-хроматографических методах или противоточном распределении веществ в специально подоб- ранных системах растворителей — жидкостная экстракция. Технология препаратов сердечных гликозидов Адонизид (Adonisidum) получают из травы адониса весеннего (горицвета или черногорки) (Adonis vernalis L.). Технология препа- рата разработана Ф. Д. Зильбергом (ВНИХФИ). Измельченную траву адониса весеннего (активность не менее 50—66 ЛЕД в 1 г) экстрагируют циркуляционным способом в аппарате типа Сокслета. В качестве экстрагента используют смесь, состоящую из 95 частей хлороформа и 5 частей 96% этанола по объему. Указанный экстрагент получил название универсального, так как относительно хорошо извлекает все сердечные гликозиды. В то же время сопутствующие гидрофильные вещества переходят в эту смесь в незначительных количествах. Экстракцию растительного сырья проводят до полного извлечения гликозидов. В полученном извлечении наряду с гликозидами (адонитоксин, цимарин и др.) содержатся хлорофилл, органические кислоты, смолоподобные вещества и др. Отделение суммы гликозидов от основной массы гидрофобных сопутствующих веществ осуществля- ют путем смены растворителя. Для этого из полученного извлечения отгоняют экстрагент при температуре не выше 60 °С и разрежении не менее 59994,9 Н/м 2 . Когда кубовый остаток в испарителе по массе приблизительно будет равен взятому сырью, к нему добавляют равное количество воды и продолжают упаривание до полного удаления хлороформа и этанола. При этом 167 в осадок выпадают нерастворимые в воде вещества (хлорофилл, смолы и др.). Водный раствор, содержащий сумму гликозидов, небольшое количество пигментов и других сопутствующих веществ, сливают с осадка и фильтруют на нутч-фильтре через двойной слой фильтровальной бумаги и слой алюминия оксида толщиной 1—1,5 см. Эту операцию применяют для удаления оставшихся в растворе сопутствующих веществ, причем алюминия оксид практически не адсорбирует сердечные гликозиды и они переходят в фильтрат. В фильтрате определяют биологическую активность. Из 275 кг травы горицвета (50—60 ЛЕД) получают около 100 кг концентрата адонизида (100—200 ЛЕД в 1 мл). К концентрату добавляют этанол, хлорбутанолгидрат и воду в таком количестве, чтобы в 1 мл конечного продукта содержалось 20% этанола, 0,5% хлор- бутанолгидрата и 23—27 ЛЕД. Предназначен препарат для внут- реннего применения, выпускается во флаконах темного стекла по 15 мл. Применяют в качестве сердечного (кардиотонического) средства. Хранят адонизид в прохладном, защищенном от света месте. Препарат контролируют ежегодно. Список Б. Адонизид-концентрат с активностью 85—100 ЛЕД в 1 мл и содержанием этанола не менее 20 % выпускается в бутылях как полуфабрикат, который используется для производства препарата «Кардиовален». Список А. «Сухой адонизид» предложен Н. А. Бугрим и Д. Г. Колесни- ковым (ХНИХФИ). Он получен дополнительной очисткой адонизида-концентрата. Сумму гликозидов экстрагируют из водного раствора хлороформ-этанольной смесью (2:1). Полученное извлечение упаривают, остаток растворяют в 20% этаноле и раствор пропускают через колонку, заполненную алюминия оксидом сорта «для хроматографии». Колонку промывают 20% этанолом до отрицательной реакции подлинности в элюате. Из объединенных элюатов и фильтрата экстрагируют гликозиды хлороформ- этанольной смесью (2:1). Извлечение обезвоживают высушенным натрия сульфатом, упаривают в вакууме досуха, остаток растворяют в 95% этаноле. Из полученного раствора гликозиды осаждают эфиром. Осадок отделяют и сушат. Получают аморфный желтый порошок горького вкуса, негигроскопичный, стойкий при хранении в обычных условиях. Выход из 2 кг адонизида- концентрата (85 ЛЕД в 1 г) составляет 8,1—8,5 г адонизида сухого. Биологическая активность препарата 14 000—20 000 ЛЕД в 1 г. Применяют для приготовления таблеток, содержащих по 0,00075 г адонизида. Активность 1 таблетки 10—15 ЛЕД. Лантозид (Lantosidum) получают из листьев наперстянки шерстистой (Digitalis lanata Ehrh.), активность не менее 60 ЛЕД 168 в 1 г. Листья измельчают и экстрагируют 24% этанолом в 2-х экстракторах. В экстрактор 1 загружают 50 кг сырья, заливают 8-кратным количеством этанола и настаивают в течение 16—20 ч. Для ускорения диффузии растворитель циркулируют 2—3 раза. Полученный экстракт (300 л) сливают в отстойник для осаждения сопутствующих веществ. В экстрактор 1 заливают новую порцию 24% этанола (400 л) и настаивают 16—20 ч. Затем ее сливают и используют в качестве экстрагента свежей порции сырья, загруженного в экстрактор 2. Через 16—20 ч извлечение из экстрактора 2 сливают в отстойник для осаждения сопутствующих веществ, а в него снова заливают 400 л 24% этанола и оставляют для настаивания на 16—20 ч, после чего экстракт сливают и используют для следующей порции сырья. Из отработанного сырья в экстракторе 1 рекуперируют этанол, в него загружают новую порцию сырья и настаивают с извлечением, полученным из экстрактора 2, и т. д. Последующую экстракцию проводят так же, как описано выше. В каждой отдельной порции водно-этанольного экстракта (300 л) осаждают сопутствующие вещества 40% водным раствором свинца уксуснокислого. Раствор прибавляют постепенно по 1,0— 1,5 л при перемешивании. Всего на осаждение расходуется 20 л раствора свинца уксуснокислого. При полном осаждении, которое определяется отсутствием помутнения пробы при прибавлении к ней нескольких капель раствора свинца уксуснокислого, образовавшийся аморфный осадок отстаивают 18—20 ч. Прозрачный раствор сифонируют, а оставшуюся часть вместе с осадком отфильтровывают через бельтинг. Раствор объединяют с фильтратом и обрабатывают для осаждения ионов свинца 25% раствором натрия сульфата, добавляя его порциями по 0,5 л. На полное осаждение ионов свинца расходуется 12 л раствора. Из очищенного водно-этанольного экстракта гликозиды извлекают органическим растворителем. Для этого 200 л экстракта и 20 л смеси метилена хлористого и этанола (3:1) перемешивают в аппарате с мешалкой 30 мин, затем на 30 мин оставляют для расслаивания и отстоявшийся нижний слой раствора гликозидов в метилене хлористом сливают. Операцию повторяют 3 раза, каждый раз загружая в аппарат по 20 л смеси метилена хлористого с этанолом (3:1). Экстракт обезвоживают высушенным натрия сульфатом, отгоняют растворитель при температуре 37—40 °С и разрежении 66661—73327,1 Н/м 2 . Кубовый остаток в количестве 1,5—2,0 л сливают в кристаллизатор и помещают в вытяжной шкаф. По мере испарения метилена хлористого выделяется сумма гликозидов в количестве 285,8 г. Гликозиды растворяют в 3 л 96% этанола и определяют биологическую активность. На основании полученного анализа в раствор добавляют этанол и воду с таким расчетом, чтобы активность препарата составляла 10—12 ЛЕД в 169 1 мл, а содержание этанола — 68—70%. Полученный раствор фильтруют на фильтр-прессе через стерилизующие пластины. Технология препарата разработана в ВИЛР. Применяют главным образом в амбулаторной практике для поддерживающей терапии при хронической недостаточности кровообращения. Лантозид выпускают во флаконах-капельницах по 15 мл. Хранят в прохладном, защищенном от света месте. Список Б. Коргликон (Corgliconum) получают из травы ландыша майского (Convallaria majlis L.) и его географических разновид- ностей — Закавказского (C. transcaucasica Utr.) и дальневос- точного-кейскея (C. keiskei Migu.). Технология препарата разработана в ХНИФХИ. Траву ландыша (биологическая активность не менее 120 ЛЕД) экстрагируют 80% этанолом в батарее из 4-х экстракторов методом противотока. В первый экстрактор загружают 45 кг травы, 3,0 кг кальция карбоната, 0,3 кг кальция оксида, заливают 250 л 80 % этанола. Через 8—10 ч извлечение из первого экстрактора передавливают во второй подачей в него свежего экстрагента. После заполнения всех экстракторов и по истечении нужного времени настаивания в последнем из него собирают экстракт со скоростью 20 л/ч. Его подают в вакуум-выпарной аппарат и полностью отгоняют этанол при температуре 50—60 °С и вакууме 86659,3—93325 Н/м 2 . К кубовому остатку прибавляют раствор 10 г квасцов алюмокалиевых в 50 мл воды очищенной и отстаивают 3—5 ч. Отстоявшийся раствор отделяют от смол фильтрованием через марлю. Смолу промывают раствором натрия хлорида (0,3 кг на 20 л воды) до полного извлечения из нее гликозидов. Водный раствор гликозидов фильтруют на нутч-фильтре через один слой бязи и два слоя фильтровальной бумаги и передают на адсорбционную колонку из нержавеющей стали, высотой 75 см, диаметром 30 см, заполненную 18 кг алюминия оксида второй группы активности. Через колонку последовательно пропускают раствор гликозидов, промывные воды и 40 л обессоленной воды. При этом водный раствор гликозидов полностью очищают от дубильных веществ. Раствор, пропущенный через колонку, должен иметь значение рН 6,0—7,0; если оно ниже 6,0, раствор нейтрализуют натрия гидрокарбонатом. Гликозиды из водного раствора переводят в органический растворитель, повторно обрабатывая его хлороформом до обесцвечивания органического растворителя, а затем смесью хлороформ-этанол (3:1), при добавлении аммония сульфата, до полного извлечения гликозидов. Хлороформно-этанольное извлечение обезвоживают высушенным натрия сульфатом и упаривают при температуре 70—80 °С. 170 К кубовому остатку в количестве 6 л прибавляют 0,5 кг высушенного натрия сульфата и 0,1 кг угля активированного, оставляют на 2 ч и фильтруют через фильтровальную бумагу. Очи- щенный кубовый остаток упаривают при температуре 80—90 °С и вакууме 87992,52—93325,4 Н/м 2 . Сухой остаток растворяют в 3 л очищенной воды, фильтруют и подают на колонку, заполненную 3 кг алюминия оксида I—II группы активности. Колонку промывают очищенной водой. Из очищенного водного раствора гликозиды извлекают хлороформ-этанольной смесью (4:1). Извлечение обезвоживают высушенным натрия сульфатом и сгущают при вакууме 79993,2—86659,3 Н/м 2 до 1 л кубового остатка. К нему приливают эфир этиловый, быстро перемешивают и эфир сливают. Остаток растворяют в 1,3 кг ацетона, добавляют 0,1 кг угля активированного и фильтруют. Фильтрат упаривают до консистенции экстракта густого. Экстракт растирают с безводным эфиром, эфир сливают и операцию повторяют 5—7 раз до получения тонкого аморфного порошка, который растирают до полного удаления эфира и сушат на воздухе. Выход коргликона 100 г, активность 19 000—27 000 ЛЕД в 1 г. Препарат выпускают в виде 0,06% раствора для инъекций в ампулах по 1 мл (активность 11—16 ЛЕД). Раствор готовят с добавлением консерванта — 0,4% хлорбутанолгидрата, стерилизуют фильтрованием через мембранные фильтры с диаметром пор не более 0,3 мкм. Применяют внутривенно, при острой сердечной недостаточности. Хранят в прохладном, защищенном от света месте. Список Б. Дигитоксин (Digitoxinum) получают при ферментации листьев, экстрагировании из них действующих веществ, очистке вытяжки, выделении суммы гликозидов, получении дигитоксина, стандартизации. Предварительная ферментация листьев увеличивает выход дигитоксина в 4 раза. С этой целью измельченные листья напер- стянки замачивают водой (37—40 °С) и оставляют при этой темпе- ратуре на 40—48 ч. Листья после ферментации помещают в реак- тор с мешалкой и трижды экстрагируют смесью метилена хлорис- того и этанола. Полученную вытяжку упаривают под вакуумом при температуре 50 °С. Концентрированный экстракт обрабатыва- ют формамидом и проводят очистку (жидкостную экстракцию), обрабатывая вытяжку бензолом 5 раз, смесью бензола и хлоро- форма (3:2) до 10 раз. Вытяжку упаривают под вакуумом, остаток растворяют в хлороформе. Хлороформный раствор сердечных гли- козидов переносят на колонку с алюминия оксидом для их распре- деления: в верхнем участке — гитоксин, в нижнем — дигитоксин. Дигитоксин элюируют с алюминия оксида метанолом под контролем УФ-лампы. Дигитоксин имеет голубое свечение, 171 гитоксин — коричневое. Элюат, содержащий дигитоксин, упаривают под вакуумом досуха. Остаток растворяют в ацетоне, упаривают под вакуумом, добавляют бензол и оставляют для кристаллизации дигитоксина. Перекристаллизацию повторяют несколько раз при комнатной температуре. Кристаллы промывают этанолом и высушивают на воздухе. Дигитоксин — белый кристаллический порошок, практически нерастворим в воде, мало растворим в этаноле и хлороформе, очень мало в эфире. 1,0 г должен содержать 8000—10 000 ЛЕД, в.р.д. внутрь — 0,0005 г, в.с.д. — 0,001 г. Выпускают в таблетках по 0,0001 г и свечи по 0,00015 г. Хранят в прохладном, защищенном от света месте. Список А. Целанид, дигоксин (Celanidum, Digoxinum) получают из листьев наперстянки шерстистой. Дигоксин представляет собой вторичный гликозид. Его получают путем ферментативного и щелочного гидролиза целанида. В качестве экстрагента используют 90% метанол. Вытяжку подвергают многократной очистке путем смены растворителя, экстракции жидкость—жидкостью и хроматографирования на алюминия оксиде. Из очищенного раствора на холоду выпадает кристаллический осадок, пред- ставляющий собой сумму гликозидов (дигиланиды А, В, С), — технический продукт. Его растворяют в этаноле при нагревании с углем активированным и оставляют на холоду для кристалли- зации. Выпавшие кристаллы представляют собой смесь нативных гликозидов дигиланиды А, В, С. Стандартизацию проводят биологи- ческим путем. 1,0 г препарата должен содержать 14 000 ЛЕД. Это белый кристаллический порошок, мало растворимый в воде и этаноле, растворимый в метаноле. Чувствителен к свету. Список А. Целанид выделяют из смеси гликозидов методом жидкостной экстракции. Готовят две фазы: тяжелую — с плотностью, равной 1,3150 (дихлорэтан и хлороформ), и легкую — с плотностью 0,9460 (метанол и вода). Смешивают обе фазы (1:1) и растворяют кристаллы гликозидов-дигиланидов А, В, С. В тяжелой фазе остаются дигиланиды А и В, в легкую переходит дигиланид С. Эту фазу фильтруют через стеклянный фильтр № 3, промывают холодной водой (5—10 °С) и кристаллизуют, затем многократно перекристаллизовывают из этанола и сушат под вакуумом. Целанид в 1,0 г должен содержать 14 000—16 000 ЛЕД. Это белый кристаллический порошок, очень мало растворим в воде и этаноле. При приеме внутрь в.р.д. — 0,0005 г, в.с.д. — 0,001 г, внутривенно в.р.д. — 0,0004 г, в.с.д. — 0,0008 г. Выпускают таблетки по 0,00025 г и растворы для инъекций 0,02% и 0,05%. Хранят в герметически закрытых банках оранжевого стекла. Список А. 172 В настоящее время разработана технология дигоксина. Схема процесса близка к таковой для дигитоксина. Получают препарат из предварительно ферментированных листьев экстрагированием смесью метилена хлористого и этанола с последующей очисткой вытяжки и разделением суммы гликозидов хроматографированием на алюминия оксиде с последующим щелочным гидролизом продукта. Дигоксин — белый кристаллический порошок, плохо растворим в воде. Лекарственная форма — таблетки по 0,00025 г для взрослых и по 0,0001 г — для детей. Список А. Все препараты наперстянки оказывают выраженное кардио- тоническое действие и широко применяются в современной медицине. Терапевтическое действие гликозидов наперстянки проявляется гораздо медленнее, чем полярных гликозидов типа строфанта. Эффективность сердечных гликозидов зависит от степени абсорбции, фиксации их клетками сердечной мышцы, скорости метаболизма и выведения. Плохая растворимость глико- зидов наперстянки обусловливает их недостаточную абсорбцию, особенно в течение первых часов после приема, отсюда — замедленное терапевтическое действие. Кроме того, биологическая доступность плохо растворимых лекарственных веществ зависит от размера частиц, вводимых по типу суспензии. С целью достижения максимального терапевтического эффекта лекарственные вещества должны находиться в молекулярно- дисперсном состоянии. В связи с этим предложено для получения лекарственных форм препаратов наперстянок использовать твердые дисперсные системы, т. е. такие, где лекарственное вещество диспергировано в твердом носителе (матрице) путем сплавления или растворения. Для улучшения абсорбции дигитоксина и дигоксина разработана технология твердых дисперсных систем с поливинил- пирролидоном. Установлено, что использование дигоксина в виде твердых дисперсных систем позволяет увеличить скорость его растворения и время наступления терапевтического действия. Препараты на основе сердечных гликозидов 1. Дигитоксин , таблетки, содержащие 0,0001 г индиви- дуального гликозида. 2. Гитоксин , таблетки, содержащие 0,0002 г индивидуального гликозида. 3. Кордигит , таблетки, содержащие 0,0008 г высоко- очищенной суммы вторичных гликозидов наперстянки красной. 4. Дигоксин , таблетки, содержащие 0,00025 г индивидуального лантозида; ампулы по 1 мл 0,025% раствора. 173 5. Целанид , таблетки, содержащие 0,00025 г индивидуального лантозида С; ампулы по 1 мл 0,02% раствора. 6. Лантозид , раствор во флаконах очищенной суммы гликозидов наперстянки шерстистой; содержит в 1 мл 9—12 ЛЕД. 7.2.5. Стероидные сапонины Растительные гликозиды, обладающие способностью образовывать с водой мыльную пену, получили название сапонинов. При гидролизе они образуют агликоны типа спиростанола- ?, дигитогенина. Углеродная часть гликозидов содержит от одного до шести моносахаридных звеньев. Так, в сапонине дигитонине содержатся Д-ксилоза, 2 звена Д-глюкозы и 2 звена Д-галактозы, с высшими спиртами, а также с холестерином сапонины образуют устойчивые молекулярные комплексы. При попадании в кровь высокотоксичны — вызывают гемолиз эритроцитов при разведении 1:50 000. Получают стероид- ные сапонины из наперстянки, диоскореи, аралии, сои и других растений путем экстракции их водой или водными растворами этанола. Индивидуальные соединения выделяют с помощью адсорбционно-хроматографических методов или методом противо- точного распределения. Применяют для синтеза стероидных гормонов, для получения антиатеросклеротических и венотонизирующих препаратов. Многие настойки содержат сапонины, обладающие мочегонным и отхаркивающим действием. Технология производства стероидных сапонинов Первые новогаленовые препараты, содержащие стероидные сапонины, стали вырабатываться из диоскореи. Диоспонин (Diosponinum). Сухой очищенный экстракт из корней и корневищ диоскореи кавказской, содержит сумму водорастворимых стероидных сапонинов. Сырье экстрагируют 8% этиловым спиртом в батарее по принципу противоточной мацерации. Извлечение упаривают под вакуумом до 1/10 объема вытяжки. К кубовому остатку добавляют алюмокалиевые квасцы для осаждения смолистых веществ. После фильтрации вытяжку направляют в адсорбционную колонку с окисью алюминия. Реасорбцию проводят обессоленной водой. Вытяжку дополнительно очищают жидкостной экстракцией хлороформом. После этого следует экстракция суммы сапонинов селективным экстрагентом — хлороформно-спиртовой смесью. После удаления под вакуумом экстрагента получают препарат в виде порошка. Применяется как гипохолестеринемическое средство при атеросклерозе. Выпускается в таблетках по 0,1 г. 174 Препараты на основе сапонинов 1. Диоспонин , таблетки по 0,1 г — сухой экстракт из корневищ и корней диоскореи кавказской. Содержит сумму стероидных сапонинов, не менее 30%. Применяют при атеросклерозе как гипохолестеринемическое средство. 2. Полиспонин — сухой экстракт из диоскореи ниппонской с содержанием суммы сапонинов не менее 17%. Форма выпуска — таблетки по 0,1 г. Назначение то же, что и диоспонина. 3. Трибуспонин , таблетки по 0,1 г, содержащие сумму стероидных сапонинов из травы якорцев стелющихся. Показания к применению те же, что и для диоспонина и полиспонина. 7.2.6. Слизистые водорастворимые полисахариды К этой группе полисахаридов относятся углеводы, образующие густые слизистые растворы. В состав слизей входят пентозаны и гексозаны. От крахмала они отличаются отсутствием характерных зерен и реакции с раствором йода, от пектиновых веществ — отсутствием полигалактуроновых кислот и желирующей способ- ностью, от камедей — осаждаемостью нейтральным раствором свинца ацетата. В химическом отношении слизи трудно отличить от камедей. Основным отличием является значительное преобладание пентозанов (их количество может доходить до 90%) над гексозанами. Водорастворимые полисахариды водорослей представлены в основном в виде солей альгиновой кислоты. Из физических свойств для слизей характерна полная растворимость в воде, в то время как для ряда камедей свойственно только набухание По характеру образования слизей сырье различают следующим образом: 1) сырье с интерцеллюлярной слизью (льняное семя, блошное семя и др.); 2) сырье с внутриклеточной слизью (клубни ятрышника, корень и листья алтея, листья подорожника, листья мать-и-мачехи и др.); 3) сырье, содержащее мембранную слизь (ламинария и другие водоросли). Выделяют слизистые водорастворимые полисахариды методами дробной мацерации в сочетании с кипячением и противоточной экстракцией в батарее перколяторов, очистку проводят, как правило, этанолом с последующей фильтрацией и сушкой. Технология препаратов, содержащих слизистые водорастворимые полисахариды Промышленным источником сырья для получения слизистых веществ являются листья подорожника большого и бурые водоросли. 175 Плантаглюцид (Plantаglucidum). Суммарный препарат, получаемый из листьев подорожника большого (Plantago major L.), содержащий смесь полисахаридов, восстанавливающих сахаров и галактуроновую кислоту. Предложен для лечения больных гепацидными гастритами, а также язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки с нормальной или пониженной кислот- ностью. Применяют в период обострения и для профилактики рецидивов. Экстракцию листа подорожника большого проводят дробной мацерацией в сочетании с кипячением. Сырье в экстракторе вначале обрабатывают острым паром в течение 20—22 мин. Затем заливают горячую воду 87—90 °С, кипятят 35—40 мин, настаивают 3—4 ч и извлечение подают в сборник (1-й слив). Сырье повторно заливают горячей водой, кипятят 30—35 мин и настаивают 2 ч. Полученное извлечение (2-й слив) объединяют с первым. Объединенные вытяжки фильтруют и подают в пленочный выпарной аппарат. Упаривание извлечения проводят при температуре 52—55 °С при разрежении 800 000 — 930 000 Н/м 2 (79993,2—93325,4 Н/м 2 ) до 1/10 первона- чального объема. Осаждение комплекса водорастворимых веществ из упаренного экстракта проводят 3-кратным количеством этанола, прибавляя его в реактор постепенно при непрерывно работающей мешалке. Выделившийся слизистый осадок отстаивают, надосадочную жидкость отсасывают в сборник с помощью вакуума, а оставшуюся суспензию фильтруют на фильтр-прессе. В качестве фильтрующего материала применяют лавсановую ткань ТЛФ-300. Отжим осадка на фильтре под давлением 0,8—1 мПа позволяет снизить его влажность до 30—35%. Окончательное высушивание плантаглю- цида проводят в вакуум-сушильном шкафу при температуре 50— 60 °С и разрежении 79993,2—93325,4 Н/м 2 до содержания влаги не более 10%. Плантаглюцид — порошок серого цвета, горьковатого вкуса, растворим в воде с образованием слизи. Выпускают в форме гранул во флаконах по 50 г. Хранят в сухом, защищенном от света месте. Ламинарид (Laminaridum). Суммарный препарат, полученный из морской капусты — ламинарии (Laminarin), содержащий смесь полисахаридов с белковым компонентом и соли альгиновых кислот. Применяют главным образом при хронических запорах (со спастическими явлениями). Препарат не оказывает резкого послабляющего действия, не раздражает кишечник и не вызывает явлений привыкания. Ламинарид набухает в желудочно-кишечном тракте, увеличиваясь в объеме более чем в 10 раз. Благодаря этому свойству усиливается перистальтика желудка и кишечника и ускоряется продвижение их содержимого. 176 Извлечение полисахаридов осуществляют противоточной экстракцией в батарее диффузоров. С целью удаления минеральных примесей из растительного сырья непосредственно в диффузоре перед экстрагированием проводят промывку сырья холодной питьевой водой. Экстракцию действующих веществ из морской капусты осуществляют методом противоточной экстракции в батарее из четырех диффузоров, обеспеченных паровой рубашкой. В качестве экстрагента используют горячую воду 85—95 °С в соотношении экстрагент- сырье (400:30). Вышеуказанную температуру поддерживают 25—35 мин водяным паром через паровую рубашку. Параллельно с настаиванием сырья в диффузоре 1 проводят предварительную промывку сырья — слоевищ ламинарии в диффузоре 2. По истечении времени настаивания сырье в диффузоре 1, заполняют горячим экстрагентом диффузор 2 путем подачи его насосом из сборника, заполнение ведут до появления извлечения из воздушки диффузора. Каждый диффузор нагревают до температуры 85—90 °С и настаивают в течение 25—35 мин при постоянной температуре. Параллельно готовят и экстрагируют третий диффузор. Затем включают насос и горячей водой вытесняют извлечение из первого диффузора во второй, из второго в третий. Заполняют экстрагентом все три диффузора таким образом, чтобы извлечение показалось из воздушки третьего диффузора, содержимое трех диффузоров нагревают до температуры 85—95 °С и оставляют батарею для настаивания на 25—35 мин. По истечении времени настаивания извлечение из третьего диффузора собирают в сборник, вытесняя с помощью насоса извлечение из первого во второй, из второго в третий диффузоры при постоянной подаче свежего экстрагента в первый диффузор. В момент получения готового продукта из последнего диффузора 3 первый отключают и загружают запасной 4, чистый экстрагент подают на сырье второго диффузора, который становится первым, а готовый продукт получают из запасного диффузора 4, который становится последним по той же технологии. Дальнейшее подключение головных диффузоров (со свежим сырьем) и отключение хвостовых диффузоров (с отработанным сырьем) продолжают в такой же последователь- ности. Работающая в режиме батарея состоит из трех диффузоров, занятых экстрагированием, и четвертого — перегружающего и промывающего растительное сырье. Объединенные извлечения из сборника передают на упари- вание в пенный испаритель. Осаждение полисахаридов из концентрированного извлечения проводят в реакторе 2-кратным количеством 85% этилового спирта при температуре 50 °С (1-й залив этанола). После первого залива спиртом содержимое реактора отстаивают 3 ч. При нормальном 177 осаждении ламинарид должен оседать мелкодисперсным осадком. Полнота осаждения считается достаточной, если при смешивании равных количеств маточного раствора (надосадочной жидкости) и 96% этилового спирта наблюдается выпадение суммы полисаха- ридов. Если полнота осаждения не достигнута, добавляют еще необходимое количество 85% этанола. Надосадочную жид- кость — маточный раствор, передают далее на ректификацию. На второй залив (1-ю промывку) применяют этанол крепостью не менее 92% и в том же соотношении, т. е. в пересчете на 2-кратный объем спирта к объему концентрата. Второе отстаивание проводят в течение двух часов. Маточный раствор — промывной спирт после второго отстаивания (если он крепостью не менее 85%), можно использовать на первый залив для осаждения следующей порции концентрата. Для лучшего осаждения полисахаридов необходимо провести третий залив (2-ю промывку) и брать на него этанола в количестве, равном массе исходного сухого сырья. Суспензию осадка ламинарида передают из реактора осаждения на нутч-фильтр. Сушку влажного осадка ламинарида проводят в вакуум-сушильном шкафу при температуре 55—65 °С в течение 10—12 ч. Высушенный корж ламинарида измельчают на центробежной мельнице. Выпускают в гранулах по 50 г. Хранят в сухом, прохладном месте. 178 Глава 8. СПОСОБЫ ОЧИСТКИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ (БАВ) РАСТИТЕЛЬНОГО, ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ, ПОЛУЧЕННЫХ НА ОСНОВЕ БИОСИНТЕЗА На стадии очистки извлечения культуральные жидкости подвергают последовательной обработке, целью которой является выделение комплекса действующих веществ в нативном состоянии или индивидуальных БАВ, свободных от сопутствующих веществ. Приемы и способы очистки БАВ весьма разнообразны и индивидуальны. Необходимость применения конкретного метода зависит от начальных свойств извлечения или культуральной жидкости (вязкости, концентрации продукта, наличия примесей и нежелательных нерастворимых веществ), а также от требуемой степени чистоты и конечной формы продукта (кристаллическое вещество, его концентрированный раствор, высушенный порошок и т. д.). Неочищенный продукт можно выделить, например, путем упаривания извлечения или культуральной жидкости после экстрагирования. Последовательность стадий очистки при получении высоко- очищенных БАВ выглядит следующим образом: 1. Отделение нерастворимых веществ. Для этой цели обычно используют фильтрование, центрифугирование, отстаивание, седиментацию и декантацию. 2. Очистка БАВ. На стадии очистки БАВ обычно происходит отделение примесей, а также дальнейшее концентрирование продукта. В этом случае чаще всего используют фракционное осаждение, экстракцию в системах жидкость—жидкость, разделение с помощью мембран, различные сорбционно- хроматографические методы. 3. Окончательная очистка БАВ. В рамках такой технологии обычно применяют центрифугирование, кристаллизацию, сушку распылением, лиофилизацией (вымораживанием) или отгонку органического растворителя. 8.1. Методы осаждения БАВ из растворов Осаждение белков, камедей, слизей, пектинов из водных растворов основано на изменении их растворимости при добавлении значительных количеств определенных веществ. Так, при добавлении в вытяжку раствора электролита, образующиеся 179 ионы электролита гидратируются, обезвоживая молекулы биополимера. При этом исчезает защитный гидратный слой молекул, наблюдается слипание частиц и осаждение биополимера. Высаливание очень широко применяется для очистки белковых гормонов (гипофиза, поджелудочной, щитовидной и паращито- видных желез), стероидных гормонов, ферментов слизистой оболочки желудка и поджелудочной железы, продуктов биосинтеза, простагландинов (ПГЕ 1 ) из плазмы крови человека. Необходимо учитывать и тот факт, что различные соли обладают разными высаливающими свойствами. Еще в 1389 г. Гофмейстер отметил, что наиболее эффективно белки осаждаются в присутствии солей с многозарядными анионами и катионами. Ряды ионов Гофмейстера (или лиотропные ряды), в которых ионы расположены примерно в порядке уменьшения высаливающей способности, выглядят следующим образом: Анионы: цитрат, тартрат, F – , H 2 PO 4 – , CH 3 COO – , BrO 3 – , Cl – , ClO 3 – , Br – , NO 3 – , ClO 4 – , CNS – Катионы: Th 4+ , Al 3+ , H + , Ba 2+ , Sr 2+ , Ca 2+ , Mg 2+ , Cl + , Pb + , NH 4+ , K + , Na + , Li + Для осаждения высокомолекулярных соединений чаще всего применяют хорошо растворимые в водных средах аммония сульфат и натрия хлорид, хотя ряды Гофмейстера показывают, что для этих целей можно использовать и другие соли. Известно применение для осаждения БАВ и флотоагентов (толуол), жидких (парафин и др.). Среди реагентов, способных специфически связывать и осаждать, например ферменты, значительную роль играют растворимые синтетические или природные полимеры и полиэлектролиты. При получении фермен- тов, в частности гидролаз, из культуральных жидкостей рекомен- довано использовать танин и белковые добавки — желатин, казе- ин, сыворотку, пектон или желатозу с добавлением танина. Осаждение биополимеров осуществляют и органическими растворителями (спирт, ацетон), проводимое при охлаждении — один из распространенных способов концентрирования растворов, содержащих белки, слизи, пектины. Он имеет ряд преимуществ перед высаливанием, в частности возможность регенерации, что положительно сказывается на экономических показателях технологического процесса. Однако органические растворители не обладают способностью осаждения белков и других биополимеров. При выборе конкретного метода осаждения необходимо учитывать не только степень обогащения и затраты на осаждение, но и требуемую степень чистоты биополимера. Известно, что осаждение белка зависит от ряда факторов, влияющих на их растворимость, в основном от величины рН, и 180 концентрации раствора. Наименьшая растворимость наблюдается при рН, равном pl, величине, специфической для каждого индивидуального белка. Так как при pl результирующий заряд молекулы белка равен нулю, а при иных значениях рН молекулы белка имеют тот или иной заряд, то силы электростатического отталкивания между молекулами растворенного вещества минимальны при pl. Такой механизм предполагает возможность разделения белков с различными изоэлектрическими точками путем фракционного осаждения; при данном рН будут осаждаться белки, pl которых наиболее близко этому рН (если другие характеристики белков, например молекулярная масса, близки). Путем изменения рН сложную смесь белков разделяют на фракции, содержащие различные белки. В то же время многие белки при слишком высоких или слишком низких значениях рН могут денатурироваться. По этой причине чаще всего применяют другой метод осаждения — высаливание. 8.2. Разделение БАВ с помощью мембран В настоящее время в химико-фармацевтической и микробиоло- гической промышленности все более широко получают сложные термически и химически лабильные органические соединения. Требуются «мягкие» условия производства, которым в значительной степени отвечают мембранные процессы. Внедрение мембранных процессов позволяет интенсифицировать технологию концентрирования биологически активных веществ, сокращая при этом потери их активности. Мембранные методы разделения смесей, содержащих биополимеры, значительно повышают качество продукции. Основой разработки современных экономических мембранных процессов явилось получение и последующее усовершенствование высокоселективных ацетатцеллюлозных и синтетических мембран. Так, за последние 20 лет, прошедших со времени получения мембран из ацетата целлюлозы, их проницаемость удалось увеличить приблизительно в 100 раз. В странах СНГ получили распространение ацетатцеллюлозные мембраны «Владипор», «Мифил» и синтетические полу- проницаемые мембраны — из сополимера винилпирролидона с метилметакрилатом. За рубежом широко применяют мембраны фирм «Абкор», «Миллипор» (США), «Шляйхер Шуель», «Сарториус» (Германия), «Амикон» (Голландия), «Нуклеопор» (Великобритания), комплексные системы ДДС-РО (Дания) для ультрафильтрации и концентрирования (обратный осмос), изготовленные на основе нейлона, поливинилхлорида, тефлона, ацетата нитроцеллюлозы. 181 Они имеют высокую пористость (84%), химически стойкие и биологически нейтральные. В настоящее время разрабатываются установки периоди- ческого и непрерывного действия с использованием аппаратов плоскорамного, рулонного, трубчатого типов, а также с применением полых волокон. Также расширяется промышленное производство мембранных фильтров с возможностью выделения достаточно малых частиц: 10—0,2 мкм — при микрофильтрации; 0,02—0,001 мкм — при ультрафильтрации; до 0,0001 мкм — при гиперфильтрации (обратный осмос). Все мембранные фильтры должны работать в условиях широкого интервала температур (0—60 °С), рН (3,0—11,0). При проведении мембранной фильтрации необходимо учитывать градиент электрического потенциала, концентрацию или давление. Среди жидкофазных мембранных процессов различают диализ, электродиализ, ультрафильтрацию, обратный осмос. 8.2.1. Диализ и электродиализ Явления диализа и электродиализа находят применение при очистке растительных вытяжек. Диализ основан на свойствах молекул биополимеров, имеющих большие размеры, не проходить через полупроницаемые мембраны, в то время как вещества с меньшими размерами молекул проходят через них довольно свободно. Для диализа используют пленки желатина, целлофана, коллодия, нитроцеллюлозы. Процесс диализа протекает обычно довольно медленно, он ускоряется при повышении температуры, увеличении площади диализа и приложении электрического тока. В последнем случае наблюдается явление электродиализа, которому подвержены в основном вещества, распадающиеся на ионы. Простейшая установка для электродиализа состоит из ванны, разделенной двумя полупроницаемыми перегородками на три отсека. В крайние отсеки опущены катод и анод, в средний отсек наливается диализуемая вытяжка. Катионы под действием электрического тока двигаются через полупроницаемые перегородки к аноду, анионы — к катоду. В среднем отсеке оста- ются вещества, которые не проходят через полупроницаемые перегородки. В процессе работы периодически или непрерывно производится отвод вытяжки, растворов продиализованного вещества. Электродиализ с ионообменными мембранами до настоящего времени не нашел широкого применения. Имеются лишь исследования, доказывающие возможность очистки технических полупродуктов, содержащих алкалоиды гиосциамин и сальсолин от высокомолекулярных неионизированных веществ методом электродиализа с гетерогенными мембранами МК-40 и гомоген- ными мембранами МК-1СС. 182 Исследования также показали, что происходящее в процессе электродиализа превращение катионитовых мембран в форму органического иона сопровождается сжатием ионообменных частиц гетерогенных мембран, нарушением их связи с ненабухшей основой мембран и равномерным сжатием всей гомогенной мембраны. В первом случае это приводит к микродеструкции мембраны и к значительному увеличению переноса растворителя вместе с недиссоциированными соединениями, что ограничивает возможности очистки. В случае применения гомогенных мембран микродеструкции при переходе в форму органического иона не происходит, поэтому гомогенные мембраны более перспективны для применения в процессе разделения природных полярных и неполярных органических веществ. 8.2.2. Ультрафильтрация Метод ультрафильтрации заключается в разделении высокомо- лекулярных и низкомолекулярных соединений на селективных мембранах, способных пропускать низкомолекулярные соединения под действием давления 1—5 кг/см 2 . Ультрафильтрация в 50— 20 раз эффективнее гель-фильтрации и в 1000 раз эффективнее очистки с использованием фракционирования этанолом. Применение ультрафильтрации имеет еще ряд преимуществ: исключается денатурация белка, так как процесс идет без фазовых превращений при любой температуре; возможны одновременное концентрирование и очистка от минеральных и низкомолеку- лярных органических веществ; незначительные затраты энергии. Ультрафильтрационные установки отличаются простой конструк- цией и эксплуатацией. Недостатком ультрафильтрации является эмпирический подход к подбору мембран на определенной стадии выделения БАВ. Теоретически предсказать ультрафильтрационные свойства растворов сложного состава невозможно, так как мембраны обычно стандартизируют кислыми веществами с определенной молекулярной массой. В нашей стране выпускают ультрафильтра- ционные ацетатцеллюлозные мембраны: УАМ 50м, УАМ 100м, УАМ 150м, УАМ 200м, УАМ 300м, УАМ 500м. Технология ультрафильтрации следующая: суспензию под давлением пропускают через полупроницаемую мембрану с большим количеством пор мельчайшего диаметра (0,02— 0,001 мкм), в результате чего коллоидные частицы задерживаются мембраной, а вода и содержащиеся в ней молекулы проходят сквозь стенки нитей и скапливаются в корпусе патрона. Даже при низком давлении обеспечивается интенсивный поток фильтрата. Активная часть мембраны — это поверхность, по которой проходит суспензия. Разделение фракций происходит именно на этой тонкой 183 поверхности. Мембрана неоднородна по толщине, вследствие чего сопротивление течению жидкости по всей ее поверхности минимально. Основные производители ультрафильтрационных установок — фирмы «Альфа-Лаваль» (Швеция), «Миллипор» (США), ДДС-РО (Дания), «Амикон» (Нидерланды), АИ-ОУВ, АИ-0УП, УЛС-3, УКТ-40, УКФ-80 (Россия). 8.2.3. Обратный осмос Обратный осмос (гиперфильтрация) — переход растворителя (воды) из раствора через полупроницаемую мембрану под действием внешнего давления. Избыточное рабочее давление раствора в этом случае намного больше осмотического. Движущей силой обратного осмоса является разность давлений: Р = Р р-ра – Р ос Для разделения веществ применяют мембраны двух типов: 1. Пористые с размером пор 10 –4 —10 –3 мкм (1—10 Е). Селективная проницаемость основана на адсорбции молекул воды поверхностью мембраны и ее порами. В нашей стране выпускают ацетатцеллюлозные мембраны: УАМ-50м, УАМ-500м. 2. Непористые диффузионные мембраны образуют водородные связи молекулами воды на поверхности контакта. Под действием избыточного давления эти связи разрушаются, молекулы воды диффундируют в противоположную сторону мембраны, а на образовавшиеся свободные места проникают следующие. Таким образом, вода как бы растворяется на поверхности и диффундирует внутрь слоя мембраны. Почти все БАВ, кроме газов, не могут проникать через такую мембрану. В нашей стране и странах СНГ выпускают гиперфильтрационные ацетатцеллюлозные мембраны МГА-80, МГА-90, МГА-100. Цифра в марке означает процент селективности (S): % 100 1 2 1 Ч ? = C C C S , где С 1 и С 2 — концентрация веществ в исходном растворе и фильтрате, мг/мл. На этом принципе работают промышленные отечественные установки типа «Роса», УГ-1, УГ-10, производительностью соответственно от 0,1 до 1 и от 1 до 10 м 3 /сут, и зарубежные фирмы «Абкор» (США), ДДС-РО (Дания). Обычно установки обратного осмоса предназначены для однородных высоковязких жидкостей, выпускают установки двух типов: трубчатые и рулонные, применяя не менее пяти марок фильтрующего материала, обладающих высокой стойкостью к рН (1—13), селективностью и рабочей температурой до 80 °С. 184 8.3. Сорбция Методы очистки БАВ сорбцией в настоящее время нашли широкое применение в химико-фармацевтической и микробиоло- гической промышленности. Сорбцией называют процесс поглощения газов, паров, растворенных веществ твердыми и жидкими сорбентами. Различают несколько видов сорбции. Адсорбция — поглощение вещества на поверхности сорбента. Поверхность сорбента обычно очень велика, так как на ней имеется огромное количество пор. Так, поверхность 1 г активированного угля имеет площадь, равную 600—1000 м 2 . Процесс адсорбции имеет селективность и позволяет адсорбировать определенные БАВ из раствора. Абсорбция — поглощение вещества всем объемом твердой или жидкой фазы. Абсорбцию используют, например, при получении эфирных масел. При получении эфирных масел анфлеражем цветы помещают в закрытый сосуд над жиром, который всей своей массой абсорбирует эфирное масло. Хемосорбция — поглощение веществ с образованием химических соединений. К хемосорбции относятся ионный обмен, аффинная и гидрофобная хроматография. В производстве БАВ растительного и животного происхождения и на основе биосинтеза в основном используют адсорбцию. 8.3.1. Сорбционные процессы Сорбционный процесс выделения веществ из раствора смеси веществ представляет собой единство процессов сорбции и десорбции. Процесс десорбции разделен на два этапа: собственно десорбцию, т. е. получение элюата, содержащего целевой продукт, и регенерацию, т. е. удаление из сорбента всех сорбировавшихся веществ, позволяющих вернуть сорбент вновь на стадию адсорбции. Рациональный выбор адсорбентов, растворителей и условий их применения для получения веществ из растворов должен базироваться на следующих положениях. 1. Адсорбент и условия адсорбции должны быть выбраны так, чтобы они обеспечивали преимущественную и максимальную сорбцию извлекаемого вещества и его минимальную остаточную концентрацию в растворе в условиях равновесия. 2. Десорбирующий растворитель и условия десорбции должен быть выбран так, чтобы в условиях равновесия элюат с относительно высокой концентрацией вещества находился бы в равновесии с адсорбентом с малым содержанием вещества, т. е. чтобы адсорбция из десорбирующего растворителя была бы минимальной. 185 Следует отметить, что оба эти условия неотделимы друг от друга и, следовательно, выбранный адсорбент должен обеспечивать их выполнение. В случае сорбции на молекулярных сорбентах осуществление первых двух условий ведения адсорбционных процессов при выделении веществ из растворов сводится к подбору адсорбента и условий его использования, которые обеспечили бы резкое различие в адсорбционных потенциалах из водного раствора и десорбирующего растворителя. При подборе таких условий можно исходить из теории Поляни. По отношению к растворам адсорбционный потенциал растворенных веществ в данном случае выражается уравнением: , ln X H C C RT A = где С Н — концентрация насыщенного раствора; С Х — равновесная концентрация. Согласно Поляни адсорбированный объем сорбента всегда полностью заполнен адсорбируемым веществом и растворителем. При адсорбции растворенного вещества оно вытесняет из адсорб- ционного объема часть растворителя. Поэтому чем больше адсорб- ционный потенциал растворителя, тем меньше величина сорбции растворенного вещества. При выборе молекулярного сорбента для целей выделения веществ из растворов важную роль играет так называемое правило «уравнивания» полярностей, установленное Ребиндером. Согласно этому правилу адсорбция неполярных веществ на неполярных поверхностях будет успешно происходить из полярных растворителей, адсорбция полярных веществ на полярных адсорбентах — из неполярных растворителей. В качестве адсорбентов в технологии лекарств применяют пористые твердые вещества с большой удельной поверхностью, наиболее распространенными являются: алюминия оксид, силикагель (гель кислоты кремниевой), уголь активированный, кизельгур, полиамиды, полиакриламиды, сефадексы, целлюло- зы и др. Адсорбцию проводят в специальных аппаратах — адсорберах, простейшим из них является вертикальный цилиндрический аппарат периодического действия, заполненный адсорбентом. Вначале через адсорбент пропускают раствор и насыщают его поглощающим веществом, затем фильтруют десорбент- растворитель или смесь растворителей, вытесняющую поглощенное вещество. Для проведения непрерывной адсорбции применяют установки из нескольких адсорберов периодического действия, в которых попеременно происходят адсорбция и десорбция. 186 8.4. Адсорбционно-хроматографические методы Эти методы широко внедряются в производство ферментов, гормонов, рекомбинантных ДНК; для получения БАВ растительно- го и животного происхождения, к чистоте которых предъявляют особенно жесткие требования, традиционная технология очистки не подходит. В промышленном производстве успешно себя зарекомендовала распределительная хроматография, самый надежный и эффективный метод очистки. В настоящее время широко используют непрерывную колоночную и ступенчатую хроматографию. В табл. 8.1. приведены несколько известных хроматографических методов, основанных на различных парамет- рах разделяемых молекул. Таблица 8.1 8.4.1. Ионообменная хроматография Хроматография БАВ с помощью ионообменных сорбентов, называемая ионообменной, является одним из методов разделения, имеющих наибольшую продолжительную историю развития. В настоящее время промышленная ионообменная хроматография стала одной из важнейших технологических стадий получения коммерчески значимых количеств БАВ. В основе ионообменной хроматографии лежит реакция обмена между неподвижным твердым ионообменным сорбентом и растворенным в растворителе веществом. 8.4.2. Ионообменные материалы Ионообменные сорбенты представляют собой нерастворимые в воде вещества, синтетические или природные, содержащие в своей структуре ионогенные группы кислого (катиониты) или основного (аниониты) характера. Входящие в состав ионогенных групп ионы водорода (в случае содержания катионитов) или ионы гидроксила (в случае содержания анионитов) могут обмениваться с находящи- мися в растворе катионами или анионами по реакциям, образуя солевые формы ионитов: R – Н + Me + ? R – Me + Н + ; R – ОН + Анион – ? R – Анион + ОН – , 187 где R — высокомолекулярный анион катионита или высоко- молекулярный катион анионита. При взаимодействии катионитов в Н-форме с растворами оснований, а анионитов в ОН-форме с растворами кислот также происходит солеобразование в фазе ионита наряду с нейтрализа- цией растворов путем образования воды по реакциям: R – Н + + MeОН ? R – Me + Н 2 О; R – ОН + Н – Анион ? R-Анион + Н 2 О. Таким образом, катиониты в Н-форме представлены нераство- римыми кислотами, а аниониты в ОН-форме — нерастворимыми основаниями. Природные ионообменники — минералы типа монтморилон- тов, каолинатов и др. Синтетические органические ионообменники представляют собой большей частью продукты сополимеризации или поликонденсации различных органических веществ, в которые введены ионогенные группы: –SO 3 H, –СООН, –РО 3 Н и другие в случае содержания катионитов (соответственно этим группам катиониты называются сульфокатионитами, карбоксильными или фосфорнокислыми); =NH 2 + , (СН 3 ) 3 N + , =S + и другие в случае содержания анионитов. В зависимости от способности ионогенных групп к диссоциации катиониты делятся на сильно- и слабокислые, а аниониты — на сильно- и слабоосновные. Существуют иониты, содержащие в своей структуре ионогенные группы разной природы, т. н. полифункциональные иониты, например катионит КУ-1, в зависимости от рН раствора обмен может происходить с различными группами. Полимеризационные иониты большей частью представляют собой круглые гранулы различного диаметра. При одной и той же ионогенной группе и ocновном компоненте матрицы они отличаются количеством сшивающего агента, например, катиониты КУ-2-8 и КУ-2-20. Последняя цифра характеризует количество дивинилбензола, введенного в реакционную смесь при сополимеризации. Различие в количестве сшивающего агента существенно сказывается на таком свойстве ионитов, как их набухаемость, а это, в свою очередь, сказывается на избирательности и кинетике обмена. Развитие синтеза органических ионитов привело к созданию ряда специфических их разновидностей — ионитов, содержащих как кислые, так и основные ионогенные группы (так называемые амфотерные иониты), ионитов с повышенной гидрофобностью поверхности гранул (олеофильные иониты), ионитов, имеющих пористую структуру за счет введения при их синтезе веществ- парообразователей (макропористые иониты) и т. д. В настоящее время выпускают около 600 наименований различных синтети- ческих органических ионитов. Особым родом ионообменных материалов являются ионо- обменные мембраны, состоящие из ионитов. Мембраны бывают 188 гетерогенные, т. е. когда мелкосумельгенный ионит нанесен на полимерную индифферентную подложку, и гомогенные, представ- ляющие собой ионит в виде сплошного листа. Катионообменные мембраны обладают свойством пропускать через себя (находясь в растворе) при наложении электрического поля только катионы, анионообменные — только анионы. 8.4.3. Основные величины, характеризующие ионообменный процесс. Обмен органических веществ Основной практической величиной, характеризующей эффек- тивность применения ионитов для разделения смеси ионов, является концентрационная константа равновесия соответ- ствующей ионообменной реакции или коэффициент избира- тельности — K изб [ ] ( ) , H Me : Me + + + = ??? K где в квадратных скобках приведены концентрация обмени- вающих ионов в ионите, а в круглых — концентрация соответ- ствующих ионов в растворе. При K изб = 1 обмен не избирателен. Если К изб < 1, это значит, что Me + имеет меньшее сродство к иониту, чем ион Н + . Если K изб > 1, то больше избирательность поглощения иона из раствора. Для осуществления ионообменного поглощения ион из раствора должен продиффундировать к частице ионита, затем продиффундировать внутри ее к ионогенной группе и, наконец, должна произойти сама ионообменная реакция. В зависимости от свойств и структуры матрицы ионита, концентрации ионов в растворе, их размеров и строения, а также заполнения ими ионогенных групп ионита, стадией, определяющей скорость ионообменного процесса, может быть либо внешняя, либо внутренняя диффузия. Скорость сорбции в случае внешней диффузии при линейной изотерме сорбции определяется уравнением: ), ( 0 C C dt da ? ? = где а — концентрация иона в ионите в момент времени t; ? — кинетический коэффициент, ? = 3D 1 /( ? • r 0 ); D 1 — коэффициент внешней диффузии; ? — толщина пленки жидкости вокруг зерна; r 0 — радиус зерна ионита; С 0 — исходная концентрация иона в растворе; С — концентрация иона в растворе в момент времени t, равновесная с а. 189 Скорость сорбции при внутренней диффузии выражается уравнением ), ( 0 2 a a dt da ? ? = где ? 2 — кинетический коэффициент, ? 2 = 3D 2 /r 0 2 ; D 2 — коэффициент внутренней диффузии; r 0 — радиус зерна; а 0 — концентрация ионов в ионите, равновесная с C 0 Из приведенных формул следует, что для определения скорости ионообменного процесса весьма существенным является значение величин коэффициентов диффузии, которые характери- зуют ионообменную систему. Для технологии важно установить, какой из процессов ответственен за скорость суммарного процесса, так как возможности ускорения поглощения при определяющей роли внешней или внутренней диффузии различны. Ионообменная хроматография — один из самых широко применяемых методов разделения и очистки белков, благодаря высокой способности сорбентов связывать белок (50,0 г белка на 1 л ионообменной смолы) и возможности использования различ- ных методов элюации (непрерывной и ступенчатой). Основной принцип ионного обмена можно проиллюстрировать рис. 8.1. На первом этапе водный раствор смеси белков пропус- кают через колонку с неподвижным слоем ионообменной смолы. Рис. 8.1. Ионообменная хроматография: операции выделения (принцип метода) Одним из наиболее широко используемых для очистки белков ионообменником является карбоксиметилцеллюлоза — катионообменная смола, получаемая посредством введения карбоксиметильных групп (несущие отрицательный заряд) в целлюлозную матрицу. Белки в катионной форме (несущие положительный заряд) связываются с этой смолой электростати- 190 ческими силами. Затем адсорбированный белок элюируют буферными растворами с возрастающим значением — рН. Постепенное изменение свойств элюента приводит к тому, что слабосвязанные с носителем белки десорбируются первыми, а затем — все более прочно связанные с ионообменником. Следо- вательно, подвижная фаза, которая до ввода в колонку вообще не содержала белков, на выходе из колонки будет обогащена десорбированными белками. Полученный при промывании колон- ки элюат собирают в виде фракций небольшого объема. Аналогич- но осуществляют и хроматографию на ионообменных смолах — диэтиламиноцеллюлозе. 8.5. Гель-фильтрация Гель-фильтрация, или хроматография на молекулярных ситах, позволяет разделять вещества с различными молекулярными массами. В этом случае насадка колонки состоит из частиц геля с определенным диаметром пор. Если размер молекул больше диаметра пор, то они не могут диффундировать в гель и быстро проходят через колонку, тогда как молекулы меньшего размера проникают в гель и поэтому движутся более медленно (рис. 8.2). Рис. 8.2. В хроматографии на молекулярных ситах молекулы большего размера быстрее проходят через колонку, а молекулы меньшего размера задерживаются, проникая в частицы геля В качестве сорбентов обычно используют сефадексы G 25 , G 50 , G 75 , G 100 , состоящие из полимерных цепей полисахарида декстрана, соединенные через определенные промежутки поперечными связями и образующие своеобразные молекулярные сита. В химико- фармацевтической промышленности более широкое применение находят сефадекcы G 25 и G 50 в виде гранул с диаметром пор 100— 30 мкм и 20—80 мкм соответственно. Проницаемость мембраны для каждого из веществ смеси определяется величиной молекулы. В этой связи гель-хроматографию иногда называют молекулярным просеиванием. Определенный объем растворителя вымывает из колонки вещества с большей молекулярной массой (сефадексы G 25 ), и с меньшей молекулярной массой (сефадексы G 25 , G 50 ). 191 Основной величиной, измеряемой в гель-хроматографии, является удерживаемый объем V e : V e = V 0 + K d · V p , где V 0 и V p — объемы подвижной и неподвижной хромато- графических фаз; K d — коэффициент распределения, который зависит от соот- ношения размеров молекул и пор. Гель-фильтрация — метод, малочувствительный к составу образца, используется в основном при удалении осадителя, замене буфера и обессоливании. 8.6. Гидрофобная хроматография Метод гидрофобной хроматографии используют для разделения БАВ на основе гидрофобных свойств, характерных для биологических объектов. В основе механизма селективности при гидрофобной хроматографии лежит проявление так называемого гидрофобного эффекта, а также модуляция электровалентных взаимодействий, вследствие понижения локальной диэлектрической постоянной среды при введении неполярных радикалов или понижении активности растворителя. Гидрофобная хроматография реализуется в виде нескольких различных процессов. В наиболее часто встречаемом варианте сорбция амфильных соединений гидрофобными сорбентами осуществляется из разбавленных водных растворов при низких значениях рН (2,0—4,0), а элюация — путем снижения так называемой элюатропной силы подвижной фазы, достигаемой изменением рН, уменьшением полярности элюента (при добавлении спиртов, детергентов и других органических модификаторов). Этот вид хроматографии получил название обрат- нофазной (ОФХ). При введении в раствор амфильных соединений, способных вступать во взаимодействие с разделяемыми менее гидрофобными компонентами, последние все же можно разделить. Таким методом на неполярных сорбентах удается разделить даже ионизированные соединения, если добавить в раствор противоположно заряженные амфильные соединения, способные образовывать ионные пары с изучаемыми компонентами. Этот вид хроматографии был назван ион-парной обратнофазной хроматографией. Гидрофобное взаимодействие реализуется также и при так называемой высаливающей хроматографии (ВХ), часто называемой хроматографией гидрофобных взаимодействий, основной прием которой заключается в сорбции амфильных соединений из водных растворов при большой концентрации солей с последующей 192 элюацией солевыми растворами с более низкой ионной силой или водой. Иногда элюацию осуществляют таким образом, что одновременно с уменьшением концентрации соли повышают концентрацию гидрофобного вытеснителя. Как в обратнофазной, так и высаливающей хроматографии могут использоваться одни и те же типы сорбентов с пришитыми неполярными радикалами. 8.6.1. Сорбенты для гидрофобной хроматографии При проведении гидрофобной технологии следует учитывать физико-химические параметры сорбентов: пористость, удельную поверхность, гидрофильные и гидрофобные свойства, химическую стабильность, инертность, проницаемость. Всем этим требованиям отвечают обратнофазные гидрофобные сорбенты и макропористые гетерогенные полимерные сорбенты типа солоза К 30/40, К 20/40, К 10/40, КГ 8/40, гидрофобные свойства которых выражены более слабо, чем у обратнофазных сорбентов. Поверхность кремнеземных сорбентов содержит большое число силанольных (SiOH) и силоксановых групп (Si–O–Si), а также небольшое количество примесей оксидов металлов (табл. 8.2). Наибольшей химической однородностью обладают аэросилогели (силохромы), получаемые спеканием частиц непористого высоко- дисперсного диоксида кремния — аэросила. Таблица 8.2 Некоторые типы кремнеземных сорбентов для ОФХ биологически активных веществ 193 Различные модификации методов ОФХ широко используют для очистки пептидов, таких, как окситоцин, липрессин, АКРГ и его производных, пептидного гормона роста — соматотропина, пептидных антибиотиков, лейкоцитарного интерферона, для разделения высокомолекулярных белков (химотрипсиногена, ферритина и др.). Использование гидрофобной хроматографии удобно и при работе с высококонцентрированными растворами. Так, раствор аммония сульфата в концентрациях, несколько ниже необходимых для высаливания белка, способствует связыванию белков с гидрофобными гелями. Высокая концентрация соли снижает растворимость белков и увеличивает их способность взаимо- действовать с неполярной поверхностью сорбента. Фракциони- рование связанных белков часто достигается понижением поляр- ности элюента (например, с помощью полиэтиленгликоля). При использовании ион-парных агентов достигается дополни- тельное усиление селективности обратнофазных адсорбентов при разделении белков, олигопептидов и других БАВ. Ниже приведен список катионных и анионных амфильных соединений, используемых в качества ион-парных агентов: Катионные Анионные R 4 N + Алкилсульфонат R 3 NH + Тoлуолсульфонат S 2 NH 2 + Нафтилинсульфонат R — органические радикалы С 1 —С 10 Бутилфосфат Цитрат Трифторацетат При подборе условий разделения смеси белков при ОФХ обязательно учитывают рН раствора, вязкость и температуру. 8.7. Аффинная хроматография Интересным хроматографическим методом является аффинная хроматография, основанная на нативной специфичности некоторых биополимеров, особенно если они содержатся в культуральной жидкости в небольших концентрациях — менее 1 мкг/мл. В этом методе хорошее разделение достигается за счет специфического взаимодействия между иммобилизованным агентом и растворенным веществом. Между аффинной хроматографией и другими более традиционными методами адсорбционной или ионообменной хроматографии существуют значительные различия. В традиционных хроматографических методах сначала адсорбиру- ются все компоненты смеси, а их разделение осуществляется на стадии десорбции посредством, например, замены концентрации 194 элюента, или концентрации солей в элюенте, или постепенного повышения рН элюента. Напротив, специфичность аффинной хроматографии определяется в основном на стадии сорбции (рис. 8.3). Поэтому в аффинной хроматографии через колонку целесообразно пропускать раствор разделяемой смеси в течение достаточно длительного промежутка времени, пока не будет достигнуто насыщение неподвижной фазы, так как в ней адсорбируются практически только выделяемые соединения. Таким образом, проведение разделения БАВ в аффинной хроматографии приближается к обычной сорбции в неподвижном слое вплоть до насыщения слоя адсорбента и резко отличается от обычного разделения многокомпонентной смеси, вводимой в колонку однократно в виде концентрированного раствора. Рис. 8.3. Схематическое представление аффинной хроматографии: а — ввод смеси веществ; б — разделение; в — элюирование связанного с неподвижной фазой компонента смеси В этом методе хорошее разделение достигается за счет специфического взаимодействия между иммобилизованным агентом и растворенным веществом. Показаны три стадии: ввод смеси веществ а, разделение б; элюирование, связанное с неподвижной фазой компонента смеси в. 8.7.1. Сорбенты для аффинной хроматографии Сорбентами для аффинной хроматографии в основном являются полимеры, используемые для гельпроникающей хромато- графии, после целенаправленной модификации (агарозы, поли- акриламиды, целлюлозы, пористые стекла). Важнейший параметр при модификации исходных матриц — объемная концентрация, соответствующая группировке, которая, как правило, выбирается эмпирически. Второй важнейший параметр — стабильность нанесенного аффината в процессе сорбции — элюации. Если аффинатами являются белки, например, 195 поликлональные или моноклональные антитела, белковые и пептидные ингибиторы, то стабильность слоя аффината можно повысить, проводя дополнительную межмолекулярную сшивку. Концентрацию сливающего агента (например, глутарового альдегида) следует выбирать с учетом необходимости избежать существенного изменения конформации сшитых белков, часто приводящей к потере аффината. При выборе исходного сорбента приходится уделять внимание сокращению размеров доступных областей в порах после введения в них протяженных аффинатов. Поэтому матрицы для биоспе- цифической хроматографии с объемными аффинатами должны иметь диаметры пор, превышающие в 3—5 раз сумму хромато- графических диаметров макромолекул комплексов антиген—анти- тело, белок—ингибитор и т. д. При использовании белков в качестве аффинатов следует учитывать гетерогенность сорбционных центров, обусловленную такими факторами, как гетерогенность белков до присоединения (воздействие протеаз и денатурации, изменение структуры и свойств аффинатов в процессе присоединения), а также в процессе разделения. Этот фактор оказывается особенно существенным с точки зрения влияния нагрузки на колонку как при сорбции, так и при выборе условий десорбции. Сущность метода биоспецифической хроматографии состоит в том, что между одним или ограниченным числом белков- ферментов из множества имеющихся в фракционируемой смеси и полимерным сорбентом образуется довольно стабильная связь, в результате чего эти белки из раствора переходят на нераствори- мый сорбент, что повышает его селективность. Высокая селективность биоспецифических сорбентов обеспечивается тем, что в качестве лигандов используются вещества, специфически взаимодействующие с активным центром выделя- емого фермента. Центром связывания служат присоединительные к полимерным матрицам субстраты, их аналоги, обратимые инги- биторы, коферменты, антитела и другие вещества, обычно назы- ваемые лигандами. Таблица 8.3 Примеры сродства биологических молекул Вторым компонентом биоспецифического сорбента является полимерная матрица, к которой присоединяется лиганд. Матрицей 196 может быть любой полимер, в той или иной степени удовлетворя- ющий следующим требованиям: — крупнопористость гелевой структуры; — гидрофильность, обеспечивающая хорошее взаимодействие ее с водой и отсутствие неспецифического связывания белков по гидрофобным центрам; — отсутствие в структуре заряженных групп; — способность полимера легко активироваться определенными химическими агентами. Указанным требованиям отвечают: синтетические полимеры — полиакриламиды, сфероны, а также крупнопористое стекло и силикагели. Обычно хроматографический процесс состоит из последова- тельно меняющихся этапов сорбции, удаления несорбированных белков и элюации сорбированных ферментов. Большие перспективы открывает использование моноклональ- ных антител для приготовления аффинных гелей. Достаточно 4,0—5,0 антител, чтобы приготовить 1 л аффинного геля. Такие гели успешно применяют для выделения из среды культивиро- вания животных клеток, например, гормона роста человека — самототропина и интерферона. Направленный синтез биоспецифических сорбентов и выбор режимов аффинной хроматографии позволяет добиться таких высоких степеней очистки БАВ, которые недостижимы для других хроматографических приемов. За одну стадию степень очистки может достигать 10 2 —10 3 раз. По своей природе аффинная хроматография является вариантом адсорбционной хроматографии и ее основные закономерности близки обратнофазной и другим видам адсорбционной хроматографии. Используя уравнение [ ] , 0 0 0 V K P V V V K V D p p d e + = + = можно показать, что удерживание БАВ происходит только при условии [P 0 ] > K D , когда концентрация иммобилизованного аффината [P 0 ] больше константы диссоциации комплекса фермент—аффинат, например, относительное удерживание V e =V 0 = 10 при [P 0 ] = 1 ммоль/л возможно при величине константы диссоциации K D ? 10 –4 моль/л. Очевидно, что при использовании аффинатов с большей величиной K D необходимо повышать концентрацию иммобилизованного аффината. Наоборот, при использовании аффинатов с очень малыми величинами K D можно получить эффективно удерживающие сорбенты даже при небольших концентрациях аффинатов. 197 8.8. Электрофорез Электрофорезом называют разделение БАВ благодаря различной скорости их перемещения в электрическом поле. Постоянная скорость U e достигается частицей с зарядом q, в жидкой среде под влиянием электрического поля с напряженностью Е, определяется балансом qE = ?? ? ? ?? ? ? = ?? ? ? ?? ? ? ???? |