технология лек 2. Учебник соответствует учебной программе и предназначен для студентов фармацевтических высших учебных заведений и факультетов
 Скачать 5.32 Mb.
|
|
Крахмал картофельный (или кукурузный) содержит 98,5— 98,8% собственно крахмала, 0,4—0,6% белков, 0,6—0,7% жиров, 0,12—0,17% зольных элементов. Крахмал используют в ферментной, химико-фармацевтической промышленности для выращивания микроорганизмов, обладающих амилолитической активностью. Кукурузная мука — крахмалосодержащий субстрат, содержащий 60—70% крахмала, около 10% других углеводов, 10—12% белков, 3% жиров, 0,8—1% зольных элементов. Ее используют в основном в производстве антибиотиков. 278 Пшеничные отруби — отход мукомольного производства, используется для приготовления питательных сред при твердо- фазном способе культивирования. Отруби содержат 16—20% крахмала, 10—12% белков, 3—4% жиров, 10% клетчатки. Источники органического азота. Для выращивания микро- организмов широко используют субстраты, содержащие органи- ческие источники азота (аминокислоты, белки). Наиболее распро- страненные в биотехнологии натуральные субстраты — кукуруз- ный экстракт, соевая мука, свекловичный жом и другие — доста- точно доступные по стоимости. Кукурузный экстракт — побочный продукт крахмало-паточного производства, содержащий 40—50% азотистых веществ, в основном аминокислоты, и 10—12% углеводов, витаминов, микроэлементов. Соевая мука — богатый источник органического азота, в основном в виде белков. Помимо белков, в ней содержатся до 20% углеводов, большей частью трудноусвояемых организмом, 4,5—6,5% минеральных элементов, некоторые витамины. Свекловичный жом — отход сахарного производства из сахар- ной свеклы. Он содержит: белки — 8,9, жиры — 0,23, целлюлозу — 21,7, зольные элементы — 4,2, кальций — 4,7, фосфор — 1,2%. Другие виды сырья. Помимо основных компонентов питательных сред, в процессе ферментации нередко используют дополнительные виды сырья — предшественники, поверхностно- активные вещества (ПАВ), антибактериальные препараты и др. Предшественники — синтетические продукты, входящие в состав молекулы целевого продукта и добавляемые в фермента- ционную среду для интенсификации процесса биосинтеза. Например, при биосинтезе пенициллина в культуральную жид- кость добавляют в качестве предшественника фенилуксусную кислоту, при биосинтезе эритромицина — пропиловый спирт, витаминов В 12 — 5,6-диметилбензимидазол. Поверхностно-активные вещества в биологических производ- ствах используют главным образом для пеногашения. Антибактериальные препараты (фурадонин, фурацилин) — для поддержания асептических условий. 12.3.2. Технические средства для реализации процессов ферментации. Ферментаторы В микробиологических производствах применяют разнообраз- ные ферментаторы. Условно их можно разделить на следующие типы: барботажные, эрлифтные, барботажно-эрлифтные, с механическим перемешиванием, барботажные с циркуляционным перемешиванием, с эжекционной системой и др. По структуре потоков ферментаторы могут быть аппаратами полного переме- шивания или полного вытеснения. По способу ввода энергии и 279 аэрации различают аппараты с вводом энергии в газовую фазу, в жидкую фазу или комбинированные. Объем производственных ферментаторов может быть от 10 до 1000 м 3 с механическим перемешиванием и барботажем. Фер- ментаторы обычно представляют собой герметические цилиндри- ческие емкости, высота которых в 2—2,5 раза превышает диаметр, чаще всего их изготавливают из нержавеющей стали. В фермента- торах устанавливают мешалки турбинного, пропеллерного и другого типов. Диаметр мешалки составляет примерно 1/3 диаметра аппарата. В производстве ферментов распространены ферментаторы с мешалками, под которыми находится кольцевид- ный или радиальный воздушный барботер. Для поддерживания температуры в аппарате имеется двойной кожух или теплообмен- ник типа змеевика. Ферментатор оборудован арматурой и трубо- проводами для подачи питательной среды, воды и пара; раствора, регулирующего рН, пеногасителей, воздуха и других материалов. Современные ферментаторы укомп- лектовывают измерительными прибо- рами и регулирующими приборами для пеногашения, смотровыми люками. Главное требование к аппаратам — сохранение стерильности, поэтому они должны быть доступны для обработки горячим паром. Рабочий объем ферментатора обычно не превышает 6/10 общего объема. Свободное пространство над поверхностью раствора используется как буферное, где накапливается пена и таким образом предотвращаются потери культуральной жидкости. Исследования показали, что в пеня- щейся жидкости условия аэрации лучше, чем в плотных растворах, при условии непрерывного перемеши- вания и циркуляции слоя пены, т. е. при исключении длительного нахождения микроорганизмов вне культуральной жидкости. В инсти- туте микробиологии им. Кирхен - ш т е й н а А Н Л а т в и и с о з д а н ф е р - ментатор колонного типа объемом 100 м 3 с контактными устройствами (рис. 12.1). Рис. 12.1. Схема колонного ферментатора с контактными устройствами: 1 — корпус; 2 — контактное уст- ройство (перфорированная тарелка); 3 — змеевик с хладагентом; 4 — ох- лаждающая рубашка; 5 — труба для нисходящего потока жидкости; 6 — отбойники; 7 — барботер 280 Системы очистки воздуха Для обеспечения кислородом культуры микроорганизмов в условиях аэробного процесса при глубинной ферментации через единицу объема питательной среды в минуту необходимо продуть 0,5—2 объема воздуха. Его надо очистить от механических частиц, микроорганизмов и химических веществ перед введением в фермента- тор. Для очистки воздуха обычно используют фильтрацию (рис. 12.2). Воздух подают в систему под давлением 0,2 МПа (2 кгс/см 2 ). Для сжатия чаще всего используют турбо- или поршневые компрессоры. Перед подачей в компрессор воздух очищается от грубых частиц на масляных фильтрах. В ферментаторе он проходит через фильтры: сначала через общий, затем через индивидуальный. Эти фильтры выполняют функцию холодной стерилизации воздуха. Фильтры заполняют гранулированным зернистым или волокнистым фильтровальным материалом, используя гранулированный уголь и стекловату, диаметр волокон которых 18 мкм. В последнее время используют специальные бактерицидные волокна. Толщина фильтрующего слоя обычно 0,4—0,75 м. Индивидуальные фильтры часто заполняют стекловатой или хлопковой ватой, активным углем. Длительность реализации фильтров 1—1,5 ч при температуре 120—126 °С. После стерилизации их сушат в потоке сухого воздуха в течение 2—3 ч. Фильтрующий материал в индивидуальных фильтрах меняют через 1—2 мес, в общих — через 6—8 мес. Рис. 12.2. Схема очистки и стерилизации воздуха: 1 — ресивер; 2 — охладитель; 3 — отделитель масла и воды; 4 — пылевые фильтры; 5 — компрессор; 6 — турбокомпрессор; 7 — индивидуальный фильтр; 8 — общий фильтр Задерживающая способность фильтра %, 100 1 2 1 ? ? = ? N N N где N 1 — количество микроорганизмов в поступающем потоке атмосферного воздуха; N 2 — то же при выходе из фильтра. 281 Задерживающая способность фильтра ? должна быть больше 99,99%. В качестве фильтрующего материала могут быть использованы и специально изготовленные пластинки, например поливиниловые, толщиной 1—2 мм с порами определенного размера. В обслуживании пластинчатые фильтры проще, чем фильтры со стекловолокном. Системы контроля и управления Чтобы процесс ферментации сделать управляемым, оператор должен постоянно получать информацию о ходе развития биологического агента и динамики среды культивирования. Основные показатели, характеризующие ферментационный процесс, следующие: Физические показатели: температура; давление; вводимая мощность; частота вращения мешалки; пенообразование; скорость потока газа (воздуха); скорость потока среды; вязкость; турбу- лентность. Химические показатели: рН среды; окислительно-восстанови- тельный потенциал; содержание растворимого О 2 и СО 2 ; содер- жание О 2 и СО 2 в газе; содержание углерода; содержание предшест- венника: азота, фосфора; Mg 2+ , K + ,Ca 2+ , Na + , Fe 2+ , SO 4 2– и др. Важнейшим показателем процесса ферментации являются содержание биомассы, субстрата, продукта и отсутствие зара- женности посторонней микрофлорой. Физическое состояние продуцента характеризует удельная скорость роста, его морфологическое состояние (величина клеток, количество делящихся клеток), а также ряд биохимических показателей (содержание РНК, ДНК, NАД, NAДН, АТР, АМР, активность ключевых ферментов). Большинство химических показателей определяют в периоди- чески отобранной пробе, физические показатели — непрерывно при помощи вмонтированных в ферментатор датчиков. Для биотехнологических процессов существенное значение имеет не только температура и величина рН, а также содержание растворенного кислорода. Для определения рН и растворенного кислорода применяют стерилизуемые электроды, вмонтированные непосредственно в ферментатор. Для определения растворенного кислорода чаще всего применяют амперметрические серебряно-свинцовые или се- ребряно-золотые электроды. Существенное влияние на ход процесса ферментации оказывает степень пенообразования субстрата. Для сильно- пенящихся субстратов применяют автоматизированные системы 282 пеногашения, включающие как химические, так и механические средства (рис. 12.3). Современный биотехнологический процесс немыслим без применения ЭВМ для управ- ления процессом ферментации: поддержание оптимальной величины рН, температуры, пенообразования, частоты вращения мешалки, количества растворимого кислорода, ско- рости подачи субстрата и пр. (рис. 12.4). Рис. 12.4. Система управления процессом ферментации при помощи ЭВМ Рис. 12.3. Система регулирования пеногашения: 1 — линия противодавления; 2 — емкость с маслом; 3 — мерная стеклянная трубка; 4 — регулятор с реле времени; 5 — детектор; 6 — проходной изолятор; 7 — сток; 8 — гуммированный электрод; 9 — чувст- вительный наконечник; 10 — вал мешалки; 11 — пено- гаситель; 12 — отражатель; 13 — крышка ферментатора; 14 — фланцевое соединение; 15 — смотровое стекло; 16 — сужающийся наконечник; 17 — проотборник; 18 — соленоидный клапан 12.3.3. Глубинный аэробный периодический процесс Этот относительно современный метод обладает многими преимуществами по сравнению с более ранними методами поверхностного культивирования. Применение глубинного метода 283 позволяет повысить эффективность использования производствен- ных площадей, увеличить масштабы производства, механизиро- вать трудоемкие работы и почти полностью автоматизировать технологический процесс получения биопродукта. Кроме того, выход продукта выше, а опасность заражения невелика. Хотя технологии поверхностного способа культивирования более экономичны, поскольку при его применении себестоимость продукта и расход электроэнергии значительно ниже. Большинство промышленных ферментаций осуществляют периодическим способом. При глубинном способе культивирова- ния размножение посевного материала обычно идет в две стадии: в цехе чистой культуры и в отделении инокуляции. Количество питательной среды в аппарате не должно превышать 60% общего объема. Если культуру в инокулятор вносят из колб, то количество посевного материала составляет примерно 0,1% объема среды. Такое небольшое количество посевного материала требует длительного периода инокуляции (2—4 сут). Для посевных ферментаторов используют 10—12% инокулята от общего объема среды, поэтому за продолжительностью приготовления посевного материала необходимо наблюдать, чтобы в аппарате был оптимальный режим культивирования. Три раза в сушке собирают образцы для микробиологического и биохимического анализов. Посевной материал для основной ферментации готовят в количестве 5—20% объема используемой питательной среды. 12.3.4. Глубинный непрерывный процесс Процесс может быть гомогенно или гетерогенно непрерывным. При гомогенно непрерывном процессе в аппарате, где идет интенсивное перемешивание, все параметры постоянны во времени. При гетерогенно непрерывном процессе несколько ферментаторов соединены вместе. Питательная среда поступает в первый аппарат, готовая культуральная жидкость вытекает из последнего. Культивирование микроорганизмов в протоке через систему трубок также идет по принципу гетерогенно непрерывного процесса. В этом случае имеет место непрерывный поток пита- тельной среды, но клетки не обеспечены постоянными условиями роста (сколько аппаратов, столько и условий культивирования). При непрерывном культивировании микроорганизмов отрегулиро- вать скорости притока питательной среды и вытекания культу- ральной жидкости, чтобы предотвратить вымывание культуры из системы, т. е. обеспечить постоянную концентрацию клеток. В стерильных условиях непрерывный проточный метод обеспечи- вает сохранение культуры в физиологически активном состоянии длительного времени. Непрерывный процесс можно использовать в том случае, если культура при длительном выращивании не теряет способности к 284 синтезу (мутации, реверсии). При разработке метода непрерывного культивирования микроорганизмов необходимо установить оптимальный состав среды, скорость протока, температуры, рН, аэрацию и пр. 12.3.5. Твердофазная ферментация Культивирование на поверхности твердой среды обычно осуществляют в увлажненной твердой, сыпучей или пастообразной среде, влажность которой составляет 30—80%. Если субстрат сыпучий, то его отдельные твердые частицы хорошо контактируют с воздухом. Рост микроорганизмов в этом случае происходит главным образом на поверхности твердых частиц, а также в порах, заполненных либо водой, либо воздухом. Обеспечение микроорга- низмов кислородом затрудняется с увлажнением слоя субстрата. Перемешивание слоя не допускается, если культивируются мицел- ляльные микроорганизмы. Другая проблема при твердофазной ферментации — отвод теплоты и поддержание постоянной темпера- туры во всей ферментационной среде. Метод твердофазной ферментации широко используют в Японии для производства грибных ферментов лимонной кислоты. В Германии, Франции, Великобритании от него отказались, так как он требует слишком больших площадей для эксплуатации. Кроме того, трудно предотвратить заражение микроорганизмами, а выход продукта биосинтеза невелик. Например, в производстве грибной амилазы главным компо- нентом питательной среды является смесь пшеничных отрубей и крахмала, иногда к ним добавляют белковые отходы, солодовые ростки, получаемые в производстве пива, соевую муку и т. п. Для выращивания производственной культуры компоненты питательной среды смешивают, распределяют тонким слоем в кюветах, увлажняют мицелляльным раствором, содержащим небольшое количество хлористоводородной кислоты, стерилизуют при давлении 0,15 МПа в течение одного часа, или острым паром в течение 30 мин, а затем охлаждают. В охлажденную до 35 °С питательную среду вносят суспензию спор Aspergillus oryzae. Стерильную, засеянную спорами Aspergillus oryzae питательную среду, в кюветах помещают в камеры для выращивания, в которые подают очищенный воздух, с определенной температурой и относительной влажностью. Через 30—36 ч инкубации для культуры гриба Aspergillus oryzae в этих камерах при температуре 30 °С развивается масса спорообразующего мицелия. Массу снимают, высушивают и измельчают для получения сырой амилазы или экстрагируют для получения очищенной амилазы. Схема выращивания культуры Aspergillus oryzae представлена на рис. 12.5. 285 Технологический процесс поверхностного культивирования данной культуры состоит из семи стадий: 1. Введение (получение и поддержание роста) чистой культуры в лабораторных условиях. 2. Приготовление посевного материала в отделении чистой культуры. 3. Подготовка питательной среды. 4. Выращивание производственной культуры. 5. Дробление готовой культуры. 6. Сушка. 7. Расфасовка и упаковка готовой продукции. Рис. 12.5. Схема поверхностного культивирования плесневого гриба Aspergillus oryzae: 1 — транспортер для подачи отрубей и крахмала; 2 — бункер для отрубей и крахмала; 3 — стерилизатор питательной среды; 4 — автоклав; 5 — шкаф для стерилизации кювет; 6 — препаративный стол; 7 — камеры стерилизации и выращивания посевной культуры; 8 — реактор для приготовления посевной культуры; 9 — камера стерилизации посевных кювет; 10 — загрузочный стол производственной культуры; 11 — этажерки с кюветами; 12 — камера выращивания производственной культуры; 13 — этажерка с готовой культурой; 14 — устройство для измельчения; 15 — сушилка; 16 — фильтр; 17 — вентилятор Описанная схема поверхностного культивирования требует значительных затрат ручного труда. Более современный вариант, применяемый для крупнотоннажного производства поверхностных культур плесневых грибов, предусматривает использование механизированных растительных установок с разъемными кассетами и автоматической разгрузкой. При этом создается возможность выращивать в сутки 1,2 т культуры гриба. Такая автоматизированная система конструкции ВНИИФС (рис. 12.6) существует на Вышневолоцком заводе ферментных препаратов, осуществляющем выпуск лекарственного ферментного препарата ораза из поверхностной культуры гриба Aspergillus oryzae. Подготовленная, простерилизованная и засеянная культурой гриба Aspergillus orizae питательная среда загружается в 286 растительные камеры и по рельсовому пути подается в растительное отделение, через диффузоры к камерам подается кондиционированный воздух. Аэрирование культуры осуществля- ется через вертикальные каналы, имеющиеся между кюветами и через отверстия в стенках кювет. Система аэрация рассчитана на рециркуляцию и очистку воздушного потока, подсос свежего воздуха и поддержание условий, предотвращающих подсыхание выращиваемой культуры. Процесс культивирования проводят в течение 42—46 ч. После этого производят разгрузку растительных камер на вибрационном столе, отделив предварительно вертикальную стенку кюветы. Рис. 12.6. Линия для выращивания культуры плесневого гриба Aspergillus oryzaе в кюветах с вертикальным слоем: |