технология лек 2. Учебник соответствует учебной программе и предназначен для студентов фармацевтических высших учебных заведений и факультетов
 Скачать 5.32 Mb.
|
|
Выпускают в герметически укупоренных флаконах по 10, 25 и 50 мг. Хранят в сухом, защищенном от света месте, при температуре не выше 15 °С Химотрипсин кристаллический (Chymotrypsinum crystallisatum). Представляет собой блестящие чешуйки или порошок белого цве- та, легко растворимый в воде, значение рН 0,2% водного раствора составляет 4,5—6,5. Водные растворы быстро инактивируются. Применяют как рибонуклеазу. Выпускают в герметически укупоренных флаконах, содержа- щих по 5 и 10 мг кристаллического химотрипсина. Хранят в прохладном (не выше 10 °С), защищенном от света месте. Трипсин кристаллический (Тrypsinum crystallisatum). Представляет собой пористую массу или порошок белого цвета, легкорастворимый в воде, значение рН 0,2% водного раствора составляет 3,0—3,5. В нейтральных и щелочных растворах препарат быстро разрушается. Применяют как химотрипсин. Выпускают в герметически укупоренных флаконах или ампулах по 5 и 10 мг. 266 Хранят в сухом, защищенном от света месте, при температуре не выше 10 °С. Пантрипин (Pantrypinum). Ингибитор протеаз (трипсина, химотрипсина и др.), представляет собой лиофилизированный порошок желтоватого цвета, хорошо растворимый в воде. Стандартизуют биологическим путем по способности понижать активность трипсина. В 1 г препарата содержится не менее 650 ЕД. Применяют при панкреатитах, вводят внутривенно. Выпускают в герметически укупоренных флаконах по 6, 12, 15,20 и 30 ЕД. Хранят в сухом, защищенном от света месте, при температуре не выше 20 °С. 12.1.4. Препараты ферментов из семенников Ронидаза (Ronidasum). Препарат, содержащий фермент гиалуронидазу, получают из семенников половозрелого крупного рогатого скота. Семенники обрабатывают 2% раствором фенола в течение 5— 15 мин, тщательно промывают водой, снимают оболочку и измельчают на мельнице-волчке. Измельченные семенники заливают физиологическим раствором, содержащим 0,25% хлороформа в соотношении 1,0:0,5, и экстрагируют ронидазу при перемешивании в течение 35—40 мин. Экстракт отделяют фильтрованием, осадок отжимают под гидравлическим прессом, отжатую жидкость присоединяют к экстракту, разливают по кассетам из нержавеющей стали, сушат методом сублимации. Высушенный препарат измельчают в шаровой мельнице, герметически укупоривают. Применяют наружно при лечении рубцов (ожоговых, после- операционных), контрактур суставов. Хранят в защищенном от света месте, при комнатной температуре. Лидаза (Lydasum). Препарат гиалуронидазного действия. Для получения лидазы измельченные семенники крупного рогатого скота обрабатывают 0,1 н раствором кислоты уксусной в соотношении 1:2 при температуре 10 °С и перемешивании в течение 4 ч. Надосадочную жидкость отделяют и ацетоном осаждают фермент гиалуронидазу. Осадок растворяют в воде и процесс осаждения ацетоном повторяют три раза. Освобожденный от ацетона осадок очищенной гиалуронидазы растворяют в воде, фильтруют через стерилизующие фильтры, разливают во флаконы и высушивают методом сублимации. Основными показаниями к применению лидазы являются контрактуры суставов, рубцы после ожогов и операций, анкилози- рующий спондилоартрит, гематомы и др. Раствор вводят под кожу. Выпускают во флаконах, содержащих по 64 УЕ (условных единиц) стерильного сухого вещества. Хранят в сухом, темном месте при температуре не выше 15 °С. 267 Таблица 12.1 Лекарственные ферментные препараты из сырья животного происхождения, выпускаемые предприятиями медицинской и микробиологической промышленности стран СНГ и ближнего зарубежья 268 269 270 271 12.2. Производство ферментов из сырья растительного происхождения 12.2.1. Источники получения ферментов Для получения ферментов используется также и сырье расти- тельного происхождения. В ряде случаев преимущества растений существенны: — заготовка их технологически более проста; — высушенный материал можно компактно упаковывать и хранить продолжительное время в условиях, не требующих специального технологического оборудования. Для выделения ферментов часто используют семена растений, которые богаты белками, могут сохранять ферментативную активность на протяжении ряда лет. К недостаткам растительного сырья можно отнести сезонность его заготовки и неодинаковое содержание ферментов в различных частях растения. Для производства протеолитических ферментов в промышленных масштабах используют следующие источники сырья (табл. 12.2). Фармацевтические предприятия нашего государства раститель- ные протеиназы не производят, так как большинство растений, их продуцирующие, в основном произрастают в тропических странах. В лаборатории ферментных препаратов ГНЦЛС, являющейся единственной по профилю своей деятельности в странах СНГ, впервые получены препараты из сырья растительного происхожде- ния медицинского назначения различной специфики действия: — липаза из семян чернушки дамасской (Nigella damascena L); — уреаза из столовых арбузов (Citrullus vulgaris L); — ?-Амилаза из проросших семян пшеницы (Triticum aestivum L); — ?-Галактозидаза из семян гороха (Pisum sativum L); — ингибитор липазы из семян рапса (Brassica napus L); 272 — ингибитор трипсина из семян люцерны (Medicago sativa L); — ингибитор амилазы из пшеницы (Triticum aestivum L); — ?-Фруктофуранидаза из семян овса (Avena sativa L). Таблица 12.2 Источники сырья для производства протеолитических ферментов в промышленных масштабах Для производства ферментов могут быть также использованы продукты пчеловодства. Известно, что пчелиный мед имеет ярко выраженную активность фермента амилазы (диастазы). 12.2.2. Технология ферментных препаратов Технология ферментных препаратов характеризуется резко выраженным индивидуальным подходом, обусловленным характером исходного лекарственного растительного сырья, свойствами ферментов и их сопутствующих веществ. Обычно ферменты в растительном сырье находятся в виде сложных комплексов и для того, чтобы их получить в кристалли- ческом состоянии и биологически активными, в первую очередь необходимо подобрать такие методы выделения, при которых не терялась бы их специфическая активность. Общие принципы технологических приемов, включая подго- товку сырья и оборудования и заканчивая получением очищенного препарата, не являются унифицированными, а формируются и используются в зависимости от задач технологии, типа и инди- видуальных особенностей фермента. Перед экстракцией фермента исходное сырье подвергают из- мельчению с целью разрушения клеток. Для этого применяют про- мышленные мельницы (вальцы, дезинтеграторы, дисмембраторы). В качестве экстрагента фермента используют воду, водные раст- воры органических растворителей (спиртов, ацетона, эфира, диоксана), разбавленные растворы кислот и щелочей, растворы нейтральных солей, а также буферные растворы. Экстрагент подбирается индиви- дуально для каждого ферментсодержащего растительного сырья. Гид- ролитические ферменты, например амилазы и протеиназы, наиболее полно экстрагируются из растительного сырья с помощью воды. 273 Экстракт, полученный в результате избирательной экстракции, наряду с ферментами содержит сопутствующие белки, липиды, пигменты, неорганические ионы, полисахариды, а также другие вещества неферментной природы. Удаление сопутствующих компонентов и достижение высокой степени очистки ферментного белка требует сочетания различных методов выделения. На первой стадии очистки экстракта может быть использована кислотная денатурация, позволяющая за счет смещения величины рН среды перевести в нерастворимое состояние белки. Иногда, с осторожнос- тью, проводят их температурную денатурацию путем кратковремен- ного прогрева экстракта при температурах, не вызывающих денатурацию выделяемого фермента. Указанные методы могут сочетаться. Применяют также осаждение неактивных примесей солями тяжелых металлов. С целью очистки экстракта от компонен- тов, отличающихся размерами молекул, применяют диализ через мембраны с определенной величиной пор (целлофан, коллодий, пергамент). Используют также стандартные мембраны из целлюло- зы и ее производных. Электродиализом пользуются редко из-за опас- ности местного нагрева и возможности нежелательного сдвига рН. После предварительной очистки, а иногда и без нее, экстракт подвергают фракционированию органическими растворителями, нейтральными солями, сорбции-десорбции на разнообразных адсорбирующих материалах, очистке с помощью ионообменных смол, гель-фильтрации и т. д. Фракционная очистка. Для фракционной очистки с применением органических растворителей используют спирты (этанол, метанол, изопропанол, ацетон, реже диоксан, диэтилкарби- нол, ароматические и гетероциклические амины). Для уменьшения денатурирующего воздействия осаждение ведут при пониженных температурах. При фракционировании ферментов под действием солей часто используют сульфат аммония, реже применяют сульфаты и ацетаты натрия и магния. В отличие от органических растворителей, которые сравнительно легко удаляются центрифугированием, солевые осадители из полученного материала можно удалить диализом, занимающим продолжительное время. Ферменты обладают способностью адсорбироваться на активи- рованном угле, крахмале и его производных, гидроокиси цинка, магния, алюминия, меди, на бетонитах, каолине, геле трифосфата кальция, целлюлозе и ее производных и других материалах. Ионообменная хроматография. Ионообменная хроматография является более тонким и избирательным методом очистки ферментов, в основе которой лежит реакция обмена между ионитами и белками, находящимися в растворе. В качестве ионитов используют катиониты, содержащие кислые радикалы: — карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ); — фосфоцеллюлозу (ФЦ); 274 — сульфометилцеллюлозу (СМЦ); — сульфоэтилцеллюлозу (СЭЦ). Применение находят также иониты, имеющие в своем составе основную группу: — аминоэтилцеллюлоза (АЭЦ); — диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭЦ); — этилцеллюлоза (ЭЦ); — триэтиламиноцеллюлоза (ТЭАЦ); — гуанидиноэтилцеллюлоза (ГЭЦ). Разделение и концентрирование. Для разделения и концентрирования ферментных белков часто используют метод гель-фильтрации с применением сефадексов — полимерных цепей полисахарида декстрана, соединенных через определенные промежутки поперечными связями и образующих своеобразные молекулярные сита, способные разделять белки в соответствии с их молекулярной массой. Для концентрирования ферментного белка часто используют ультрафильтрацию. Метод заключается в разделении высокомоле- кулярных и низкомолекулярных соединений на селективных мембранах, способных пропускать низкомолекулярные соединения под действием давления. Ультрафильтрация в 5—10 раз эффектив- нее очистки с использованием фракционирования этанолом. Кристаллизация ферментов. Кристаллизация ферментов явля- ется сложным методом их очистки и применяется для субстанций, прошедших концентрирование и многоступенчатую очистку. Кристаллическое состояние не является критерием гомогенности ферментного белка, а требует дополнительного подтверждения другими методами (диск-электрофорезом в полиакриламидном геле, ультрацентрифугированием и др.). Методы и техника кристаллизации подбираются индивидуально для каждого фермента. 12.2.3. Частная технология ферментных препаратов растительного происхождения Технологический процесс промышленного производства ферментов состоит в основном из следующих стадий: — экстракция лекарственного растительного сырья; — выделение и очистка фермента; — сушка; — стандартизация; — получение лекарственных форм. Уреазу (Ureasum) получают из семян столового арбуза (Citrullus vulgaris L). Технология препарата разработана С. И. Дех- тяревым (ГНЦЛС). Предварительно измельченные семена столового арбуза с помощью валковой дробилки экстрагируют в реакторе при 275 периодическом перемешивании смесью раствора солей натрия хлорида и натрия карбоната (рН 7,9—8,1) в течение двух часов при температуре 22±2 °С. По истечении указанного времени содержимое реактора переносят на конус вращающегося барабана центрифуги. В качестве фильтрующего материала используют бязь, которой покрывают барабан в два слоя. Частота вращения ротора центрифуги 3000 об/мин. Мутный экстракт из приемника центрифуги переносят порциями в стаканы центрифуги. Повторное центрифугирование проводят в течение 30 мин. Экстракт аккуратно сливают в емкость и помещают в холодильный шкаф для охлаждения до +10 °С. Выделение уреазы из экстракта осуществляют в реакторе путем обработки его насыщенным раствором аммония сульфата в буферном растворе (рН 7,0) при периодическом перемешивании. Образовавшуюся суспензию осадка белка отстаивают в течение 6 ч. По истечении указанного времени суспензию из реактора переносят порциями в стаканы центрифуги и центрифугируют в течение 20 мин. Осадок сопутствующего белка отбрасывают, а надосадочную жидкость вновь подают в реактор. Проводят второе высаливание, добавляя в реактор 1/2 объема насыщенного раствора аммония сульфата от первоначального количества. Суспензию в реакторе оставляют на 12 ч. По истечении этого времени осадок белка, состоящий из активного фермента, отделяют центрифугированием в течение 30 мин при частоте вращения ротора 3000 об/мин. Полученный осадок растворяют в очищенной воде и охлаждают в холодильном шкафу до температуры +10 °С. Таблица 12.3 Лекарственные ферментные препараты из сырья растительного происхождения, выпускаемые предприятиями медицинской и микробиологической промышленности стран СНГ и ближнего зарубежья 276 Затем проводят фракционное осаждение фермента этанолом, добавляя его в раствор (1:2). Образовавшуюся суспензию фермента переносят порциями в стаканы центрифуги и центрифугируют в течение 15 мин. Осадок активного фермента в виде мазеобразной массы остается на дне стаканов. Осадок растворяют в очищенной воде и сушат методом сублимации с оптимальным режимом температур от –40 °С до +30 °С. Длительность замораживания— высушивания 2—3 ч, досушивания — 8—10 ч. После окончания сушки порошок фасуют в склянки оранжевого стекла объемом 0,2 л. Выход препарата 0,3%. Активность не менее 1500 ЕД Самнера в 1 г препарата или 100—200 ФЕ в 1 мг белка. Уреаза катализирует реакцию гидролиза мочевины на углекислый газ и аммиак. Применяют микрокапсулированную уреазу для очистки крови от мочевины и для проведения гемодиализа в аппарате «искусственная почка». 12.3. Производство фармацевтических препаратов на основе микробиологического синтеза•. Ферменты Основное направление микробиологического синтеза — использование клеток микроорганизмов для производства ферментов, антибиотиков, витаминов, алкалоидов, аминокислот, органических кислот, полисахаридов и др. Промышленное производство ферментных препаратов осуществляют в основном из культур микроорганизмов: плесневых грибов, бактерий, дрожжей, актиномицетов. В последние годы для промышленного производства ферментов используют в основном мицелляльные грибы родов Aspersillus, Penicillinum и Rhizopus, а также организмы-продуценты бактерий рода Bacillus, Escherihia coli и др. Они способны продуцировать большое число разнообразных по своему составу ферментов, что обусловлено специфическими способностями их ферментативного аппарата, высокой способностью к размножению и адаптации в различных условиях окружающей среды. Используя культуры микроорганизмов, можно гораздо быстрее получить большое количество биологического материала (биомассы) для последующего выделения ферментов. Для питания микробных клеток могут быть использованы разнообразные продукты и отходы пищевой промышленности (пшеничные и рисовые отруби, картофельная мезга, пшеничная шелуха, подсолнечная лузга и т. п.). К недостаткам микробного сырья следует отнести большой объем работы, предшествующий препаративному выделению ферментов (отбор, выращивание и ведение штаммов-продуцентов, подготовка питательных сред, соблюдение условий стерилизации, выращивания, сушки и т. д.). 277 12.3.1. Сырье для микробиологической промышленности Для приготовления питательных сред микробиологической промышленности используют сырье минеральное, животного и растительного происхождения, а также синтезированное хими- ческим путем. Вещества, входящие в состав питательной среды, обеспечивающие развитие культуры и биосинтез определяемых продуктов, не должны содержать вредных примесей. При выборе сырья необходимо учитывать его себестоимость, так как в микробиологическом синтезе важное значение имеет стоимость исходных веществ и материалов. Источники углерода. Наиболее доступны для микроорганизмов углеводы, поэтому в лабораториях, а также во многих промыш- ленных биотехнологических процессах (в производстве ферментов, антибиотиков, аминокислот и др.), используют глюкозу, сахарозу, лактозу и другие углеводы. Однако перечисленные углеводы являются ценным пищевым сырьем и достаточно дороги. В этой связи в большинстве крупнотоннажных микробиологических про- изводств чистые углеводы заменяют более доступными по стоимости продуктами: отходами крахмало-паточного производ- ства (меласса, гидрол), гидролизатами торфа и растительных отходов, побочными продуктами молочной промышленности и др. Меласса — отход производства сахара из сахарной свеклы, богатый углеводами и другими ценными органическими и минеральными веществами. Меласса содержит 70—80% сухого вещества, в т. ч. 45—60% сахарозы, 0,25—2% инвертного сахара, 0,2—3% раффинозы, 1,2—3,4% азотистых веществ. В ее состав входят аминокислоты, органические кислоты и соли, минеральные вещества, некоторые витамины. Меласса широко используется в производстве аминокислот, ферментов, дрожжей. Гидрол — отход производства глюкозы из крахмала. Содержа- ние глюкозы составляет до 80% суммы сахаров, а остальные 20% — в основном продукты неполного гидролиза крахмала. Наряду с сахарами гидрол содержит органические кислоты, минеральные элементы (фосфор, магний, железо, натрий). Гидрол используют как дешевый заменитель в химико-фармацевтических производствах. |