технология лек 2. Учебник соответствует учебной программе и предназначен для студентов фармацевтических высших учебных заведений и факультетов
 Скачать 5.32 Mb.
|
|
а — схема линии; 1 — поворотный круг; 2 — вибрационный стол для загрузки кювет питательной средой, засеянной культурой гриба; 3 — стерилизатор камер; 4 — устройство-толкатель; 5 – устройство для выращивания с кондиционерами; 6 — стол для разгрузки; 7 — коридор для выращивания с кондиционерами; 8 — транспортер; 9 — растительная камера; 10 — рельсовый путь; б — вид растительной камеры; в — кювета для выращивания культуры Освобожденная от культуры камера перемещается по рельсовому пути в моечное отделение, затем в стерилизатор и на вибрационный стол для новой загрузки. Использование механизированной линии по выращиванию культуры гриба Aspergillus orizae дает возможность поддерживать высокий уровень стерильности, что очень важно для целенаправ- ленного синтеза амилазы. В случае необходимости можно опера- 287 тивно локализовать и изолировать инфицированный материал без- опасности заражения сопутствующей микрофлорой других камер. Выращенную поверхностную культуру гриба передают на стадию экстракции, минуя операцию сушки, измельчения и фасовки, имеющих место при серийном производстве «амилорозина — П». 12.3.6. Глубинная ферментация Промышленный способ глубинной ферментации — сложный многоступенчатый процесс, включающий ряд технологических стадий. Ниже представлены из них основные. 12.3.6.1. Подготовка среды для культивирования, продуцента фермента и посевного материала (1-я стадия) Приготовление и стерилизация питательной среды. Питательные среды готовят в специальных реакторах с мешалками. Реакторы, ферментаторы, трубопроводы, арматуру чаще всего изготовливают из нержавеющей стали, особое внимание обращают на удобства для стерилизации питательных сред, которые используют для приготовления чистой культуры и в цехах основной ферментации. Среду готовят в сырьевом или рецептур- ном цехе по периодическому или непрерывному методу, в отдельных случаях приготовление и стерилизацию ее осуществля- ют в ферментаторе. На современных заводах применяют непрерывный метод приготовления. Для этого используют два резервуара: в один вводят исходные вещества, а из другого жидкость идет в смеситель непрерывного действия. А затем при помощи насоса подается в колонну для стерилизации, наряду с которой используются паровые инжекторы, или теплообменник и труба в трубе. При работе с вертикально установленной стерилизационной колонной питательную среду подводят снизу в пространство между трубами. В верхнюю часть колонны подают пар под давлением 0,3—0,4 МПа (3—4 кгс/см 2 ). Скорость потока среды выбирают такую, чтобы каждая частица питательной среды находилась в зоне прогрева заданное время. Если для стерилизации сред приме- няют относительно высокую температуру (135 °С и выше) и объем выдерживания не превышает несколько десятков литров, вместо резервуаров используют систему вертикально закрепленных труб. Теплообменники пластинчатого типа используют для нагрева и охлаждения среды, процесс стерилизации в них легко автоматизируется. Выбор аппаратуры, технологии приготовления и стерилизации питательной среды зависит от количества и вида компонентов, которые предварительно растворяют в подогретой или горячей воде. Если по степени растворимости и стерилизации это 288 возможно, то все компоненты растворяют в одном растворе и в определенной последовательности. В противном случае их растворяют по группам исходных веществ, исходя из их физико- химических свойств, стерилизуют и соединяют в смесителе. Если среду стерилизуют в небольших количествах, весь объем среды доводят до температуры 120 °С непосредственно в ферментаторе или специальных котлах-стерилизаторах, выдерживают 30— 60 мин (в зависимости от объема среды и ее состава) при 120 °С, а затем охлаждают до 27—30 °С. 12.3.6.2. Приготовление посевного материала Штаммы-продуценты ферментов предприятия микробиологи- ческой или химико-фармацевтической промышленности получают из академий и университетов Украины и стран СНГ в пробирках на косом агаре или в ампулах. Каждая культура имеет паспорт с подробным описанием морфологии, характеристики среды для культивирования и хранения. Перед началом технологического процесса культуру размножают в стерильных условиях на оптимальном составе среды и соблюдении режима выращивания (рН, температура, длитель- ность). С поверхности косого агара ее стерильно переносят в колбу объемом 100—200 мл и инкубируют в термостате. Длительность каждой стадии выращивания — 24 ч. Дальнейшее размножение посевного материала обычно прово- дят в два этапа: в цехе чистой культуры и в отделе инокуляции. Аппараты первого этапа выращивания часто называют инокуляторами, второго — посевными ферментаторами. 12.3.6.3. Основная ферментация. Развитие организма-продуцента фермента в ферментаторах (2-я стадия) Для стерильной основной ферментации широко используют аппараты объемом до 100 м 3 . Перед заполнением основного ферментатора средой его и систему трубопроводов моют водой, стерилизуют горячим паром под давлением, после чего заполняют охлажденной питательной средой. Посевной материал для основной ферментации готовят в количестве 5—20% объема используемой среды. Процесс развития микроорганизма в ферментаторах проходит при строгом контроле всех стадий, очень точном выполнении регламента, условий развития организма-продуцента фермента. Большое внимание уделяется поддержанию заданной температуры культивирования, активной кислотности, среды рН, степени аэрации и скорости работы мешалки. Учитывается потребление организмом основных питательных компонентов (источников 289 углерода, азота и других видов сырья), внимательно контролируется образование фермента. Особое внимание на развитие продуцента в ферментаторах обращают на процесс пеногашения. При продувании воздуха через культуру микроорганизма часто происходит обильное образование пены, которая существенно нарушает протекание всего процесса развития продуцента фермента в ферментаторе. Основная причина появления большого количества пены — наличие белковых веществ в среде и ее высокая вязкость, обусловленная накоплением биомассы. Для борьбы с пеной в ферментаторах при ферментообразовании используют различные ПАВ: растительные масла (соевое, подсолнечное), животный жир (лярд, кашалотовый жир), а иногда минеральные масла (вазелиновое, парафиновое), спирты и высшие жирные кислоты. Нередко в качестве пеногасителей используют специально синтезированные вещества (силиконы, диазобутал- карбамил и другие соединения). Многие вещества (масла, жиры, спирты и др.) — пеногасители, потребляются продуцентами ферментов как дополнительные источники углеродного питания. При этом часто наблюдается повышение выхода фермента. Однако внесение пеногасителя снижает скорость растворения кислородом, что, в свою очередь, может отрицательно сказываться на развитии микроорганизма и его биосинтетической активности. Иногда используются механические способы пеногашения (отсасывания пены через специальные трубы, разрушение пузырьков пены сильными струями жидкости, пара или газа и аэродинамические). Ферментацию прекращают, когда в среде накапливается мак- симальное количество полезного продукта. По окончании процесса культуральную жидкость охлаждают до 5—10 °С для обеспечения стабильности продукта и предотвращения роста других микроорганизмов и перекачивают в резервуары, из которых она постепенно подается на дальнейшую переработку (рис. 12.7). 12.3.6.4. Предварительная обработка культуральной жидкости (3-я стадия) В состав культуральной жидкости входят остатки использован- ной питательной среды, синтезированные метаболиты и клеточная масса продуцента. Для выделения продуктов биосинтеза обычно используют сепа- раторы, осадительные центрифуги, фильтр-прессы, вакуум-бара- банные фильтры, ротационно-вакуумные фильтры, отстойники. Выбор оборудования зависит от масштаба ферментации, типа клеток, свойств культуральной жидкости, места локализации ферментов (в клетке, клеточной стенке, культуральной жидкости). 290 Стадия предварительной обработки культуральной жидкости в некоторых технологиях производства ферментов включает операцию разрушения клеток и клеточных стенок с помощью гомогенизаторов высокого давления, ультразвука, химической обработкой (электролиты, полиэлектролиты, щелочи) и ферментационные методы разрушения клеточных стенок. Биомассу грибов обычно собирают прямым центрифугирова- нием культуральной жидкости или сепарированием. Бактериальные клетки требуют предварительной обработки культуральной жидкости путем флоккуляции в более крупные коагулирующие скопления для увеличения эффективности их разделения в центрифуге. Рис. 12.7. Схема промышленного получения ферментов глубинным способом 291 При нейтральной реакции среды бактериальные клетки в культуральной жидкости имеют отрицательный заряд, обусловлен- ный фосфатными или карбоксильными группами клеточной стен- ки. Флоккулирующие агенты (аммония сульфат, кальция хлорид) нейтрализуют заряд и способствуют образованию больших агрега- тов клеток, которые легко оседают из культуральной жидкости. После предварительной обработки культуральную жидкость центрифугируют или декантируют. Альтернативой центрифугированию служит фильтрование. Для фильтрации небольших объемов культуральной жидкости обычно используют нутч-, друк-фильтры, вакуум-барабанные фильтры, ротационно-вакуумные фильтры. Пресс-фильтры применяют для обработки больших объемов жидкости. 12.3.6.5. Выделение и очистка фермента (4-я стадия) Стадия выделения и химической очистки включает ряд процес- сов: от обработки нативного раствора до сушки готового продукта. Обычно после центрифугирования биомассу получают в виде густой жидкости или пасты с влажностью 70—85%. Клеточную массу промывают, фильтруют, сушат, гидролизуют, экстрагируют из нее нужный фермент. Если ферменты находятся в растворе, биомассу используют после отделения как побочный продукт, а нужное вещество выделяют из раствора различными методами: осаждением, фильтрацией, экстракцией и др. Для получения высокоочищенного фермента применяют высаливание, диализ, электродиализ, мембранную фильтрацию, гель-фильтрацию, ионообменную и аффинную хромотографию, различные методы сорбции. Концентрирование растворов, содержащих ферменты, осуществляется лиофилизацией, вакуум-выпариванием, вымо- раживанием. 12.3.6.6. Получение готовой продукции (5-я стадия) После выделения и химической очистки фермента его необходимо высушить — удалить из полученного препарата свободную и связанную воду. Поскольку ферменты в основном термолабильны, для их высушивания необходимо применять методы, не приводящие к потере биологической активности. На современном этапе промышленного получения ферментов используют различные методы обезвоживания препаратов. Широ- кое распространение получила лиофильная сушка ферментов, кото- рая проводится при сравнительно низких температурах (–10, –15 °С). При работе с большим количеством раствора, содержащим ферменты, проводят высушивание с применением распылительных 292 сушилок. Одной из важных операций химической очистки ферментов является кристаллизация. В зависимости от химического строения фермента и его физико-химических свойств применяют следующие методы кристаллизации: выпаривание растворителя (изотермический), охлаждение горячего раствора (изогидрический), одновременное охлаждение и выпаривание (комбинированный), добавление в раствор других веществ, снижающих растворимость (высаливание), вымораживание. После высушивания препарат, в случае нестойкости, необходимо смешивать со стабилизатором или с наполнителем (крахмал, декстрины, неорганические нейтральные соединения, тальк и др.). Таблица 12.4 Лекарственные ферментные препараты из культур микроорганизмов, выпускаемые предприятиями медицинской и микробиологической промышленности стран СНГ и ближнего зарубежья 293 Продолжение табл. 12.4 294 12.3.7. Иммобилизация и стабилизация ферментов Иммобилизация ферментов — это повышение их стабиль- ности. Как известно, в клетках ферменты находятся обычно не в «связанной» форме, т. е. прикреплены к определенным структу- рам и локализованы в органеллах. Поэтому ферменты характери- зуются нестабильностью при воздействии ряда физических и химических факторов и могут инактивироваться. Это имеет место и при получении ферментов микробиологическим путем, поэтому после достижения в ферментаторе максимальной активности ферментов, необходимо как можно быстрее организовать их выделение. Причиной снижения активности могут быть протеазы, которые выделяются в среду при автолизе клеток продуцента или в микроорганизмы, утилизирующие фермент. При использовании ферментных препаратов для катализа различных реакций свободные ферменты достаточно чувстви- тельны к температуре среды, рН, наличию различных веществ. Действие этих факторов может денатурировать белок. Кроме того, свободные ферменты могут быть использованы лишь однократно, стоимость их достаточно высока. Достижения молекулярной биологии способствовали детальному изучению строения многих ферментов. Был раскрыт аминокислотный состав ряда ферментных белков, их пространст- венная конфигурация, выявлены активные центры, значения различных функциональных групп в проявлении каталитической активности фермента. Это позволило создать теоретическую базу для производства ферментов пролонгированного действия или, как их называют, иммобилизованных, фиксированных, или Окончание табл. 12.4 295 связанных ферментных препаратов. Сущность иммобилизации ферментов — прикрепление их в активной форме к нерастворимой основе, заключение в гель или в полупроницаемую мембранную систему. Методы иммобилизации ферментов можно разделить на две группы: включение в гель микрокапсулы и связывание с носителем адсорбционной или ковалентной связью. Наиболее часто используемые методы иммобилизации показаны на рис. 12.8. Схемы б и е относятся к первому методу, остальные — ко второму. Рис. 12.8. Методы иммобилизации ферментов Допускается прикрепление ферментов только с помощью функциональных групп, не входящих в активный центр и не участвующих в образовании фермент-субстратного комплекса. Носитель фермента, или матрица, может иметь вид зернистого материала, волокнистой структуры, пластинчатой поверхности, пленок или тканей, полых волокон, трубочек, капсул и т. д. Имеет значение размер частиц носителя, важно, чтобы он имел большую поверхность, поэтому рекомендуется использовать небольшие час- тицы диаметром 0,1—0,2 мм. Носитель фермента может быть как природным (нативным) веществом, так и синтетическим поли- мером. Для иммобилизации широко применяют целлюлозу и ее производные — кислую карбоксиметилцеллюлозу и ацетилэтилцел- люлозу и др. В воде целлюлоза набухает и ее гидроксильные группы присоединяют участки молекул фермента. Из синтетических носи- телей можно назвать карбоксильные или сульфоксильные хлориды в виде полимерных ионообменных смол, диазотированный поли- аминостерин, нитратные сополимеры метакриловой кислоты и др. 296 Процесс иммобилизации ферментов можно продемонстриро- вать на примере связывания глюкоамилазы с носителем ацетил- этилцеллюлозы. Носитель сначала выдерживают сутки в очищенной воде для набухания. Затем при перемешивании к набухшей ацетилэтилцеллюлозе добавляют сначала натрий- ацетатный буфер (рН 5,53), затем — раствор очищенного фермента. После перемешивания вносят поперечно-сшивающий агент — глутаровый альдегид, который образует амидную связь между аминогруппой носителя и карбоксильной группой ферментного белка. Через несколько часов полученный препарат промывают последовательно натрий-ацетатным буфером и раствором натрия хлорида для удаления сорбированного на носителе белка. Иммобилизированный таким образом фермент хранят под слоем воды или буфера при температуре 3—5 °С. Ферменты можно прикреплять к поверхности носителя путем сорбции к ионитам; к катионам (содержащим активные кислотные группы) или к анионитам (содержащим преимущественно основные группы). В качестве сорбентов — носителей ферментов, часто используют гель гидроксида алюминия или фосфата кальция, диатомит, модифицированный крахмал, бетониты, кизельгур и др. Сорбцию ферментов осуществляют либо в колонках путем пропускания раствора фермента с определенной скоростью через слой ионита, либо в реакторах, в которых сорбент определенное время перемешивают с раствором фермента. Полученный продукт затем используют как иммобилизованный ферментный препарат. Адсорбция фермента на носителе не обеспечивает длительной стабилизации. Более длительную стабилизацию обеспечивает ионообменное связывание фермента, например, на модифициро- ванных ионообменных целлюлозах. Широкое распространение находят различные методы включения ферментов в гель. В процессе полимеризации геля молекулы фермента связываются на небольших расстояниях, и тогда фермент оказывается заключенным внутри ячеек геля. Размеры пор геля должны быть меньше размера молекул фермента, но они не должны препятствовать доступу субстрата к ферменту. Для иммобилизации фермента из целых клеток микроорганизмов широко используют полиакриламидный гель, альгенат кальция, крахмал и др. В настоящее время разработаны методы иммобилизации множества ферментов. Некоторые из них приведены ниже. Адсорбция, или ионный обмен: Каталаза Рибонуклеаза ?-Глюкозидаза Пепсин Трипсин Аспарагиназа 297 Включение в гель: Лактатдегидрогеназа Глюкооксидаза Пероксидаза Гексакиназа Рибонуклеаза Холинестераза Щелочная фосфатаза Кислая фосфатаза ?-Амилаза Трипсин Альдолаза Поперечная «сшивка» с носителем: Лактатдегидрогеназа Глюкооксидаза Пероксидаза Рибонуклеаза Дезоксирибонуклеаза Трипсин Аденозинтрифосфатаза Альдолаза Прикрепление к носителю ко- Рибонуклеаза валентной связью (азидный метод) Холинэстераза Дезоксирибонуклеаза Инвертаза Трипсин Аспарагиназа Аденозинтрифосфатаза Карбоидный метод Глюкооксидаза Пероксидаза Рибонуклеаза Щелочная фосфатаза Дезоксирибонуклеаза |