ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ ПО МИКРОБИОЛОГИИ. Учебном пособии представлены лабораторные работы по микробиологии для студентов педагогических университетов по специальностям 1
 Скачать 4.85 Mb.
|
|
АЛГОРИТМ ПРИГОТОВЛЕНИЯ МАЗКА из бактериальной культуры, выращенной на скошенном агаре («косяке») (рисунок 8 ) 1. Предметное стекло аккуратно берут за ребро и наносят номер или наименование бактериальной культуры. 2. Зажигают спиртовку. 3. Фламбируют (обжигают пламенем) поверхность стекла, где будет располагаться мазок. 4. Стекло помещают вблизи спиртовки на чашку Петри 17 5. На предметное стекло наносят каплю дистиллированной воды. 6. В левую руку берут пробирку с культурой и помещают между 1 и 2 пальцами таким образом, что ладонь находится под пробиркой и горлышко пробирки направлено в зону спиртовки. 7. В правую берут бактериологическую петлю, как карандаш. 8. Петлю фламбируют до покраснения сначала горизонтально, затем вертикально (1). 9. Не выпуская петли, мизинцем правой руки прижимают пробку пробирки к ладони (2) и осторожно вынимают ее из пробирки. Движения должны быть плавными. 10. Горло пробирки обжигают (3). 11. Вводят в пробирку петлю, охлаждая ее о стенки пробирки (4). 12. Осторожно закрывают и захватывают петлей культуру, не повреждая агара, и вынимают петлю, не касаясь ею стенок пробирки (5). 13. Прожигают горло пробирки и пробку в пламени, одновременно. Закрывают пробирку (6). 14 . Петлю с культурой вносят в каплю дистиллированной воды и осторожно эмульгируют, не заходя за границы мазка (7). 15. Бактериологическую петлю с остатками культуры прожигают до покраснения в пламени спиртовки (8). 16. Пробирку с культурой и петлю ставят в штатив. 17. Приготовленный мазок высушивают либо на воздухе , либо высоко над пламенем спиртовки. Примечание : 1. Приготовление мазка из культуры, выращенной на жидкой питательной среде, не требует использования дистиллированной воды или физиологического раствора. 2. При приготовлении мазка из культуры, выросшей на чашке Петри необходимо: - отметить изолированную колонию со стороны дна чашки; 18 - чашку берут в левую руку и в сторону спиртовки приоткрывают крышку, придерживая ее 1и 2 пальцами левой руки; - прокаленную петлю вводят под крышку чашки, остужая ее о край среды; - осторожно откалывают часть выделенной колонии и, не задевая края чашки, выносят на стекло с дистиллированной водой; - дальнейшие манипуляции согласно общему алгоритму. Рисунок 8 - Алгоритм приготовления мазка 19 Для приготовления прижизненных бактериальных препаратов используются методы раздавленной и висячей капли. МЕТООД РАЗДАВЛЕННОЙ КАПЛИ 1. На середину чистого, обезжиренного предметного стекла наносят бактериологической петлей каплю физиологического раствора. 2. В каплю воды вносят небольшое количество бактериальной культуры. 3. Осторожно накрывают покровным стеклом, предварительно поставив его на ребро. Капля тонким слоем заполняет пространство между покровным и предметным стеклом. Рисунок 9 - Приготовление препарата раздавленная капля : с помощью пипетки (1) капля воды ( 2 ) наносится на середину чистого обезжиренного стекла (3), куда с помощью бактериологической петли (4) вносят культуру микроорганизмов (5), не допуская растекания жидкости (6) каплю осторожно накрывают покровным стеклом (7) 20 МЕТОД ВИСЯЧЕЙ КАПЛИ 1. На чистое покровное стекло наносят каплю физиологического раствора. 2. Культуру микроорганизмов наносят бактериологической петлей на покровное стекло. 3. Берут предметное стекло с лункой и, обезжирив его, наносят тонкий слой вазелина по краю лунки с помощью зубочистки или стеклянной палочки. 4. Предметное стекло с лункой накладывают на покровное стекло с бактериальной культурой. 5. Аккуратно переворачивают мазок покровным стеклом вверх и препарат помещают на предметный столик. Капля свободно висит в луночке и долго не высыхает, что позволяет длительное время наблюдать за подвижностью микробных клеток. Задание 3. Изучить морфологические формы бактерий. К морфологическим свойствам бактерий относятся не только форма, но и размер клеток, расположение клеток в пространстве, наличие спор и капсул, подвижность и характер окраски бактерий по Граму. Наиболее типична морфология бактерий в молодых культурах. Среди основных морфологических форм бактерий различают: 1. шаровидные (кокковые), которые по характеру взаиморасположения делятся на: микрококки (лат. micro - маленький). В природе встречаются в виде одиночных шаровидных клеток. 21 А Б В Рисунок 10 - Micrococcus luteus : А - схема расположения клеток в пространстве, Б – фотография полученная методом СЭМ, В - методом ФКМ диплококки (лат. diploos - двойной) – бактерии, соединенные по две клетки ; A Б В Рисунок 11 - Neisseria meningitidis : А - схема расположения клеток в пространстве, Б – фотография полученная методом СЭМ, В - окраска по Граму тетракокки (лат. tetra — четыре) – группируются по четыре клетки; Рисунок 12 – Тетракокки 22 стрептококки (лат. streptos - цепь) – бактерии , образующие в результате деления клеток в одной плоскости разнообразной длины цепочки. Рисунок 13 -Streptococcus mutans : А – схема расположения клеток в пространстве, Б – фотография полученная методом СЭМ, В – окрашенный препарат сарцины (лат. sarceo - соединяю) – шаровидные бактерии, группирующиеся по 8 клеток. Располагаются они в виде куба, с каждой стороны которого по 4 клетки. Такая форма возникает в результате деления клетки в трех взаимно перпендикулярных плоскостях. Рисунок 14 – Sarcina lutea : А – схема расположения клеток в пространстве, Б – фотография полученная методом СЭМ, В – окраска по Граму стафилококки (лат. staphylo - гроздь) – клетки вследствие беспорядочного деления образуют скопления, напоминающие по внешнему виду гроздья винограда. 23 А Б В Рисунок 15 – Staphylococcus aureus (золотистый стафиллококк): А – схема расположения клеток в пространстве, Б – фотография полученная методом СЭМ, В – окраска по Граму 2. палочковидные, которые различаются по форме: правильная (энтеробактерии (представители семейства Enterobacteriaceae) , псевдомонады ( род Pseudomonas)); E.coli Salmonella typhimurium Pseudomonas aeruginosa Рисунок 16 – различные палочковидные бактерии, имеющие правильную форму неправильная (коринебактерии (Corynebacterium)). Рисунок 17 - Corynebacterium diphtheria: А – внешний вид клеток , Б – фотография полученная методом ТЭМ, В – окраска по Граму 24 по размеру : мелкие (бруцеллы (Brucella) , бордетеллы (Bordetella)); средние (бактероиды (Bacteroides) , кишечная палочка (E.coli); крупные (бациллы (Bacillus) , клостридии (Clostridium)); по форме концов обрубленные (бациллы); закругленные (сальмонеллы, псевдомонады); заостренные (фузобактерии); утолщенные (коринебактерии); по характеру взаиморасположения все палочки делятся на: расположенные одиночно; диплобактерии и диплобациллы (сцепленные попарно); стрептобактерии и стрептобациллы (сцепленные в цепочку); 3. извитые формы - по характеру и количеству завитков они делятся на: вибрионы (слегка изогнутые палочки или неполные завитки); Рисунок 18 – Вибрионы : Vibrio cholerae ( А – ТЭМ , Б – окрашенный препарат , В – Vibrio fischeri ( флуоресцентная микроскопия ) спириллы (один или несколько завитков); спирохеты, которые в свою очередь, делятся на: лептоспиры (завитки с загнутыми крючкообразными концами - S- образная форма); боррелии (4 - 12 неправильных завитков); 25 трепонемы (14 - 17 равномерных мелких завитков). Leptospira interrogans Borrelia burgdorferi Treponema pallidum Рисунок 19 – Извитые формы бактерий 4. нитчатые формы , к которым относят актиномицеты (Actinomycetales). Клетки актиномицетов обычно имеют вид длинных и ветвящихся нитей, напоминающих в ряде случаев мицелий одноклеточных грибов (т.н. «тонкий мицелий») Нити мицелия имеют длину 100–600 мкм и толщину 0,2–1,2 мкм. Actinomyces israeli Streptomyces sp. Рисунок 20 - Представители актиномицетов Размеры бактерий в среднем составляют 0,5— 5 мкм . Escherichia coli , например, имеет размеры 0,3—1 на 1—6 мкм, Staphylococcus aureus — диаметр 0,5—1 мкм, Bacillus subtilis — 0,75 на 2—3 мкм. Крупнейшей из известных бактерий является Thiomargarita namibiensis , достигающая размера в 750 мкм (0,75 мм). Спирохеты могут вырастать в длину до 250 мкм при толщине 0,7 мкм. В то же время к бактериям относятся самые мелкие из имеющих клеточное 26 строение организмов. Mycoplasma mycoides имеет размеры 0,1— 0,25 мкм. Задание 4. Ознакомиться с микрофлорой полости рта. Вся нормальная микрофлора человека подразделяется на резидентную (постоянную – автохтонную (облигатную ), составляющую до 90% присутствующих в организме микробоорганизмов, факультативную ( аллохтонную ) — менее 9,5%) и транзиторную (случайную) — до 0,5 %. Около 20 % микроорганизмов от общего числа обитает в полости рта (более 200 видов), 18 -20% приходится на кожные покровы, 15 -16% — на глотку, а больше всего микроорганизмов (до 40%) — в желудочно - кишечном тракте. Нормальная микрофлора организма начинает формироваться при рождении ребенка. В полости рта новорожденного она представлена лактобациллами, негемолитическими стрептококками и непатогенными стафилококками. Главными обитателями полости рта у взрослого человека являются бактерии преимущественно анаэробного типа дыхания (3/4 всех микробных видов), остальные виды представлены факультативными анаэробами. В ротовой полости самую большую группу бактерий составляют кокки. Род Staphylococcus. Стафилококки в полости рта здорового человека встречаются в среднем в 30% случаев. В зубном налете и на деснах здоровых людей присутствуют в основном Staphylococcus epidermidis. У некоторых людей в полости рта могут обнаруживаться и Staphylococcus aureus. Обладая значительной ферментативной активностью, стафилококки принимают участие в расщеплении остатков пищи в полости рта. Патогенные стафилококки, встречающиеся на слизистой носоглотки и в полости рта, являются частой причиной эндогенных инфекций, вызывая различные гнойно - воспалительные процессы полости рта. 27 Таблица 1 - Микробная флора полости рта в норме Микроорганизмы В слюне Частота обнаружения в зубодесневых карманах, % Частота обнару - жения, % Количество в 1 мл Резидентная флора 1. Аэробы и факультативные анаэробы: 1. S. mutans 100 1,5x10 5 100 2. S. salivarius 100 10 7 100 3. S. mitis 100 10 6 -10 8 100 4. Сапрофитные нейссерии 100 10 5 -10 7 + + 5. Лактобактерии 90 10 3 -10 4 + 6. Стафилококки 80 10 3 -10 4 + + 7. Дифтероиды 80 Не определено + 8. Гемофилы 60 Не определено 0 9. Пневмококки 60 Не определено Не определено 10. Другие кокки 30 10 2 -10 4 + + 11. Сапрофитные микобактерии + + Не определено + + 12. Тетракокки + + Не определено + + 13. Дрожжеподобные грибы 50 10 2 - 10 3 + 2. Облигатные анаэробы: 1. Вейллонеллы 100 10 6 - 10 8 100 2. Анаэробные стрептококки 100 Не определено 100 3. Бактероиды 100 Не определено 100 4. Фузобактерии 75 10 2 -10 3 100 5. Нитевидные бактерии 100 10 2 -10 4 100 6. Актиномицеты 100 Не определено + + 7. Спириллы и вибрионы + + Не определено + + 8. Спирохеты + Не определено 100 Непостоянная флора 1. Аэробы и факультативные анаэробы: 1. Klebsiella 15 10-10 2 0 2. Escherichia 2 10-10 2 ± 3. Aerobacter 3 10-10 2 0 4. Pseudomonas ± Не определено 0 7. Бациллы + Не определено 0 2. Облигатные анаэробы: 1. Clostridium putridium ± Не определено 0 28 Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Рисунок 21 – Представители рода Staphylococcus (окрашенные препараты) Род Streptococcus. Стрептококки являются основными обитателями полости рта (в 1 мл слюны — до 10 8 -10 11 стрептококков). В окрашенных мазках стрептококки располагаются в виде цепочек, грамположительны. Большинство из них являются факультативными анаэробами или микроаэрофилами, но встречаются и строгие анаэробы (например, пептострептококки). Стрептококки сбраживают углеводы с образованием молочной кислоты, вызывая молочнокислое брожение. Кислоты, появляющиеся в результате брожения, подавляют рост ряда гнилостных микробов, встречающихся в полости рта. Колонизация оральными стрептококками различных участков ротовой полости имеет качественные и количественные вариации в зависимости от условий жизни. S.salivarius и S.mitis в 100% случаев присутствуют в полости рта. S.mutans и S.sanguis обнаруживаются в большом количестве на зубах, a S.salivarius — главным образом на поверхности языка. 29 Streptococcus mutans Streptococcus salivarius Рисунок 22 – Представители рода Streptococcus Род Veillonella. Вейллонеллы — это мелкие грамотрицательные кокки, располагаются кучками, парами или короткими цепочками Строгие анаэробы. Рисунок 23 – Veillonella parvula (СЭМ и окрашенный по Граму препарат) Род Neisseria. Нейссерии — грамотрицательные диплококки. Строгие аэробы. Нейссерии всегда в большом количестве встречаются в полости рта здоровых людей (до 1—3 млн. в 1 мл слюны). В полости рта помимо кокков обитают разнообразные палочковидные формы бактерий. Род Fusobacterium включает более 10 видов, изолированных из ротовой полости человека и животных Фузобактерии — грамотрицательные анаэробные палочки, в культуре 30 выглядят как прямые или искривленные палочки, короткие нити с заостренными концами, напоминающие веретено. Лептотрихии (род Leptotrichia содержит один вид -Leptotrichia buccalis) имеют вид длинных нитей разной толщины с заостренными или вздутыми концами, дают густые сплетения, могут располагаться попарно в виде зернистых палочек Лептотрихии присутствуют в полости рта постоянно (чаще у шейки зубов) в большом количестве (в 1 мл слюны 103 - 104). Рисунок 24 - Leptotrichia buccalis Чтобы поселиться в полости рта, бактерии должны прикрепиться к зубам или к слизистой оболочке и за счет этого обеспечить себе устойчивость к току слюны. Адгезия опосредована адгезинами поверхности бактерий и рецепторами эпителиоцитов ротовой полости, структурами зубной эмали (рис. 25). Микробные адгезины состоят из полисахаридов, липотейхоевых кислот, а также могут быть представлены гликозилтрансферазами и белками, связанными с углеводами (лектины). Эти адгезины являются компонентами клеточной стенки или ассоциированы с такими структурами 31 бактериальной клетки, как пили, фимбрии, фибриллы или капсулы. Рецепторами могут быть компоненты слюны (муцины, гликопротеины, амилаза, лизоцим, богатые пролином белки ) или бактериальные компоненты (гликозилтрансферазы или глюканы), которые связаны с ротовыми поверхностями. В процессе адгезии происходят неспецифические физико - химические взаимодействия между бактериями и эпителиоцитами (например, липотейхоевые кислоты клеточной стенки бактерий связываются с отрицательно заряженными компонентами клеток хозяина через ионы кальция, водородные или гидрофобные связи). Рисунок 25 - Схема формирования микрофлоры ротовой полости Некоторые бактерии могут колонизировать поверхность слизистых или зубов, закрепляясь на поверхностных структуpax других бактерий, т.е. осуществляя коагрегацию. Стрептококки разных видов |