ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ ПО МИКРОБИОЛОГИИ. Учебном пособии представлены лабораторные работы по микробиологии для студентов педагогических университетов по специальностям 1
 Скачать 4.85 Mb.
|
|
2 ПРЕДИСЛОВИЕ В настоящем учебном пособии представлены лабораторные работы по микробиологии для студентов педагогических университетов по специальностям 1 - 02 04 01 Биология с дополнительными специальностями и 1 -02 04 05- 01 География. Биология. Цель лабораторного практикума — углубление теоретических положений лекционного курса микробиологии и освоение методики микробиологического эксперимента. Пособие включает лабораторные работы по разделам курса: «Морфология и структурно - функциональная организация прокариот», «Физиология и метаболизм прокариот» , «Рост и культивирование прокариот», «Систематика и классификация прокариот», «Экология прокариот» В конце каждой работы приводятся вопросы для закрепления теоретического и экспериментального материала. Приведенные работы рассчитаны на 4 часа. В каждой из предлагаемых работ приведены список материалов и оборудования, краткие теоретические объяснения, описание хода работы, рекомендации по оформлению результатов. Лабораторные работы содержат справочный материал, позволяющий студенту лучше уяснить содержание лабораторной работы. Работы выполняются побригадно (2 человека). Выполнению работы предшествует ознакомление с теоретическими положениями и ходом работы, формулирование цели и задач исследования. Пользуясь пособием, студенты оформляют результаты эксперимента в соответствии с учебной картой занятия Работы предусматривают самостоятельную формулировку выводов с обоснованием полученных результатов. Анализ записей и усвоение изучаемого материала контролируется преподавателем на каждом занятии. 3 ТРЕБОВАНИЯ К СОДЕРЖАНИЮ И ОФОРМЛЕНИЮ ЛАБОРАТОРНЫХ РАБОТ 1. Лабораторные работы оформляются в тетради каждым студентом индивидуально. Лабораторная тетрадь подписывается студентом до начала выполнения первой лабораторной работы. 2. Каждая лабораторная работа должна содержать следующие структурные элементы: 1. Наименование лабораторной работы. 2. Цель занятия. 3. Перечень необходимых материалов и оборудования. 4 . Результаты и обсуждение: а) наименование задания. б) указанный в разделе Учебная карта занятия экспериментальный материал , полученный ЛИЧНО студентом в ходе выполнения лабораторной работы. 5 . Выводы. Лабораторная работа, оформленная в соответствии с данными требованиями, представляется в конце КАЖДОГО ЗАНЯТИЯ на подпись преподавателю. 4 ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РАБОТЕ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ 1. К работе в учебной микробиологической лаборатории допускаются лица после прохождения инструктажа по технике безопасности. 2. Запрещается входить в микробиологическую лабораторию в верхней одежде. 3. К занятию допускаются студенты только при наличии медицинского халата. 4. В микробиологическую лабораторию запрещено вносить пищу, питьевую воду, посторонние вещи. В лаборатории запрещается курить и принимать пищу. 5. За каждым студентом закрепляется постоянное рабочее место (номер рабочего места записывается студентом на титульном листе лабораторной тетради). 6. На рабочем месте размещаются только необходимые для выполнения конкретной лабораторной работы оборудование и материалы. 7. Приступать к работе и перемещаться по лаборатории во время занятия только с разрешения преподавателя. 8. При работе с микроорганизмами соблюдать осторожность и придерживаться приемов, исключающих возможность инфицирования. 9. Запрещается прикасаться к микробным культурам руками. 10 . Если микроорганизмы случайно попали на стол, следует немедленно удалить их тампоном, смоченным дезинфицирующим раствором. При работе с жидкой культурой пользоваться спецсредствами для забора микроорганизмов. 10. Не зажигать одну спиртовку от другой. Закрывать фитиль спиртовки колпачком между использованиями. 5 11. Соблюдать меры безопасности при обращении с электроприборами. Перед работой проверить исправность электрооборудования. Без разрешения преподавателя не включать электроприборы в сеть. 12. В конце работы привести в порядок рабочее место. Тщательно вымыть руки и обработать ватным тампоном с дезинфицирующим раствором. Халат сложить в полиэтиленовый пакет. 13. Выполнение правил техники безопасности контролируют дежурные студенты, которые также проверяют в конце занятия порядок рабочих мест. 6 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРОКАРИОТ. МОРФОЛОГИЯ ПРОКАРИОТ Цель занятия. Ознакомиться с оборудованием рабочего места в микробиологической лаборатории, техникой безопасности при работе с микроорганизмами. Овладеть методиками приготовления основных микробиологических препаратов Изучить морфологические формы бактерий на примере чистых культур микроорганизмов и микрофлоры полости рта. Материалы и оборудование: инструкция по технике безопасности при работе с культурами микроорганизмов; журнал по технике безопасности; посевы микроорганизмов на чашках Петри, в пробирках со скошенным агаром; спички, карандаш по стеклу; вазелин; иммерсионное масло; микроскоп; микробиологическая петля с петледержателем; спиртовка; предметные стекла; покровные стекла; шпатель Дригальского; пипетка Пастера; пипетка стеклянная градуированная; прибор для окрашивания и промывания мазков; полоски фильтровальной бумаги. Задачи : 1. Ознакомиться с оборудованием рабочего места и техникой безопасности при работе с микроорганизмами. 2. Изучить методы исследования микроорганизмов. 3. Овладеть методами приготовления микробиологических препаратов. 4. Изучить морфологические формы микроорганизмов. 5. Закрепить полученные знания при исследовании микрофлоры полости рта. 7 Задание 1. Ознакомиться с техникой безопасности при работе с микроорганизмами и оборудованием рабочего места в микробиологической лаборатории Работа в микробиологической лаборатории требует строгого соблюдения техники безопасности. В Республике Беларусь и России по степени опасности для человека и окружающей среды выделено 4 группы возбудителей инфекционных заболеваний , более низкий номер группы означает возрастающий риск при выполнении лабораторных исследований. I группа – возбудители особо опасных инфекций: чумы, натуральной оспы, геморрагических лихорадок (Ласса, Эбола и др.). II группа – возбудители высококонтагиозных бактериальных, грибковых и вирусных инфекций: сибирской язвы, бруцеллеза, туляремии, холеры, сыпного тифа, бластомикоза, бешенства, СПИДа, гепатитов В и С и др., ботулотоксины и столбнячный токсин. III группа – возбудители других инфекций: коклюша, столбняка, ботулизма, туберкулёза, трихомониаза, малярии, лейшманиоза, гриппа, полиомиелита, герпесвирусы и др. IV группа – условно - патогенные (возбудители газовой гангрены, клебсиеллы, стафилококки, стрептококки, синегнойная палочка, некоторые кандиды и аспергиллы, аденовирусы, ротавирусы, энтеровирусы и др.) и непатогенные микроорганизмы. На лабораторных занятиях студенты работают с непатогенными микроорганизмами. Однако необходимо помнить, что при посеве сапрофитных микроорганизмов из окружающей среды случайно может быть внесена и патогенная микрофлора. 8 Подготовка микробиологической лаборатории к работе . Для того чтобы снизить количество микроорганизмов в воздухе и на различных поверхностях, в лабораторных помещениях применяют различные способы дезинфекции Воздух в лаборатории наиболее просто дезинфицировать проветриванием. Продолжительная вентиляция помещения через форточку (не менее 30–60 мин) приводит к резкому снижению количества микроорганизмов в воздухе, особенно при значительной разнице в температуре между наружным воздухом и воздухом помещения. Более эффективный и наиболее часто применяемый способ дезинфекции воздуха – облучение ультрафиолетовыми лучами с длиной волны от 200 до 400 нм. Рабочее место, где непосредственно проводится работа с культурами микроорганизмов, требует особенно тщательной обработки. Рабочий стол следует дезинфицировать не только до начала работы, но и после ее окончания. Для протирания поверхности стола можно использовать растворы лизола и хлорамина, а также 70%- ные (по объему) растворы изопропилового или этилового спиртов. Для работы в учебной микробиологической лаборатории используется следующие оборудование : 1. Микроскоп . Биологический микроскоп (рис. 1) представляет собой оптический прибор, увеличивающий предметы в 40-1500 раз; состоящий из механической, оптической и осветительной систем. К механической системе микроскопа относятся подковообразная ножка, тубусодержатель, тубус, предметный столик, винты. Оптическая система включает объективы и окуляр. Осветительная система состоит из конденсора с диафрагмой и зеркала. Тубусодержатель и подковообразное основание соединены между собой подвижно шарниром. Тубус - зрительная труба 9 микроскопа. В верхнюю часть тубуса вставлен окуляр, а в нижнюю – вращающийся вокруг своей оси револьвер, в который ввинчены объективы. Тубус передвигается вверх и вниз при помощи макрометрического и микрометрического винтов. Один оборот микрометрического винта передвигает тубус на 0,1 мм. Поэтому микровинтом пользуются для более точной наводки, а для предварительной - макровинтом. Предметный столик предназначен для размещения исследуемого материала. Рисунок 1 - Микроскоп 1 — макровинт; 2 — тубусодержагель; 3 — шарнирное соединение; 4 — предметный столик; 5 — тубус; 6 - окуляр; 7 — револьвер; 8 — объективы; 9 — конденсор; 10 — зеркало; 11 — микровинт; 12 — подковообразное основание Конденсор состоит из линз, собирающих отраженные от зеркала лучи в световой пучок, и направляющих его через отверстие предметного столика на препарат. При определении подвижности неокрашенных препаратов конденсор должен быть несколько опущен. Диафрагма находится между зеркалом и кондесором и служит для регулирования количества света, поступающего в конденсор. 10 Объектив состоит из системы линз, заключенных в металлическую оправу. Передняя линза служит для увеличения предмета, остальные - для коррекции изображения. Современные биологические микроскопы имеют не менее трех объективов. Сухие объективы увеличивают в 8 и 40 раз (между объективами и препаратом находится слой воздуха), иммерсионные - в 90 раз. На оправу каждого объектива нанесена цифра, указывающая увеличение. Окуляр состоит из верхней - глазной и нижней - собирательной линз. На верхней части окуляра имеется цифра, указывающая увеличение (7 , 10, 15). Окуляр увеличивает только изображение. Общее увеличение микроскопа складывается из произведения увеличения объектива на увеличение окуляра. Рабочий стол для микроскопирования препаратов желательно размещать у окна или оснащать источником света. Микроскоп устанавливают на рабочий стол к себе тубусодержателем примерно на 7 - 10 см от края. Вначале проводят настройку освещения, для чего зеркалом направляют пучок света от источника освещения в объектив с увеличением в 8 раз. При правильной настройке освещения поле зрения микроскопа должно быть в виде равномерно освещенного круга. После этого на предметный столик помещают исследуемый препарат, который закрепляют клеммами и рассматривают под микроскопом, пользуясь объективами с увеличением в 8, 40 или 90 раз. При работе с объективами 8 и 40 тубус микроскопа осторожно опускают с помощью макрометрического винта, приближают объектив почти вплотную к препарату, но не касаются его. Наблюдают в окуляр, слегка приподнимая тубус тем же винтом до получения изображения. С помощью микрометрического винта проводят точную установку объектива до получения четкого изображения предмета. 11 При работе с иммерсионным объективом (увеличение в 90 раз) на препарат предварительно наносят каплю иммерсионного масла, а затем контролируя сбоку макрометрическим винтом опускают объектив в каплю масла. Точную установку объектива проводят с помощью микрометрического винта, который вращают в обратном направлении до получения четкого изображения. При нанесении капли иммерсионного масла не происходит рассеивания луча света, а значит , получается четкое изображение (рис. 2). Рисунок 2 - Схема хода лучей в сухой и иммерсионной системах По окончании работы исследуемый материал снимают с предметного столика. Мягкой тканью, смоченной в очищенном бензине или эфире, удаляют иммерсионное масло с объектива, на предметный столик помещают квадрат из фланели, опускают конденсор и убирают микроскоп в место, предохраняющее его от пыли и сырости. Принцип действия люминесцентного микроскопа основан на способности отдельных объектов и красителей светится при освещении их ультрафиолетовыми лучами. Люминесцентные микроскопы снабжены источником ультрафиолетового света и 12 набором светофильтров. У бактерий очень слабо выражена собственная флюоресценция. Поэтому необходимо их обработать флюоресцирующими красками (флюорохромами), которые окрашивают структурные элементы клетки в различные цвета. Электронная микроскопия — это метод исследования структур, находящихся вне пределов видимости светового микроскопа и имеющих размеры менее одного микрона (от 1 мкм до 1—5 Å). Рисунок 3 - Просвечивающий электронный микроскоп Действие электронного микроскопа основано на использовании направленного потока электронов, который выполняет роль светового луча в световом микроскопе, а роль линз играют магниты (магнитные линзы). Электронная микроскопия, при которой изображение получают благодаря прохождению (просвечиванию) электронов через образец, называется просвечивающей (трансмиссивной). При сканирующей (растровой), или туннельной электронной микроскопии пучок электронов быстро сканирует поверхность образца, вызывая излучение, которое посредством катодно - лучевой трубки формирует изображение на светящемся экране микроскопа. 13 А Б Рисунок 4 - Схема электронного микроскопа: А - трансмиссивного , Б – сканирующего С помощью электронной микроскопии можно детально изучать строение бактерий, вирусов, бактериофагов А Б (US National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), and US National Institute of Health) Рисунок 5 – Изображения, полученные с использованием сканирующей электронной микроскопии : А – бактерии Salmonella typhimurium , внедрившейся в клетки человека (дополнительно раскрашенное изображение) , Б – бактерии Escherichia coli 14 2. Предметные стекла. Служат для приготовления микробиологических препаратов. Предметные стекла имеют размеры 26х76 мм. Толщина стекла 1 мм. Существуют модификации предметных стекол: - стекло предметное с заточенным краем для растяжки мазков; - стекло предметное с лункой для микроскопии препаратов «висячая капля» ; - стекло предметное с полосой для записи. Рисунок 6 - Стекла предметные различного назначения 3. Покровные стекла. Покровное стекло предназначено для защиты объектива микроскопа, а в случае получения препарата «висячая капля» на него наносится исследуемая культура микроорганизмов. Толщина стекла 0,2 мм. Размеры покровных стекол 18х18, 24х24, 24х48 мм. Микроскопировать препараты , не защищенные покровным стеклом , категорически запрещается! 4. Бактериологическая петля . Состоит из петледержателя и собственно петли, изготовленной из нихромовой нити различного диаметра. 15 5. Чашка Петри (изобретена в 1877 г. немецким бактериологом Юлиусом Рихардом Петри, ассистентом Роберта Коха ) обычно изготавливается из прозрачного стекла или пластмассы (прозрачный полистирол) и может иметь самые различные размеры. Наиболее часто используемые варианты имеют диаметр порядка 50 — 100 мм и высоту около 15 мм. Чашка широко используется в микробиологии для культивирования колоний микроорганизмов. Для этой цели чашка Петри заполняется слоем питательной среды, на который производят посев культуры микроорганизмов. Стеклянные чашки — многоразовые, но требуют стерилизации перед повторным посевом. Чашки из пластических материалов поставляются стерильными, в герметичной упаковке. 6. Шпатель Дригальского предназначен для засевания материала на плотные питательные среды. Выпускаются шпатели L - и Т - формы. Гладкая поверхность рабочей части шпателя позволяет избегать повреждения питательной среды Рисунок 7 - Микробиологическая посуда А — чашка Петри; Б — стекло предметное; В — стекло покровное; Г — игла микробиологическая; Д — петля бактериологическая; Е — шпатель Дригальского 16 Задание 2. Изучить методы исследования микроорганизмов. Приготовление микробиологических препаратов Препараты (мазки) готовят из бактериальных культур. Чистая бактериальная культура - это культура, состоящая из микробных клеток одного вида. По способу получения она представляет собой потомство (клон) одной клетки. В лаборатории микроорганизмы выращивают в питательных средах, которые разливают в пробирки, колбы и чашки Петри. Внесение микроорганизмов в стерильную среду называется инокуляцией (посевом) Перед посевом следует надписать на пробирке (колбе или чашке Петри) название микроорганизма и дату посева. Надпись делают маркером на стекле или на наклеенной этикетке. Клетки микроорганизмов для посева или приготовления препаратов берут бактериологической петлей, если микроорганизмы выращены на плотной среде. В том случае, когда пересевают культуры микроорганизмов, выросшие в жидкой питательной среде, пользуются стерильной пипеткой. Использованную пипетку следует немедленно перенести в дезинфицирующий раствор, не касаясь ею окружающих предметов. При приготовлении препаратов из культуры бактерий, выросших на питательных средах, необходимо соблюдать правила асептики |