ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ ПО МИКРОБИОЛОГИИ. Учебном пособии представлены лабораторные работы по микробиологии для студентов педагогических университетов по специальностям 1
 Скачать 4.85 Mb.
|
|
Вопросы к лабораторному занятию № 3. 1. Гомо - и гетероферментативное молочнокислое брожение. 2. Микроорганизмы, осуществляющие молочнокислое брожение, их морфологические и биохимические свойства 3. Состав заквасок основных молочнокислых продуктов. 4. Пробиотические свойства молочнокислых продуктов. 57 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 4 МАСЛЯНОКИСЛОЕ БРОЖЕНИЕ БАКТЕРИЙ Цель занятия. Изучить свойства микроорганизмов, осуществляющих маслянокислое брожение. Материалы и оборудование: клубни картофеля; мел; большие пробирки, ватные пробки, резиновые пробки; пипетки; спички, карандаш по стеклу; иммерсионное масло; микроскоп; микробиологическая петля с петледержателем; спиртовка; предметные стекла; покровные стекла; прибор для окрашивания и промывания мазков; полоски фильтровальной бумаги; реактивы для окраски микробиологических препаратов по методу Ауэски; 9. 5% раствор хлорного железа; раствор Люголя. Задачи: 1. Ознакомиться с основными видами микроорганизмов, осуществляющими маслянокислое брожение. 2. Создав элективные условия получить накопительную культуру бактерий рода Clostridium, осуществляющих маслянокислое брожение. 3. Провести исследование свойств бактерий, осуществляющих маслянокислое брожение. Задание 1. Ознакомиться с основными видами микроорганизмов, осуществляющими маслянокислое брожение. Маслянокислое брожение – это процесс анаэробного разложения углеводов маслянокислыми бактериями с образованием масляной кислоты и других продуктов по уравнению: С 6 Н 12 0 6 → СН 3 СН 2 СН 2 СООН +2С0 2 +2Н 2 58 Кроме масляной кислоты, в процессе брожения в заметных количествах образуется уксусная кислота, а при смещении реакции в кислую сторону (до рН 5,5) — в больших количествах бутиловый спирт и ацетон. Энергетическим материалом для маслянокислых бактерий служит крахмал, водорастворимые углеводы типа декстринов, ди - и моносахаридов, органические кислоты (молочная и пировиноградная) и спирты — маннит и глицерин. В качестве источника азота они используют самые различные азотистые соединения; пептон, аминокислоты, аммиачные соли, а некоторые даже атмосферный азот. Бактерии, вызывающие маслянокислое брожение, относятся к роду Clostridium. Маслянокислые бактерии широко распространены в почве (до 90% почвенных образцов, как правило, содержат эти бактерии), навозе, загрязненных водоемах, на разлагающихся растительных остатках, в молоке, на поверхности растений и т. д. В природе маслянокислые бактерии полезны, так как образующаяся масляная кислота в невысоких концентрациях является веществом, стимулирующим рост высших растений. Маслянокислое брожение происходит в природных условиях в гигантских масштабах: на дне болот, в заболоченных почвах, илах и всех тех местах, куда ограничен доступ кислорода. Благодаря деятельности маслянокислых бактерий разлагаются огромные количества органического вещества. Однако маслянокислое брожение часто приносит значительный ущерб, вызывая массовую порчу овощей при хранении, вспучивание сыра, порчу консервов, прогоркание молока. Clostridium spp. входят в состав нормальной микрофлоры желудочно - кишечного тракта (автохтонная микрофлора); иногда их обнаруживают на коже и в полости рта (аллохтонная микрофлора). К роду Clostridium относятся также весьма опасные патогенные виды: Сlostridium tetani – возбудитель столбняка , Сlostridium perfringens – 59 возбудитель газовой гангрены , Сlostridium botulinum – продуцент экзотоксина, одного из самых сильных биологических ядов (ботулизм). Все виды рода объединены в группы в зависимости от способности сбраживать те или иные органические соединения. Первая группа — сахаролитические виды Clostridium, сбраживающие растворимые углеводы, крахмал или пектин с образованием бутирата, ацетата, СО 2 и Н 2 . Брожение при участии некоторых микроорганизмов группы приводит к образованию из сахаров дополнительных нейтральных соединений (бутанола, пропанола, ацетона, небольших количеств этанола). В группу входят бактерии, вызывающие маслянокислое и ацетонобутиловое брожения: С. pasteurianum, С. tyrobutyricum, С. butylicum, С. acetobutylicum и др. Вторая группа — протеолитические виды Clostridium, сбраживающие аминокислоты. Обладают сильными протеолитическими свойствами и способны к интенсивному гидролизу белков с последующим сбраживанием аминокислот. Рост микроорганизмов средах с белком сопровождается образованием аммиака, СО 2 , Н 2 , жирных кислот и большого количества летучих соединений с неприятным запахом. К группе относятся виды: С. sporogenes, С. регfringens, С. histolyticum, С. botulinum и др. Многие представители рода Clostridium , сбраживающие аминокислоты, способны также к сбраживанию углеводов. Третья группа — виды Clostridium , сбраживающие азотсодержащие циклические соединения — пурины и пиримидины. Пурины (гуанин, гипоксантин, ксантин и др.) под влиянием С. acidi-urici и С. cylindrosporum превращаются в аммиак, ацетат и СО 2 С. oroticum сбраживает пиримидины, при этом урацил распадается до аланина, СО 2 и NH 3 , а оротовая кислота — до уксусной кислоты, СО 2 и NH 3 60 Четвертая группа включает всего один вид — С. kluyveri , сбраживающий смесь этанола с ацетатом до бутирата и капроновой кислоты, а также небольшого количества водорода. Задание 2. Получить накопительную культуру маслянокислых бактерий Получение накопительной культуры маслянокислых бактерий рода Clostridium проводят с использованием нечищеных клубней картофеля, на поверхности которых высока вероятность присутствия бактерий этого рода. Измельченные клубни помещают в водную среду, куда добавляют мел для создания нейтральной среды, так как маслянокислые бактерии относятся к нейтралофилам. Чтобы в этой среде развивались преимущественно маслянокислые бактерии, следует создать в ней строго анаэробные условия и подвергнуть среду пастеризации (прогреванию при температуре около 80ºС в течение 10–15 мин). При нагревании споры маслянокислых бактерий остаются жизнеспособными, а попавшие с почвой неспорооразующие бактерии погибают. Задание 3. Изучить морфологию представителей рода Clostridium , осуществляющих маслянокислое брожение. В настоящее время среди представителей Clostridium насчитывается более 80 видов бактерий. Они являются строгими (облигатными) анаэробы, представляют собой подвижные крупные палочки (перитрихальный тип жгутикования) с клостридиальным или плектридиальным типом спорообразования (рис. 30). У видов рода образуются споры, имеющие овальную или сферическую форму; они терморезистентны Окраска по Граму - положительная. Очень чувствительны к кислотности среды, оптимум рН 6,9–7,3. При рН ниже 4,9 прекращают развиваться. Характерная особенность 61 маслянокислых бактерий — способность накапливать в клетках гранулезу в период образования спор и перед ним. А Б В Рисунок 30 - Типы спорообразования у бактерий: А – бациллярный, Б – клостридиальный, В - плектридиальный Род включает психрофильные, мезофильные и термофильные виды. Температурный оптимум для роста большинства мезофильных видов лежит в диапазоне 30—40 °С. Для термофильных видов температурный оптимум составляет 60—75 °С. Оптимальная реакция среды для клостридий — нейтральная или слабощелочная. Типичный представитель маслянокислых бактерий — Clostridium butyricum. Это крупная палочка (1—2 х 10 мкм). Молодые клетки подвижны, на более поздних стадиях развития они теряют жгутики, приобретают веретенообразную форму и накапливают запасное питательное вещество — полисахарид гранулезу. При образовании спор клетки приобретают веретеновидную форму, иногда форму барабанной палочки. Учебная карта к лабораторной работе № 4 Работа выполняется в 2 этапа. Этап 1. Получить накопительную культуру маслянокислых бактерий. 1. Неочищенный картофель нарезать ломтиками, которые могут легко войти в пробирку. 62 2. Заполнить ими пробирку на 1/3 объема, добавить щепотку мела и заполнить водой почти до верха. Закрыть ватной пробкой 3. Пробирки поместить в водяную баню при температуре 80 0 С на 10 –15 мин. 4. Вынуть ватные пробки и быстро заменить их резиновыми, проводя последние через пламя спиртовки и обжигая край пробирок. 5. Затем пробирки закрыть пробками и ставить в термостат с температурой 35 0 С на 2–3 дня. 6. При этих условиях в жидкости обнаруживают бактерии маслянокислого брожения. Элективные условия для прохождения в опыте маслянокислого брожения: 1) наличие крахмала как специфического источника углерода, который используется только микроорганизмами, содержащими фермент амилазу, вызывающую гидролиз крахмала до глюкозы; 2) присутствие маслянокислых бацилл на поверхности картофеля; 3) анаэробные условия под высоким столбиком жидкости; 4) нейтральная среда за счёт внесения мела; 5) пастеризация, позволяющая отделить маслянокислые бациллы от неспоровых форм. Этап 2. Исследовать микроорганизмы маслянокислого брожения. 1. С помощью пипетки взять жидкость со дна пробирки, приготовить препарат «раздавленная капля» с добавлением раствора Люголя и «висячую каплю». Культуру микроскопировать, в ней обнаруживается главным образом Clostridium pasteurianum – подвижные палочки с закругленными концами, одиночные и парные. В старых культурах у одного из концов клетки обнаруживается спора. 63 2. Исследовать спорообразование по Ауэски. Результаты занести в таблицу 1. Сделать рисунок. 3. С культуральной жидкостью проводят качественную реакцию на масляную кислоту. Для этого к 5 мл жидкости добавляют 2 мл 5% - ного хлорного железа. При нагревании образуется маслянокислое железо коричневого цвета. Таблица 1. Морфология маслянокислых бактерий Сделать обобщающий вывод по результатам исследования. Вопросы к лабораторному занятию № 4. 1. Виды маслянокислого брожения. 2. Микроорганизмы, осуществляющие маслянокислое брожение, их морфологические и биохимические свойства. 3. Каким образом производится получение накопительной культуры маслянокислых бактерий рода Clostridium. 4. Спорообразование у бактерий рода Clostridium. Метод, использованный для изучения морфологии Внешний вид препарата при микроскопировании Вывод 1. «Висячая капля» 2. «Раздавленная капля» с раствором Люголя 3. Метод Ауэски для выявления спорообразования 64 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 5 МИКРООРГАНИЗМЫ ВОЗДУХА. КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА МИКРООРГАНИЗМОВ Цель занятия. Изучить микроорганизмы воздуха, ознакомиться с методами их количественного определения. Освоить методы определения культуральных свойств микроорганизмов. Материалы и оборудование: Атлас микроорганизмов, определитель Берджи; шкала цветов А.С. Бондарцева; спички; карандаш по стеклу; иммерсионное масло; чашки Петри стерильные; среда МПА стерильная; микроскоп; микробиологическая петля с петледержателем; спиртовка; предметные стекла; покровные стекла; прибор для окрашивания и промывания мазков; полоски фильтровальной бумаги; реактивы для окраски микробиологических препаратов. Задачи. 1. Ознакомиться с качественным составом микроорганизмов воздуха и методами определения количественного состава микроорганизмов в воздухе. 2. Определить общую бактериальную загрязненность воздуха. 3. Освоить методы определения культуральных свойств на примере микроорганизмов воздуха. Задание 1. Ознакомиться с составом микрофлоры воздуха. Воздух как среда обитания для микроорганизмов менее благоприятен, чем почва и вода, так как в нем не содержится или содержится очень мало питательных веществ, необходимых для размножения микроорганизмов. Кроме того, на них сильнее действуют 65 такие неблагоприятные факторы, как высушивание и ультрафиолетовые лучи солнечного света. Тем не менее, попадая в воздух, многие микроорганизмы могут сохраняться в нем более или менее длительное время. Воздух особенно загрязнен вблизи земной поверхности, а с высотой он становится все более чистым. На степень загрязнения воздуха микробами влияют и климато - географические условия. Больше всего микроорганизмов в атмосфере содержится летом, меньше всего — зимой. Микрофлору воздуха условно разделяют на резидентную (постоянно обнаруживаемую) и временную (обнаруживают спорадически). В атмосферном воздухе в основном встречают три группы микроорганизмов. Пигментообразующие кокки в солнечные дни составляют до 70- 80% всей флоры (пигмент защищает бактерии от инсоляции): Micrococcus roseus, M. flavus, M. candicam, M. lutea, Sarcina flava, S. alba, S. rosea. Почвенные споровые и гнилостные микроорганизмы Их содержание резко увеличивается в сухую и ветреную погоду: Bacillus subtills, B. mycoides, виды Actinomyces. Плесневые грибы и дрожжи ( роды Penicillium, Aspergillus(A. niger, A. flavus, A. fumigatus), Mucor и др.) Их содержание увеличивается при повышении влажности воздуха. Микрофлора воздуха закрытых помещений более однообразна и относительно стабильна. Среди микроорганизмов доминируют обитатели носоглотки человека, в том числе патогенные виды, попадающие в воздух при кашле, чихании или разговоре (стафиллококки, в том числе, Staphylococcus aureus , стрептококки). Основной источник загрязнения воздуха патогенными видами — бактерионосители. Уровень микробного загрязнения зависит главным 66 образом от плотности заселения, активности движения людей, санитарного состояния помещения, в том числе пылевой загрязнённости, вентиляции, частоты проветривания, способа уборки, степени освещённости и других условий. Так, регулярные проветривания и влажная уборка помещений снижает обсеменённость воздуха в 30 раз (по сравнению с контрольными помещениями). Самоочищения воздуха закрытых помещений не происходит. Условия циркуляции микроорганизмов в воздухе. Микроорганизмы в воздухе находятся в состоянии аэрозоля. Выделяют три основные фазы бактериального аэрозоля. Капельная, или крупноядерная фаза состоит из бактериальных клеток, окружённых водно - солевой оболочкой. Диаметр частиц около 0,1 мм и более. Частицы оседают довольно быстро: длительность пребывания в воздухе составляет несколько секунд, а скорость перемещения — в среднем 30 см/с. Мелкоядерная фаза образуется при высыхании частиц первой фазы и состоит из бактериальных клеток, сохранивших только химически связанную воду на своей поверхности и свободную воду внутри клеток. В этой фазе частицы имеют наименьшие размеры, легко перемещаются потоками воздуха, длительное время находятся в нём во взвешенном состоянии. Это наиболее устойчивая фаза, так как диаметр большинства частиц не превышает 0,05 мм, а скорость оседания частиц составляет, в среднем, 0,013 см/с. При этом скорость их передвижения превышает 30 см/с, поэтому они могут рассеиваться на большие расстояния. Эта фаза представляет наибольшую эпидемиологическую опасность, так как в её составе распространяется большинство возбудителей воздушно - капельных инфекций, особенно малоустойчивых к внешним воздействиям (например, возбудитель коклюша). 67 Фаза «бактериальной пыли» Из первых двух фаз бактерии могут переходить в состав более крупных частиц, оседающих в виде пыли на различных предметах, образуя так называемую «бактериальную пыль». Её важное свойство — способность легко диспергироваться под воздействием даже малых токов воздуха. Размер частиц варьирует от 0,01 до 1 мм. В зависимости от размера частиц и скорости воздушных течений, скорость их перемещения находится в пределах 0,5–30 см/с. Вследствие длительного пребывания во взвешенном состоянии и способности частиц проникать в дистальные отделы лёгких, мелкодисперсная «бактериальная пыль также представляет эпидемиологическую опасность. Эта фаза бактериального аэрозоля преобладает в воздухе жилых помещений и с ней рассеиваются патогенные микроорганизмы, устойчивые к высушиванию (микобактерии, клостридии, стафилококки, стрептококки, грибы). При исследовании бактериальной загрязненности воздуха учитывается общее количество микроорганизмов, содержащихся в определенном объеме воздуха, и качественный состав микрофлоры воздуха. Санитарно - бактериологическое исследование воздуха проводится с использованием двух методов отбора проб воздуха: 1 Седиментационный метод (по Коху) – оседание микроорганизмов под действием силы тяготения – является простым способом изучения микрофлоры воздуха. Он заключается в том, что чашки Петри со средой остаются открытыми на определенное время (5–10 минут на общую обсемененность и не менее 40 мин на кокковую микрофлору), затем их закрывают и выдерживают 24 часа при комнатной температуре. Количество выросших колоний соответствует степени загрязненности воздуха и подчиняется правилу Омелянского : по |