ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ ПО МИКРОБИОЛОГИИ. Учебном пособии представлены лабораторные работы по микробиологии для студентов педагогических университетов по специальностям 1
 Скачать 4.85 Mb.
|
|
Рисунок 3 7 – Выделение чистой культуры микроорганизмов методом истощающего штриха Определение чистоты выделенной культуры Чистота выделенной культуры микроорганизма должна быть обязательно проверена. Это осуществляется одновременно несколькими способами: визуально, микроскопическим контролем и высевом на ряд питательных сред. Визуальный контроль проводят, когда выделенная культура микроорганизма высеяна на поверхность скошенного агара. Если культура чиста, то характер ее роста на скошенном агаре однороден по всему штриху. Проверка чистоты выделенной культуры обязательно включает микроскопический контроль. Для этого следует приготовить препарат фиксированных окрашенных клеток и исследовать его с иммерсионной системой. Учебная карта к лабораторной работе № 6 92 Ознакомиться с классификацией питательных сред. Изучить технику посева микроорганизмов на поверхность плотных сред и методы выделения чистых культур. Работа выполняется в два этапа. Этап 1. На основе полученных знаний выбрать схему получения чистых культур двух микроорганизмов из смешанного посева на поверхности чашки Петри. На первом этапе (1 - е занятие) произвести получение чистых культур путем изолирования отдельных колоний. Этап 2. На 2 - м занятии подтвердить получение чистых культур на основании изучения культуральных и морфологических свойств и получить накопительную культуру из чистых культур путем пересева штрихом на поверхность чашек Петри или в пробирки со скошенным МПА. Результаты занести в таблицу 1. Таблица 1. Морфологические и бактериальные свойства микроорганизмов Бактериальная культура 1 2 Культуральные свойства Морфологические свойства Сделать вывод. Вопросы к лабораторной работе № 6. 1. Классификация питательных сред. 2. Требования к питательным средам. Способы стерилизации питательных сред. 3. Методы выделения чистых культур аэробных и анаэробных микроорганизмов. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 7 93 МИКРОФЛОРА ВОДЫ Цель работы – Изучить состав микрофлоры воды, ознакомиться с методами определения общего числа микроорганизмов и кишечной палочки в воде. Материалы и оборудование: Атлас микроорганизмов, определитель Берджи; спички, карандаш по стеклу; иммерсионное масло; среда МПА стерильная; чашки Петри стерильные; чашки Петри со средой Эндо; пипетки стерильные; шпатель Дригальского; пробирки стерильные; микроскоп; микробиологическая петля с петледержателем; спиртовка; предметные стекла; покровные стекла; прибор для окрашивания и промывания мазков; полоски фильтровальной бумаги; реактивы для окраски микробиологических препаратов. Задачи. 1. Ознакомиться с методами учета количественного и качественного состава воды. 2. Изучить методы выявления кишечной палочки в воде. Задание 1. Ознакомиться с составом микрофлоры воды. Количественный и качественный состав микрофлоры воды зависит от вида источника , от степени его загрязнения Вода открытых водоемов более богата сапрофитными микробами , чем подземные воды Концентрация патогенных микроорганизмов в воде весьма незначительна и пребывание их в водоемах может быть кратковременным Безопасность воды в эпидемическом отношении определяется косвенными показателями : степенью общего 94 бактериального загрязнения и содержанием бактерий группы кишечной палочки как показателя фекального загрязнения воды Бактерии группы кишечной палочки (БГКП, также называются колиморфными и колиформными бактериями) — условно выделяемая по морфологическим и культуральным признакам группа бактерий семейства энтеробактерий, используемая санитарной микробиологией в качестве маркера фекальной контаминации, относятся к группе так называемых санитарно - показательных микроорганизмов. К бактериям группы кишечных палочек относят представителей родов Escherichia (в том числе и Е. coli ), Citrobacter (типичный представитель Citr. coli citrovorum), Enterobacter (типичный представитель Ent. aerogenes), которые объединены в одно семейство Enterobacteriaceae благодаря общности морфологических и культуральных свойств. А Б Рисунок 38 - Escherichia coli – внешний вид колоний на МПА (А) и среде Эндо (Б) Безопасность питьевой воды обусловлена не только фекальным загрязнением. Некоторые организмы размножаются в трубопроводных системах распределения воды (например, Legionella), а другие 95 встречаются в водоисточниках, и многие из них могут вызывать вспышки заболеваний. Безопасность питьевой воды в эпидемическом отношении определяется отсутствием в ней болезнетворных бактерий, вирусов и простейших микроорганизмов, ее соответствием нормативам по микробиологическим и паразитологическим показателям, представленным в таблице 2 Приложения к лабораторной работе № 7. Задание 2. Освоить методики определения микробного числа воды и выявления кишечной палочки. Определение общего микробного числа воды. Общая микробная обсемененность определяется количеством микроорганизмов, содержащихся в 1 мл воды. Исследуемую воду в зависимости от степени загрязнения разводят стерильной водопроводной водой 1:10, 1:100 и т.д. Затем по 1 мл из каждого разведения, начиная с большего, вносят в стерильные чашки Петри. В каждую чашку Петри выливают по 15 мл расплавленного и остуженного до 45 °C мясо - пептонного агара (МПА), равномерно распределяя содержимое по дну чашки. Остывшие чашки переворачивают вверх дном и помещают в термостат на 24 часа, после чего производят подсчет колоний. При малом количестве колоний счет ведут, помечая на дне чашки чернилами каждую сосчитанную колонию. Число выросших колоний соответствует количеству микроорганизмов в засеянном объеме воды. Результаты, посчитанные по отдельным чашкам, нужно сложить, а затем разделить на количество засеянных чашек. Полученное число и будет являться показателем общей микробной обсемененности воды. Водопроводная вода должна иметь микробное число, не превышающее 50 в 1 мл. 96 Определение наличия кишечной палочки в воде. Индикатором свежего фекального загрязнения воды является кишечная палочка, которая обладает большой устойчивостью во внешней среде. Результаты обнаружения кишечной палочки в воде регистрируются в виде коли - титра или коли - индекса. Коли - титр определяется тем количеством воды, в котором содержится одна кишечная палочка. Коли - индекс – количество особей кишечной палочки, которое содержится в 1 л воды. Методика определения кишечной палочки в воде основана на применении дифференциально - диагностических сред, к которым относится среда Эндо. Колонии энтеробактерий, сбраживающих лактозу , окрашиваются в малиново - красный цвет с металлическим блеском или без него. Колонии бактерий, не сбраживающих лактозу, имеют белый или слабо - розовый цвет. Учебная карта к лабораторной работе № 7 Работа выполняется в 2 этапа. Этап 1. Определить общее микробное число речной воды. 1. Взять пробу речной воды с соблюдением правил асептики. Из пробы берут пипеткой по 1 мл воды и соблюдая правила асептики вносят в отдельную чашку Петри, затем вливают в чашку расплавленный и остывший до 45 ◦ С МПА в количестве 15–20 мл. Чашку тотчас же начинают вращать по горизонтальной поверхности стола, равномерно распределяя МПА. После того, как агар застынет, чашку подписывают и оставляют до следующего занятия. 2. Определить присутствие кишечной палочки в пробах речной воды, воспользовавшись средой Эндо. Для этого внести на чашки со средой Эндо по 1 мл воды. Стерильным шпателем Дригальского равномерно распределить жидкость по поверхности среды. 97 Параллельно на чашку со средой Эндо нанести 1 мл водопроводной воды. Чашки подписать и оставить до следующего занятия. Этап 2. Произвести расчет общего микробного числа воды. Изучить культуральные и морфологические (форма бактерий, окраска по Граму) свойства микроорганизмов, выросших на чашках со средой Эндо. Наличие неспоровых грамотрицательных палочек, имеющих колонии красного цвета на среде Эндо, подтверждает их принадлежность к группе колиморфных бактерий. Результаты занести в таблицу 1. Таблица 1. Результаты по исследованию микрофлоры воды Речная вода Водопроводная вода ОМЧ (в 1 см 3 ) Количество колоний красного цвета на среде Эндо Форма клеток Окраска по Граму Коли - титр Коли - индекс Сделать обобщающий вывод по результатам исследования. Вопросы к лабораторной работе № 7. 1. Видовой состав микрофлоры воды. 2. Микробиологические показатели качества воды. 3. Морфологические, культуральные и биохимические свойства E. coli. 98 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 8 ВЗАИМООТНОШЕНИЯ МЕЖДУ МИКРООРГАНИЗМАМИ Цель занятия : изучить типы взаимоотношений между микроорганизмами Материалы и оборудование: среда МПА; пипетки; спички, карандаш по стеклу; иммерсионное масло; микроскоп; микробиологическая петля с петледержателем; спиртовка; предметные стекла; покровные стекла; шпатель Дригальского; стерильные чашки Петри; сверло. Задачи. 1. Ознакомиться с типами взаимоотношений между микроорганизмами. 2. Изучить методы определения антагонистической активности. Задание 1. Ознакомиться с типами взаимоотношений между микроорганизмами. В естественных условиях микроорганизмы существуют в сложных ассоциациях , внутри которых складываются разнообразные взаимоотношения , определяющиеся , в первую очередь , физиолого - биохимическими особенностями членов ассоциаций , а также различного рода экологическими факторами Взаимоотношения между микроорганизмами могут быть разделены на симбиотические ( симбиоз , метабиоз , сателлитизм , синергизм ) и конкурентные ( антагонизм , паразитизм , хищничество ). Симбиоз – взаимоотношения микроорганизмов , при которых два или более вида микроорганизмов при совместном развитии создают для себя взаимовыгодные условия Типичный пример таких взаимоотношений – совместное развитие аэробных и анаэробных 99 бактерий В кефирных зернах одновременно развиваются молочнокислые бактерии и дрожжи , при этом молочнокислые бактерии , испытывающие потребность в витаминах , получают их в результате развития дрожжей , последние получают благоприятные условия для развития за счет подкисления среды В некоторых случаях симбиотические взаимоотношения приводят к формированию так называемого консорциума, в котором клетки объединены как бы в один организм. Примером может служить консорциум Pelochromatium roseum. В центре консорциума находится относительная крупная подвижная бактерия Desulfotomaculum. На ее поверхности располагаются клетки зеленой серобактерии Chlorobium. В светлой зоне водоема в анаэробных условиях серобактерии обеспечивают поступление органического вещества и окисленной серы, а сульфатредуцирующая бактерия снабжает восстановителем. Примером симбиоза являются взаимоотношения цианобактерий и микроскопических грибов в лишайнике. Оба партнера лишайника способны к самостоятельному существованию, но в условиях чрезвычайного дефицита питательных веществ и крайних пределов увлажнения и высыхания, их ассоциация в лишайнике дает взаимный выигрыш. Польза, получаемая грибом от симбиоза в таких условиях, очевидна: он зависит от цианобактерии, как от источника органических питательных веществ. Кроме того, цианобактерии способны фиксировать атмосферный азот, который также используется грибом. Вклад гриба в ассоциацию состоит в том, что он облегчает поглощение воды и минеральных веществ, а также защищает фотосинтезирующего партнера от высыхания и избыточной интенсивности света. При метабиозе продукты жизнедеятельности одного микроорганизма, содержащие значительное количество энергии, потребляются другими микроорганизмами в качестве питательного 100 материала. Это почти всегда происходит при последовательном употреблении какого - либо субстрата. При использовании белковых субстратов в метабиозе последовательно могут принимать участие аммонификаторы, нитрификаторы и денитрификаторы. Между ними складываются синтрофные связи, при которых субстрат используется одновременно несколькими видами микробов. В частности, некоторые инфекционные заболевания человека являются полимикробными, т. е. вызываются синтрофными ассоциациями бактерий. Газовая гангрена, например, обусловлена действием нескольких возбудителей из рода Clоstridium в ассоциации с различными аэробными бактериями, главным образом, стафилококками и стрептококками. Разновидностью метабиоза является сателлитизм , для которого характерно, что одни микроорганизмы выделяют в среду ростовые вещества (аминокислоты, витамины и др.), стимулирующие развитие другого микроорганизма. При синергизме у членов микробной ассоциации взаимно повышается физиологическая активность за счет выделения продуктов, стимулирующих их развитие. Помимо благоприятных взаимоотношений между микроорганизмами наблюдаются и такие, при которых один вид микроорганизмов полностью или частично подавляет рост и развитие других видов, т. е. между ними при их развитии наблюдается антагонизм Причины, приводящие к антагонизму, разнообразны: 1. Антагонизм, складывающийся при совместном развитии разных видов, нуждающихся в одних и тех же питательных веществах. В этом случае преимущества будут у того микроорганизма, скорость роста которого выше скорости роста других. Так, при совместном высеве на питательный субстрат, необходимый одновременно для роста и эубактерий и актиномицетов, эубактерии будут развиваться быстрее. 2. Антагонизм, связанный с образованием микроорганизмами органических кислот, спиртов, сидерофоров (флуоресцирующие 101 водорастворимые пигменты) или других продуктов обмена, которые изменяют условия среды, делая ее непригодной для развития других микроорганизмов. В процессе смены микрофлоры свежего молока в нем содержатся как молочнокислые, так и гнилостные бактерии. Сначала они развиваются одинаково, но в результате размножения молочнокислых бактерий накапливается молочная кислота и молоко значительно подкисляется. В этих условиях наблюдается подавление роста, а затем и полная гибель гнилостных бактерий. 3. Антагонизм, связанный с образованием и выделением в окружающую среду антибиотических веществ (антибиотиков, бактериоцинов и др.) Процесс хищничества состоит в том, что некоторые микроорганизмы разрушают клетки других видов микроорганизмов и используют их в качестве питательного субстрата. К числу микроорганизмов - хищников относят, главным образом, миксоформы (миксобактерии, миксомицеты ). Паразитизм характеризуется тем, что один вид микроорганизмов (паразит) поселяется в клетках другого (хозяина) и питается за его счет. Облигатные паразиты не могут развиваться в отсутствие хозяина. Бактерии - паразиты утратили способность синтезировать многие вещества; они получают их в готовом виде за счет своего хозяина. Случаи паразитизма в мире микроорганизмов относительно редки. Так, бактерии Metallogenium, состоящие из тонких нитей, пропитанных окислами железа и марганца, часто паразитируют на клетках или колониях бактерий, водорослей, грибов. К паразитам могут быть отнесены грамотрицательные бактерии Bdellovibrio. Бделловибрионы проникают в периплазматическое пространство грамотрицательных бактерий и используют в качестве пищи продукты их метаболизма. К типичным паразитам относятся бактериофаги. 102 Наиболее существенной формой конкурентных взаимоотношений, имеющей важное практическое использование, является образование микробами - продуцентами специфических продуктов обмена, угнетающих или полностью подавляющих развитие микроорганизмов других видов. Задание 2. Освоить методы определения антагонистической активности микроорганизмов. Для выделения микробов - антагонистов из естественных мест обитания применяют разнообразные методы. В основу большинства методов положен принцип выделения чистой культуры микроорганизма - продуцента антибактериального вещества и непосредственного его испытания по отношению к используемым тест - организмам. Микроорганизмы - продуценты выделяют из субстратов, где активно развиваются бактерии, дрожжи, мицелиальные грибы. Например, на поверхность питательной среды, предварительно засеянной тест - организмом, петлей наносят взвесь почвы. Через 48 – 72 часа инкубирования, формируются колонии и вокруг некоторых наблюдаются зоны задержки роста тест - организма. Такие колонии отбирают и исследуют далее. При определении же антагонистической активности данного штамма основной принцип заключается в создании условий для совместного культивирования антагонистов на агаризованных или в жидких питательных средах. Существует множество методических приемов, обеспечивающих решение данной задачи. При использовании метода перпендикулярных штрихов на поверхность агаризованной среды в чашке Петри засевают штрихом исследуемый микроб - антагонист, продуцирующий антибактериальное вещество. Посев делают по диаметру чашки, которую затем помещают в термостат при температуре, оптимальной для роста. 103 Продолжительность культивирования определяется скоростью роста антагониста. После завершения роста и диффузии продуцируемого вещества в агаризованную среду, перпендикулярно к выросшему штриху, подсевают штрихами тест - культуры, начиная от краев чашки. Чашки помещают в термостат на 48 часов. Если изучаемый микроорганизм - антагонист образует диффундирующее в среду вещество, оказывающее антимикробное действие в отношении тест - культур, то рост последних будет начинаться на некотором расстоянии от роста самого антагониста. Чем больше это расстояние, тем более чувствительна тест - культура к продуцируемому антибиотическому веществу. Нечувствительные микроорганизмы будут развиваться в непосредственной близости от штриха (рис. 39 ). |