ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ ПО МИКРОБИОЛОГИИ. Учебном пособии представлены лабораторные работы по микробиологии для студентов педагогических университетов по специальностям 1
 Скачать 4.85 Mb.
|
|
Учебная карта к лабораторной работе № 2 Ознакомиться со строением клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Изучить теоретические основы метода Грама. Подготовить препараты бактерий и окрасить по методу Грама. Промикроскопировать. Результаты занести в таблицу 1. Таблица 1. Окраска по методу Грама Бактериальная культура Внешний вид препарата при микроскопировании Результат по Граму 1. 2. 46 Приготовить препараты бацилл и провести окрашивание с целью выявления спор. Промикроскопировать. Результаты занести в таблицу 2. Таблица 2. Выявление спорообразования Культура бацилл Внешний вид препарата при микроскопировании Результат анализа (споры выявлены/не выявлены) 1. 2. Приготовить препараты бацилл и провести окрашивание с целью выявления гликогена. Промикроскопировать. Результаты занести в таблицу 3. Таблица 3. Выявление гликогена Культура бацилл Внешний вид препарата при микроскопировании Результат анализа (гликоген выявлен/не выявлен) Сделать обобщающий вывод по результатам исследования морфологии изученных микроорганизмов. Вопросы к лабораторному занятию № 2. 1. В чем различия в строении клеточной стенки у грамположительных и грамотрицательных бактерий? 2. В чем состоит теоретическая основа метода окраски бактерий по Граму? 3. В чем состоит основа методов выявления спор у бактерий? 4. Какие включения характерны для бактерий? 47 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3 МОЛОЧНОКИСЛОЕ БРОЖЕНИЕ БАКТЕРИЙ Цель занятия. Изучить свойства микроорганизмов, осуществляющих молочнокислое брожение. Материалы и оборудование: молочнокислые продукты, спички, карандаш по стеклу; иммерсионное масло; микроскоп; микробиологическая петля с петледержателем; спиртовка; предметные стекла; покровные стекла; прибор для окрашивания и промывания мазков; полоски фильтровальной бумаги; реактивы для окраски микробиологических препаратов; реактив Никифорова. Задачи. 1. Ознакомиться с основными видами микроорганизмов, осуществляющими молочнокислое брожение. 2. Изучить состав микроорганизмов молочнокислых продуктов. Задание 1. Ознакомиться с основными типами молочнокислого брожения и микроорганизмами, осуществляющими молочнокислое брожение. Молочнокислое брожение — процесс анаэробного окисления углеводов, конечным продуктом которого является молочная кислота Молочнокислые бактерии относятся к родам Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus. Хотя эта группа морфологически гетерогенна (включает длинные и короткие палочки, кокки), в физиологическом отношении ее можно охарактеризовать достаточно хорошо. Все относящиеся к ней бактерии грамположительны, не образуют спор (за исключением Sporolactobacillus inulinus) и в подавляющем большинстве неподвижны. Все они используют в качестве источника энергии углеводы и выделяют молочную кислоту. 48 В отличие от Enterobacteriaceae , тоже образующих лактат, молочнокислые бактерии способны только к брожению; они не содержат гемопротеинов (таких, как цитохромы и каталаза). Микроорганизмы рода Lactobacteriaceae являются факультативными анаэробами, они могут расти в присутствии кислорода воздуха (аэротолерантность). Потребность в факторах роста. Отличительный признак молочнокислых бактерий - это их потребность в ростовых веществах. Молочнокислые бактерии являются ауксотрофами, большинство из них нуждается в ряде витаминов и аминокислот, а также в пуринах и пиримидинах. С другой стороны, многие из них обладают способностью, которой нет у большинства микроорганизмов: они могут утилизировать молочный сахар (лактозу). Распространение и места обитания. Распространение молочнокислых бактерий в природе определяется их сложными потребностями в питательных веществах и способом получения энергии (брожение). Эти бактерии почти никогда не обнаруживаются в почве или водоемах. В естественных условиях они встречаются: а) в молоке, местах его переработки и молочных продуктах (Lactobacillus lactis, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, L. helveticus, L. casei, L. fermentum, L.brevis; Streptococcus lactis, S. diacetilactis); б ) на растениях и на разлагающихся растительных остатках (Lactobacillus plantarum, L. fermentum, L. brevis; Streptococcus lactis); в) в кишечнике и на слизистых оболочках человека и животных (Lactobacillus acidophilus; Bifidobacterium и др.). Благодаря образованию больших количеств молочной кислоты, к которой сами они в значительной степени толерантны, молочнокислые бактерии при подходящих условиях могут довольно быстро размножаться, вытесняя другие микроорганизмы. По этой 49 причине их легко культивировать на элективных средах и легко выделять. Естественные накопительные культуры этих бактерий содержатся в кислом молоке и молочных продуктах, кислом тесте, кислой капусте, силосе и т.п. Катаболизм углеводов и продукты брожения. Различают гомоферментативное и гетероферментативное молочнокислое брожение, в зависимости от выделяющихся продуктов помимо молочной кислоты и их процентного соотношения. Отличие также заключается и в разных путях получения пирувата при деградации углеводов гомо - и гетероферментативными молочнокислыми бактериями. Гомоферментативное молочнокислое брожение. При гомоферментативном молочнокислом брожении углевод сначала окисляется до пирувата по гликолитическому пути, затем пируват восстанавливается до молочной кислоты при помощи лактатдегидрогеназы. Продуктом гомоферментативного молочнокислого брожения является молочная кислота, которая составляет не менее 90 % всех продуктов брожения. Примеры гомоферментативных молочнокислых бактерий: Lactobacillus casei, L. acidophilus, Streptococcus lactis (таблица 2). Таблица 2 - Молочнокислые бактерии, сгруппированные по форме клеток и по типу брожения Кокки Палочки Гомоферментативное брожение: С 6 H 12 O 6 → 2 C Н 3 - С HOH-COOH Streptococcus lactis S. faecalis S. salivarius S.cremoris S. thermophilus S. diacetilactis Pediococcus cerevisiae Термобактерии (температурный оптимум 40ºС, при 15 ºС не растут) Lactobacillus lactis L. acidophilus Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Стрептобактерии ( температурный 50 оптимум 30-37 ºС ; при 15 ºС растут ) Lactobacillus casei L. plantarum Sporolactobacillus inulinus Гетероферментативное брожение : С 6 H 12 O 6 → CН 3 - С HOH-COOH + C Н 3 - С H 2 OH+CO 2 ( или CH3-COOH) Leuconostoc mesenteroides L. cremoris Lactobacillus brevis L. fermentum Bifidobacterium bifidum Гетероферментативное молочнокислое брожение. В отличие от гомоферментативного брожения, деградация глюкозы идет по пентозофосфатному пути, образующийся из ксилулозо -5- фосфата глицеральдегид -3- фосфат окисляется до молочной кислоты, а ацетилфосфат восстанавливается до этанола (некоторые гетероферментативные молочнокислые бактерии окисляют полученный этанол частично или полностью до ацетата). Таким образом, при гетероферментативном молочнокислом брожении образуется больше продуктов: молочная кислота, уксусная кислота , этанол , двуокись углерода. Примеры гетероферментативных молочнокислых бактерий: L. fermentum, L. brevis, Leuconostoc mesenteroides. Применение молочнокислых бактерий в сельском хозяйстве и производстве пищевых продуктов. На молочнокислом брожении основано получение многих пищевых продуктов, а также производство силоса для нужд животноводства. Приготовление силоса. Молочнокислые бактерии, обитающие на растениях, играют большую роль при запасании впрок кормов для скота. Для приготовления силоса используют листья сахарной свеклы, кукурузу, картофель, травы и люцерну. Растительную массу прессуют и прибавляют к ней мелассу, чтобы повысить отношение C/N, муравьиную или какую - либо неорганическую кислоту, чтобы заранее 51 обеспечить преимущественный рост лактобацилл и стрептококков. В таких условиях происходит контролируемое молочнокислое брожение. Приготовление кислой капусты. Кислая капуста тоже представляет собой продукт, в приготовлении которого участвуют молочнокислые бактерии. В мелко нарезанной, посыпанной солью (2 - 3%) и спресованной белокочанной капусте при исключении доступа воздуха начинается молочнокислое брожение, в котором принимает участие сначала Leuconostoc (с образованием С0 2 ), а позднее Lactobacillus plantarum. Молочные продукты. Молочнокислые бактерии, образующие кислоту и придающие продуктам определенный вкус, находят широкое применение в молочной промышленности. Стерилизованное или пастеризованное молоко или же сливки сбраживают, прибавляя в качестве закваски чистые («стартовые») культуры молочнокислых бактерий (табл. 3 ). Таблица 3 – Микробные закваски и условия получения основных молочнокислых продуктов Молочный продукт Культура, входящая в состав закваски Температура инкубации, ºС Продолжитель - ность инкубации, ч Сметана, пахтанье Streptococcus lactis S.diacetilactis S.cremoris Leuconostoc cremoris 22 18 Йогурт Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus S. thermophilus 43-45 2,5 - 3 Простокваша Streptococcus lactis S.diacetilactis S.cremoris 30-35 6-8 Простокваша Мечниковская Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus Streptococcus lactis 40-45 3-5 52 S.diacetilactis S.cremoris Кефир, кумыс Lactobacillus lactis Lactobacillus brevis Lactobacillus kefir Lactobacillus kefiranofaciens Streptococcus дрожжи Saccharomyces lactis и рода Torulopsis, уксуснокислые бактерии 15 - 22 24 - 36 Творог Streptococcus lactis S.cremoris Leuconostoc cremoris 22 (35) 18 (5) Ряженка Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus S. thermophilus 40-45 2,5-3 Йогурт получают из пастеризованного гомогенизированного цельного молока, инокулированного Streptococcus thermophilus и Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus (после внесения закваски молоко выдерживают 2 - 3 ч при 43 - 45°С). Под названием биойогурт в продажу поступает кислое молоко, сквашенное Lactobacillus acidophilus и Streptococcus thermophilus. Закваску кефира готовят на так называемых «кефирных зернах», которые состоят из не полностью изученного сообщества организмов, включающего лактобациллы, стрептококки, микрококки и дрожжи. Полезные для здоровья человека свойства молочнокислых бактерий впервые описаны И. И. Мечниковым. В настоящее время широко используется понятие «пробиотик» для обозначения живых микроорганизмов (преимущественно молочнокислых бактерий), употребление которых с пищей в достаточных количествах оказывает благоприятное действие на здоровье. В составе пробиотических кисломолочных продуктов активно используются бифидобактерии. 53 Бифидобактерии — это облигатная и доминирующая часть кишечной микрофлоры здорового человека и теплокровных животных. Она проявляет антагонистическую активность по отношению к патогенным, условно - патогенным и нежелательным микроорганизмам в кишечнике. В настоящее время идентифицировано 24 вида бифидобактерий (от лат. bifidus - раздвоенный, расщепленный надвое), объединенных в род Bifidobacterium. Наиболее изученными видами бифидобактерий являются: B. bifidum, B. adolescentis, B. longum, B. infantis, B. pseudolongum, B. thermophilum и др. Типовой вид – B. bifidum. Морфология бифидобактерий. Бифидобактерии представляют собой чрезвычайно вариабельные по форме палочки - прямые, изогнутые, разветвленные, раздвоенные Y - или V - формы, булавовидные, лопатовидные. Клетки располагаются одиночно, парами, иногда цепочками или розетками, размер клеток 0,5–1,3 х 1,5– 8 мкм. Грамположительные, не образуют спор и капсул, неподвижные. Микроскопическая картина каждого вида бифидобактерий имеет особенности по размеру, форме и расположению клеток. При выращивании культур бифидобактерий на печеночном агаре или в молоке ветвление исчезает, клетки становятся грамвариабельными, слабее окрашиваются кислыми и щелочными красителями, появляется много гранулированных форм, которые иногда можно принять за кокки. Грануляция у бифидобактерий наблюдается также в средах с высоким содержанием сухих веществ. В молоке бифидобактерии развиваются медленно, так как коровье молоко не является естественной средой их обитания. Одной из причин плохого роста бифидобактерий в молоке служит растворенный в нем кислород. У них не обнаружено казеолитической активности, т.е. они могут усваивать казеин только после частичного 54 гидролиза. В результате расщепления казеина образуются полипептиды, гликопептиды, аминосахара, стимулирующие рост бифидобактерий. Рост бифидобактерий в коровьем молоке стимулируют экстракты дрожжей, гидролизованное молоко, а также увеличение соотношения белок: лактоза. Задание 2. Приготовить и окрасить мазки из молочнокислых продуктов соотнеся результат микроскопирования с составом заквасок. На предметных стеклах приготовить тонкие препараты мазки молочнокислых продуктов, подсушить их на воздухе, а затем нанести несколько раз смесь Никифорова. Последнюю порцию смеси оставить на препарате до высыхания. Фиксированные мазки окрасить метиленовой синью Леффлера в течение 3–5 мин, промыть водой, просушить фильтровальной бумагой и микроскопировать. Для выявления микроорганизмов рода Leuconostoc провести исследование по методу Бурри - Гинса. МЕТОДИКА ОКРАСКИ КАПСУЛ ПО МЕТОДУ БУРРИ - ГИНСА (модифицированная ) 1. На предметное стекло наносят каплю водного раствора фуксина, в которую с помощью стерильной петли вносят исследуемую культуру бактерий. 2. Рядом с первой каплей помещают каплю туши. Правой рукой приставляют шлифованное стекло узким краем к стеклу слева от капель под углом 45°. 3. Продвигают шлифованное стекло вправо до соприкосновения с каплей. 4. Затем быстрым движением справа налево делают мазок. Капля должна быть небольшой и соразмерена так, чтобы весь мазок помещался на стекле, не доходя 1—1,5 см до его края. Нельзя 55 прекращать размазывание и отнимать стекло раньше, чем капля будет исчерпана. 5. Мазок высушивают на воздухе. 6. Микроскопируют. На темно - дымчатом фоне препарата видны розовые клетки микроорганизмов, окруженные бесцветной капсулой. Задание 3. Для выявления молочной кислоты, образовавшейся в результате жизнедеятельности молочнокислых бактерий, провести качественную реакцию Уффельмана. В 2 пробирки внести по 10 мл 5% раствора фенола и прибавить не c колько капель слабого раствора хлорного железа. Получается интенсивно - синий раствор хлорного железа. От прибавления нескольких капель продукта, содержащего молочную кислоту, в пробирку № 1, раствор становится желтоватым, тогда как в пробирке № 2, куда вносятся несколько капель воды, окраска раствора не меняется. Задание 4. Провести исследование на наличие активности каталазы. Для выявления активности каталазы на предметное стекло наносят каплю 5% раствора перекиси водорода. В нее помещают бактериальной петлей каплю молочнокислого продукта и тщательно перемешивают. При наличии у микроорганизмов каталазы происходит разложение перекиси водорода с выделением пузырьков кислорода. Учебная карта к лабораторной работе № 3 Ознакомиться с основными типами молочнокислого брожения и микроорганизмами, осуществляющими молочнокислое брожение. Подготовить мазки из молочнокислых продуктов, окрасив их метиленовой синью Леффлера. Результаты занести в таблицу 1. 56 Таблица 1. Морфология микроорганизмов молочнокислого брожения Молочнокислый продукт Внешний вид препарата при микроскопировании Вывод о предполагаемой таксономической принадлежности обнаруженных микроорганизмов 1. 2. Провести исследование образцов сметаны и творога на наличие микроорганизмов рода Leuconostoc . Результаты занести в таблицу 2. Таблица 2. Обнаружение капсулообразующих микроорганизмов молочнокислого брожения Молочнокислый продукт Внешний вид препарата при микроскопировании Результат анализа (капсулы выявлены/не выявлены) 1. 2. Провести реакцию Уффельмана на присутствие молочной кислоты. Провести реакцию с перекисью водорода для выявления активности каталазы в молочнокислом продукте. Таблица 3. Определение активности каталазы Молочнокислый продукт Результат анализа (активность каталазы выявлена/не выявлена) Сделать обобщающий вывод по результатам исследования изученных молочнокислых продуктов. |