ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ ПО МИКРОБИОЛОГИИ. Учебном пособии представлены лабораторные работы по микробиологии для студентов педагогических университетов по специальностям 1
 Скачать 4.85 Mb.
|
|
ауксотрофными по соответствующим соединениям. Среды классифицируют: по происхождению (исходным компонентам), консистенции, назначению (таблица 1). 81 Таблица 4 - Классификация питательных сред СРЕДЫ ПИТАТЕЛЬНЫЕ По составу (происхожде - нию) Естествен - ные Молоко, картофель Искусствен - ные Среда Эндо, Гисса, МПА Синтетические Среда Козера (для цитратассимилирующих бактерий), Ван - Интерсона (для дрожжей и плесневых грибов) По консистенции Жидкие для накопле - ния биомассы Полужидкие для хранения культур (0,15-0,5% агара) Плотные для выделения, изучения морфологии, количественного учета (2% агара) Сыпучие (пшено, кварцевый песок, пропитанный питательным раствором) По назначению Обычные (простые) МПА, МПБ, пептонная вода, бульон Хоттингера Специальные Для выделе - ния и куль - тивирования отдельных групп микро - организмов ( среда Чапека – для грибов, МПБ с глюко - зой – для стрептококков) Элек - тивные Для вы - деления опреде - ленного микро - организ - ма из мест его обита - ния Селек - тивные Для вы - ращива - ния опреде - ленного вида микро - орга - низмов Нако - питель ные для по - луче - ния накопи - тель - ных куль - тур Диффе - ренци - ально - диагно - стичес - кие Для диф - ференци - ровки од - ного вида от других Элективные среды обеспечивают преимущественное развитие одного или целой физиологической группы микроорганизмов. Например, для выделения стафилоккоков в среду может быть добавлен хлористый натрий в концентрации 7,5 %. При этой концентрации рост других бактерий подавляется. Элективные среды применяются на первом этапе выделения чистой культуры бактерий, т.е. при получении накопительной культуры. Дифференциально - диагностические среды применяются для быстрой идентификации близкородственных видов микроорганизмов, для определения видовой принадлежности, в клинической бактериологии и др. Принцип построения дифференциально - диагностических сред основан на том, что разные виды бактерий различаются между собой по 82 биохимической активности и имеют неодинаковый набор ферментов, расщепляющих субстраты, входящие в состав питательной среды. В состав дифференциально - диагностической среды входят: а) основная питательная среда, обеспечивающая размножение бактерий; б) определенный химический субстрат, отношение к которому является диагностическим признаком для данного микроорганизма; в) цветной индикатор, изменение окраски которого свидетельствует о биохимической реакции и наличии данной ферментной системы у исследуемого микроорганизма. Например, среда Эндо позволяет отличить микроорганизмы, сбраживающие лактозу от микроорганизмов, не обладающих этим свойством. Основными компонентами этой среды являются питательный агар, углевод и основной фуксин, обесцвеченный сульфитом (реактив Шиффа). Исходная питательная среда окрашена в розовый цвет. Микроорганизмы, не сбраживающие лактозу, образуют бесцветные колонии. При сбраживании лактозы до ацетальдегида последний реагирует с сульфитом и развивается красная окраска соответствующих колоний. По консистенции среды могут быть жидкими, полужидкими, твердыми, сыпучими. Жидкие питательные среды получают при растворении в воде определенного необходимого набора питательных веществ, макро - и микроэлементов. Приготовление твердых питательных сред достигается добавлением к жидким средам определенных уплотнителей, в качестве которых могут выступать агар, желатин, силикагель Наиболее важным преимуществом использования твердых сред является то, что на них можно выращивать микроорганизмы в виде колоний, образующихся из отдельных клеток популяции. Наиболее распространенным из уплотнителей является агар – полисахарид, выделяемый из красных морских водорослей. Он обладает рядом полезных свойств, в 83 частности: 1) способен образовывать в воде гели; 2) плавится при температуре 100 °С и затвердевает при 45 °С; 3) не расщепляется под влиянием ферментов большинства видов микроорганизмов; 4) термолабильные вещества и живые микроорганизмы не разрушаются при добавлении к нагретому до 45 °С расплавленному агару, если смесь сразу же охладить; 5) агаровые гели имеют высокую степень прозрачности; 6) обычно используемые концентрации 1,5 - 2,0 % являются относительно невысокими и их использование экономично. Полужидкие среды содержат гелеобразующее вещество в низкой (0,3 – 0,7 %) концентрации и имеют мягкую желеподобную консистенцию. Такие среды пригодны для изучения подвижности и хемотаксиса клеток, культивирования микроаэрофилов. Сыпучие среды представляют собой массу в той или иной степени измельченного и увлажненного сырья (чаще всего, растительного). Основное их назначение – использование в пищевой промышленности (получение соевого соуса), сельском хозяйстве (силосование кормов) и т. д. Задание 2. Изучить методы стерилизации, применяемые в микробиологии. Деконтаминация - полное или частичное удаление микроорганизмов с объектов внешней среды и биотопов человека с помощью факторов прямого повреждающего действия Деконтаминацию осуществляют дезинфекцией или стерилизацией. Дезинфекция – комплекс мер по уничтожению возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных с применением антимикробных средств. Стерилизация является одним из важнейших и необходимых приемов в микробиологической практике. Под стерилизацией понимают совокупность физических и химических способов полного освобождения объектов от вегетативных и 84 покоящихся форм микроорганизмов По характеру действия методы стерилизации делятся на физические, химические и механические. Таблица 5 - Методы стерилизации в микробиологии Физические Химические Механическ ие Стерилизация высокой температурой - прокаливание в пламени - сухим жаром (сухожаровой шкаф) - кипячение (20 - 30 мин) - текучим паром (температура 100ºС) - тиндализацией (70 - 80 ºС 3 раза по 60 мин с выдерживанием при 18 - 37 ºС) - паром под давлением (автоклавирование) (120 ºС 20 мин) Газовая стерилизация (формальдегидом, окисью этилена, надуксусной кислотой, бромидом метила, смесью ОБ) Фильтрова - нием через специаль - ные фильтры Аэрозольная стерилизация (перекись водорода перекись водорода и молочная кислота) Стерилизация УФ - облучением Стерилизация ионизирующим излучением Обработка жидкими антисептиками Стерилизация ультразвуком Задание 3. Изучить технику посева микроорганизмов Работы по посеву микроорганизмов проводятся с соблюдением правил асептики. Асептика в микробиологии – комплекс мероприятий, направленных на предупреждение попадания микроорганизмов из окружающей среды в материал для исследования, питательные среды и культуры микроорганизмов при лабораторных условиях. Материалом для посева могут быть пересеваемые культуры бактерий, вода, почва, продукты питания и др. Жидкий материал для посева берут петлей или пипеткой. При взятии петлей жидкость должна образовать в кольце петли тонкую прозрачную пленку - “зеркало”. Пипетками пользуются в том случае, когда материал засевают в большом или точно отмеряемом объеме. Способ взятия плотного материала определяется его консистенцией. При посевах чаще всего пользуются бактериальной петлей. Все манипуляции, связанные с посевом и выделением микробных культур, производят над пламенем горелки. После посева на чашках Петри со стороны 85 дна, на пробирках в верхней трети надписывают название засеянного материала и дату посева. Техника посевов на плотные и жидкие питательные среды: 1. При посеве в жидкую питательную среду петлю с находящимся на ней материалом погружают в среду. Если материал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. Жидкий материал, набираемый в пастеровскую или градуированную пипетку, вливают в питательную среду. 2. При посеве на поверхность плотной питательной среды в чашки Петри чашку держат в левой руке. Дно ее с одной стороны придерживают I и II пальцами, а с другой —IV и V пальцами. Крышку, приоткрытую настолько, чтобы в образовавшуюся щель свободно проходили петля или шпатель, фиксируют I- ым и III - им или I- ым и II - ым пальцами. Небольшое количество исследуемого материала втирают бактериальной петлей в поверхность питательной среды у края чашки. Затем петлю прожигают, чтобы уничтожить избыток находящегося на ней материала. Линию посева начинают с того места, в котором находится материал. Бактериальную петлю кладут плашмя на питательную среду, чтобы не поцарапать ее поверхности, и проводят штрихи по всей среде или по секторам, разграфив предварительно дно чашки (при условии, что среда прозрачна) на несколько равных частей. При этом надо стараться, чтобы штрихи, наносимые петлей, располагались как можно ближе друг к другу, так как это удлиняет общую линию посева. Для равномерного распределения засеваемого материала по поверхности плотной питательной среды можно пользоваться вместо петли шпателем. При обилии в засеваемом материале микроорганизмов они растут в виде пленки, покрывающей всю поверхность питательной среды. Такой характер микробного роста получил название 86 сплошного, или газонного. Посев газоном производят, когда нужно получить большие количества микробной культуры одного вида. Из материала, подлежащего посеву в толщу плотной питательной среды, готовят взвесь в стерильной водопроводной воде или в изотоническом растворе. Набирают 0,1—1 мл взвеси в пипетку (в зависимости от степени предполагаемого микробного загрязнения) и выливают в пустую стерильную чашку Петри. Вслед за этим чашку заливают 15 – 20 мл мясопептонного агара, расплавленного и остуженного до температуры 40 – 45 °С. Для равномерного распределения исследуемого материала в питательной среде закрытую чашку с содержимым слегка вращают по поверхности стола. 3. При посеве на скошенный мясопептонный агар («косяк») пробирку берут в левую руку между I и II пальцами, чтобы основание пробирки находилось на поверхности кисти руки и посев осуществлялся под контролем глаза. Пробку из пробирки вынимают правой рукой V и IV пальцами, не прикасаясь к той части пробки, которая входит внутрь пробирки. Остальные 3 пальца правой руки остаются свободными для взятия бактериальной петли, посредством которой производится посев. Петлю держат, как писчее перо. После вынимания пробки пробирку с питательной средой держат в наклонном положении во избежание попадания в нее посторонних микроорганизмов из воздуха. Петлю с находящимся на ней пересеваемым материалом вводят в пробирку до дна, опускают плашмя на поверхность питательной среды и скользящими движениями наносят штрих снизу вверх, от одной стенки пробирки к другой. Задание 4. Ознакомиться с методами выделения чистых культур микроорганизмов Выделение чистой культуры включает три этапа: 87 получение накопительной культуры, выделение чистой культуры, определение чистоты выделенной культуры. Получение накопительной культуры Накопительными называют такие культуры, в которых преобладают микроорганизмы одной группы или даже одного вида. С целью получения накопительных культур создают элективные (избирательные) условия, обеспечивающие преимущественное развитие выделяемых микроорганизмов. При создании элективных условий следует учитывать неодинаковое отношение микроорганизмов к аэрации, температуре, кислотности среды и т.д. При получении накопительных культур следует учитывать и такие особенности выделенных форм, как подвижность, спорообразование, устойчивость к антибиотикам и т.д. Следует иметь ввиду, что элективные условия далеко не всегда оптимальны для роста выделяемого микроорганизма, однако они лучше переносятся им, чем сопутствующими формами. Получение чистой культуры Чистой культурой микроорганизмов называют популяцию микроорганизмов одного вида, полученную из изолированной микробной колонии. Под колонией подразумевается потомство бактерий, возникающее в результате размножения одной микробной клетки. Выделение чистой культуры микроорганизмов является обязательным этапом всякого бактериологического исследования. Чистая культура необходима для изучения морфологических, культуральных, биохимических и антигенных свойств, по совокупности которых определяется видовая принадлежность исследуемого микроорганизма. Для выделения чистых культур микроорганизмов из материалов, содержащих обильную смешанную микрофлору, предложено много различных методов (таблицы 6 и 7). 88 Таблица 6 - Методы выделения чистых культур аэробных микроорганизмов Основанные на принципе механического разделения микроорганизмов Основанные на биологических свойствах микроорганизмов Рассев шпателем по Дригальскому (на трех чашках Петри) Метод Шукевича (для подвижных форм микроорганизмов в конденсационную воду) Рассев штрихами в 3 - х секторах Метод прогревания (для бацилл) Метод фильтрации (через специальные фильтры – для отделения вирусов от бактерий) Бактериостатический метод (небольшие концентрации пенициллина задерживают рост грамположительных мироорганизмов и не влияют на грамотрицательные) Рассев методом истощающего штриха Метод заражения лабораторных животных или растений Метод обогащения (засев на элективные среды, способствующие росту определенного вида микроорганизмов) Получение чистой культуры методом рассева в глубине среды (по Коху) Таблица 7- Методы выделения чистых культур анаэробных микроорганизмов физические химические биологические Посев в глубину плотных питательных сред Поглощение кислорода пирогаллолом или гидросульфитом натрия для обеспечения преимущественного развития анаэробов Совместное выращивание анаэробов со строгими аэробами Механическое удаление воздуха из сосудов для культивирования Замена воздуха инертным газом Посев в среды, содержащие легко окисляемые и редуцирующие вещества Чаще всего это делают путем изолирования отдельных клеток на твердой питательной среде, используя метод посева штрихом. Посев штрихом. Существует много методов посева штрихом в чашки с твердыми средами (“штрихованные чашки”), но лишь некоторые из них почти всегда дает хорошо изолированные колонии 89 даже при отсутствии навыков у экспериментатора. К такому методу относится посев штрихом на три сектора (рис. 36). Рисунок 36 - Метод посева штрихом в чашки для получения отдельных колоний (на 3 сектора) А. Для маркировки на обратной стороне чашки Петри карандашом наносят букву Т, разделяющую дно на 3 сектора. Б. Петлей с культурой зигзагом наносят штрихи на поверхности агара в секторе 1, как показано на рисунке. Для этого крышку чашки сначала приподнимают, а после нанесения штриха сразу закрывают. Петлю стерилизуют в пламени и дают ей остыть (15 с). В. Проводят петлей по поверхности среды в секторе 1, как показано на рисунке В, и затем немедленно наносят ею зигзагом штрихи на поверхности среды в секторе 2 (Г). Прогревают петлю в пламени и дают ей остыть. Г. Проводят петлей по поверхности среды в секторе 2 и затем наносят ею зигзагом штрихи на поверхности среды в секторе 3 (Д). Инкубируют опрокинутые вверх дном чашки, как показано на рисунке, для того чтобы конденсирующаяся вода с крышки не попала на поверхность агара. В секторе 1 вырастает большое число колоний, тогда как в секторах 2 и 3 появляются отдельные хорошо изолированные колонии (Е) Получение чистой культуры методом рассева в глубине среды (по Коху). Три пробирки, содержащие по 15 мл мясопептонного агара, ставят в водяную баню для расплавления агара. Расплавленную 90 среду остужают до температуры 43— 45°С. В пробирку вносят одну бактериальную петлю исследуемого материала. Для лучшего перемешивания материала со средой засеянную пробирку вращают несколько раз, зажав между ладонями. После этого прокаленной и остуженной петлей содержимое 1 - й пробирки переносят во 2 - ю и таким же образом из 2 - й в 3 - ю. Приготовленные разведения микробов выливают из пробирок в стерильные чашки Петри, обозначенные номерами, соответствующими номерам пробирок. После застудневания среды с исследуемым материалом чашки помещают в термостат. Количество колоний в чашках с питательной средой уменьшается по мере разведения материала. Выделение чистой культуры по способу Дригальского . Расплавленную питательную среду разливают в три чашки Петри. В первую чашку вносят одну каплю исследуемого материала и стерильным шпателем втирают его в поверхность питательной среды. Далее, не прожигая шпателя и не набирая нового материала, шпатель переносят во вторую и третью чашки, втирая в поверхность питательных сред оставшийся на нем материал. Метод рассева по поверхности, предложенный Дригальским, является наиболее употребительным для получения чистой культуры микробов. Вместо шпателя можно пользоваться петлей. Выделение чистой культуры методом истощающего штриха предполагает высев бактериологической петлей из накопительной культуры на поверхность агаризованной среды в чашках Петри На первом этапе петлей с культурой наносят ряд параллельных штрихов на агаризованной среде ( рис . 37, А ). Петлю стерилизуют , остужают о незасеянную часть агаризованной среды и проводят серию штрихов в направлении , перпендикулярном первым ( рис . 37, Б ). Затем петлю 91 вновь стерилизуют , остужают и штрихи наносят в направлении В ( рис 37), а после очередной стерилизации – в направлении Г Чашки помещают в термостат и через определенное время учитывают результаты Обычно на штрихах А и Б вырастает большое число колоний ( иногда сплошной рост ), тогда как на штрихах В и Г формируются изолированные колонии |