ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ ПО МИКРОБИОЛОГИИ. Учебном пособии представлены лабораторные работы по микробиологии для студентов педагогических университетов по специальностям 1
 Скачать 4.85 Mb.
|
|
в течение 5 минут оседает столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л воздуха. 2 Аспирационный метод основан на активном просасывании воздуха через специальные приборы (этот метод дает возможность определить не только качественное, но и количественное содержание бактерий). Индикаторные микроорганизмы санитарного состояния воздуха . К санитарно - показательным микроорганизмам воздуха относят золотистый стафилококк, стрептококки, грамотрицательные бактерии и грибы. В воздухе больничных помещений доминируют золотистый стафилококк и стрептококки. Соотношение микроорганизмов составляет в среднем 70 и 30% соответственно. При этом в 1 м 3 воздуха операционных залов, послеоперационных палат, перевязочных, отделениях реанимации, родильных залов они должны отсутствовать. Особый случай — воздух аптечных помещений , где из - за наличия антимикробных препаратов могут быстро погибать бактерии, но сохраняться грибы, поэтому их обязательно необходимо выявлять при исследовании воздуха аптек. Дополнительные критерии Как показатель запылённости и отсутствия влажной уборки расценивают присутствие спорообразующих палочек, а показателем повышенной влажности — плесневых грибов. Показатель плохой освещённости — отсутствие пигментообразующих форм бактерий. Значительное содержание микробов в воздухе свидетельствует о низком санитарном состоянии помещения. При наличии до 500 микробных клеток в 1 м 3 воздуха жилых или производственных помещений воздух считают чистым. 69 Задание 2. Определить общее микробное число воздуха лабораторного помещения. Общее микробное число воздуха (ОМЧ) - количество микроорганизмов, содержащихся в 1 м 3 воздуха. Для определения общего количества бактерий в воздухе закрытых помещений забирают две пробы (объемом по 100 л каждая) на чашки Петри с МПА при помощи любого прибора (чаще всего аппарата Кротова), либо седиментационным методом. Чашки с посевом помещают в термостат на 24 ч, а затем на 48 ч оставляют при комнатной температуре. Экспозиция чашек с посевами на свету дает возможность подсчитать раздельно количество пигментных колоний (желтых, белых, розовых, черных, оранжевых и др.), количество спорообразующих бацилл, актиномицетов, грибов. При определении микробного числа методом седиментации по Коху подсчитываются колонии, выросшие на МПА в чашках Петри, и расчет ведется по В.Л. Омелянскому. Формула для расчета общего микробного числа воздуха (в 10 л) : N 100 см 2 МЧ = ____________ 5 мин , St Где N – число колоний, выросших на чашке Петри, S – площадь чашки (S=πr 2 ), c м 2 , t – время экспозиции чашки, мин. Задание 3. Освоить методы определения культуральных свойств микроорганизмов. Изучение культуральных свойств бактерий – это один из этапов работы по определению видовой принадлежности микроорганизмов. Культуральные свойства микроорганизмов определяются характером роста их н плотных, жидких и полужидких 70 питательных средах. Культуральные свойства характерны для каждого вида микроорганизмов и являются важным признаком. На поверхности плотных питательных сред микроорганизмы могут расти в виде колонии, штриха или сплошного газона. Колонией называют изолированное скопление клеток одного вида, выросшее из одной клетки. В зависимости от того, где развивались клетки (на поверхности плотной питательной среды, в толще её или на дне сосуда), различают поверхностные, глубинные и донные колонии. Колонии, выросшие на поверхности среды, отличаются большим разнообразием и являются наиболее существенной особенностью роста микроорганизмов на плотном субстрате. При их описании учитывают следующие признаки : 1. Форма колонии (рисунок 31). 2. Размер (диаметр) колонии – измеряют в мм, если размер колонии не превышает 1 мм, то её называют точечной, 1–2 мм – мелкой, 2–4 мм – средней, 4–6 и более мм - крупной. 3. Прозрачность. Колонии могут быть прозрачными, пропускающими свет, и мутными, через которые не видны контуры предметов. 4. Контур края (рисунок 3 2). Различают гладкий ( S ) и шероховатый (R) контур края. 5. Рельеф колонии (профиль) (рисунок 3 3) характеризуется приподнятостью ее над поверхностью питательной среды и контуром формы в вертикальном разрезе. Рельеф колонии определяется невооруженным глазом или под лупой при рассматривании сверху и сбоку. 6. Поверхность колонии – гладкая, шероховатая, бороздчатая, складчатая, морщинистая, с концентрическими кругами или радиально исчерченная. 71 7. Цвет. Для определения цвета колонии пользуются шкалой цветов А.С. Бондарцева. Особо отмечают выделение пигментов в субстрат. При описании колоний актиномицетов отмечают пигментацию воздушного и субстратного мицелия, а также выделение пигментов в среду. Рисунок 31 – Форма колоний : круглая (а), круглая с фестончатым краем (б), круглая с валиком по краю (в), ризоидная (г, д), с ризоидным краем (е), амебовидная (ж), нитевидная (з), складчатая (и), неправильная (к), концентрическая (л), сложная (м). 72 Рисунок 32 – Контур края: 1 – гладкий ( S), 2 – волнистый, 3 – зубчатый, 4 – лопастной, 5 – неправильный, 6 – реснитчатый, 7 – нитчатый, 8 – ворсинчатый, 9 - ветвистый Рисунок 33 - Рельеф колонии (профиль): 1 – изогнутый, 2 – кратерообразный, 3 – бугристый, 4 – врастающий в агар, 5 – плоский, 6 – выпуклый, 7 – каплевидный, 8 – конусовидный 8. Структура (рисунок 34) . Структура колоний определяется в проходящем свете при слабо увеличении микроскопа. У пигментированных колоний она не определяется. 9. Консистенция колоний исследуется посредством прикосновения микробиологической петлей. По консистенции колонии бывают : 1) пастообразные, легко снимающиеся и размазывающиеся по поверхности питательной среды наподобие сливочного масла; 73 2) вязкие или слизистые, прилипающие и тянущиеся за петлей; 3) волокнистые или кожистые, плотные, снимающиеся с поверхности плотной среды в виде упругой пленки, соответствующие величине и форме колонии; 4) хрупкие, сухие, рассыпающиеся при прикосновении петли; 5) крошковатые; 6) плотные, врастающие в среду. Рисунок 34 - Структура колоний : 1 – однородная, 2 – мелкозернистая, 3 – крупнозернистая , 4 – струйчатая, 5 - волокнистая На жидких питательных средах выявляются следующие формы роста бактерий: 1. Рост бактерий с равномерным помутнением среды, цвет которой остается неизменным или изменяется в соответствии с цветом водорастворимого пигмента, образующегося в культуре микроорганизма. Такой рост характерен для многих патогенных бактерий, относящихся к группе факультативных анаэробов. 2. Придонный рост бактерий характеризуется образованием осадка на дне пробирки с жидкой питательной средой. Питательная среда над осадком может быть прозрачной или мутной. Придонный рост характерен для бактерий с анаэробным типом дыхания. 3. Пристеночный рост бактерий выражается в том, что питательная среда, находящаяся в пробирке, остается совершенно прозрачной. Бактерии растут, образуя более или менее крупные рыхлые хлопья 74 или, наоборот, компактные зерна, прикрепленные к внутренней поверхности сосуда, с которой в зависимости от вида снимают легко или с трудом. 4. Поверхностный рост бактерий характеризуется появление на поверхности жидкой питательной среды пленки, внешний вид и характер которой могут быть различными. Рост бактерий в виде поверхностно плавающей пленки характерен для микроорганизмов - аэрофилов. Для выявления особенностей роста на полужидкой питательной среде исследуемую культуру засевают в столбик 0,2– 0,5% полужидкого агара для того, чтобы особенности роста проявлялись особенно четко, прокол среды делают в непосредственной близости к стенке пробирки. Посев, произведенный таким образом, дает возможность дифференцировать подвижные виды микроорганизмов от неподвижных. Задание 4. Изучить культуральные свойства микроорганизмов воздуха. Среди микроорганизмов воздуха закрытых помещений наиболее часто при засеве на плотные среды обнаруживаются бактерии родов Micrococcus (M.roseus, M. flavus, M.candicam, M. lutea), Sarcina (S. flava, S. alba, S. rosea), Bacillus (B.subtills, B. mycoides), Actinomyces , а также колонии грибов родов Penicillium, Aspergillus(A. niger, A. flavus, A. fumigatus), Mucor и др. Бациллы образуют колонии, как правило, крупные, круглые, с неровными краями, сухие, морщинистые. Микрококки образуют круглые гладкие слегка блестящие, окрашенные колонии, пигменты которых не диффундируют в среду. Актиномицеты образуют беловатые колонии, вросшие в агар. При описании актиномицетных колоний обычно отмечают наличие и 75 цвет воздушного и субстратного мицелия, наличие растворимого пигмента, выделяемого в среду; консистенцию колоний; наличие складчатости колоний (концентрическая или радиальная); консистенцию воздушного мицелия (мучнистая, бархатистая, порошковидная, пушистая). Морфологические признаки актиномицетов — строение колоний и мицелия, его ветвление, строение и расположение спороносцев (рисунок 3 5), наличие спорангиев, склероциев, количество спор в цепочках на субстратном и/или воздушном мицелии — изучают, просматривая колонии актиномицетов, выросшие на плотной питательной среде в чашках Петри, при малом увеличении микроскопа. Рисунок 35 - Форма и расположение спороносцев у актиномицетов: а – прямые, короткие; б – прямые, длинные, разветвленные; в – короткие в виде крючков и коротких неправильных спиралей; г – длинные в виде крючков и неправильных спиралей; д - в виде правильных спиралей; е – с плотными сжатыми спиралями; ж – в мутовках прямые; з – в мутовках, имеют крючки, спирали в 1 -1,5 оборота. 76 Учебная карта к лабораторной работе № 5 Работа выполняется в 2 этапа. Этап 1. Осуществить посев микроорганизмов в стерильную чашку Петри на питательную среду (седиментационный метод (по Коху). Следует помнить, что открывать чашки Петри необходимо только во время посева. Чашку помещают на рабочий стол на лист чистой бумаги. Крышку снимают и кладут рядом, не переворачивая. Продолжительность экспозиции составляет 10 минут. Контрольная чашка со средой не открывается. После посева чашки Петри подписать (фамилия студента, группа) и поставить на выращивание при комнатной температуре. Этап 2. Подсчитать общее количество выросших колоний микроорганизмов на питательной среде в чашке Петри. Провести расчет ОМЧ в м 3 воздуха. Заполнить таблицу 1. Таблица 1. ОМЧ лабораторного помещения Количество выросших колоний микроорганизмов на чашке Петри Диаметр чашки , c м Площадь чашки , см 2 ОМЧ Произвести исследование культуральных свойств колоний, выросших на чашке Петри, выбрав 5 типовых колоний. Заполнить таблицу 2. Затем из каждой типовой колонии сделать мазок и окрасить по Граму. В препарате изучить форму клеток и их расположение в пространстве. Занести данные в таблицу 2. Таблица 2. Культуральные и морфологические свойства микроорганизмов воздуха лабораторного помещения Типовая колония 1 2 3 4 5 Количество однотипных 77 колоний Культуральные свойства Форма колонии Размер (диаметр) колонии Прозрачность Контур края Рельеф колонии (профиль) Поверхность Цвет Структура Консистенция Морфологические свойства Форма клеток Расположение в пространстве Окраска по Граму Воспользовавшись материалом атласа микроорганизмов, учебно - методических материалов к лабораторной работе № 5, определителя Берджи, сделать предварительный вывод о таксономической принадлежности изученных микроорганизмов воздуха. Сделать вывод о санитарном состоянии лабораторного помещения. Вопросы к лабораторной работе № 5. 1. Состав микрофлоры воздуха. Санитарно - показательные микроорганизмы воздуха. 2. Методы определения общего микробного числа воздуха. Правило Омелянского. 3. Культуральные свойства бактерий. 4. Какие признаки используются при описании культуральных свойств микроорганизмов. 5. Характеристика культуральных свойств микроорганизмов воздуха 78 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 6 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ НА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ Цель занятия Изучить основы культивирования микроорганизмов на питательных средах. Освоить методы выделения чистых культур микроорганизмов. Материалы и оборудование: Определитель Берджи; шкала цветов А.С. Бондарцева; спички, карандаш по стеклу; иммерсионное масло; чашки Петри стерильные; среда МПА стерильная; пипетки стерильные; шпатель Дригальского; культуры микроорганизмов; микроскоп; микробиологическая петля с петледержателем; спиртовка; предметные стекла; покровные стекла; прибор для окрашивания и промывания мазков; полоски фильтровальной бумаги; реактивы для окраски микробиологических препаратов. Задачи. 1. Ознакомиться с основными типами питательных сред. 2. Изучить методы стерилизации питательных сред и оборудования. 3. Произвести выделение чистых культур микроорганизмов с использованием различных методов. Задание 1. Ознакомиться с классификацией питательных сред. Известно значительное количество питательных сред , используемых для культивирования и поддержания ( сохранения ) микроорганизмов Питательной средой в микробиологии называют среды , содержащие различные соединения сложного или простого состава , которые применяются для размножения микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях 79 Питательная среда должна удовлетворять следующим требованиям: 1. содержать все необходимые для роста и размножения микроорганизмов вещества; 2. иметь достаточную влажность (не менее 60% влаги); 3. иметь определенную концентрацию ионов водорода (рН); 4. быть изотонической для бактериальной клетки; 5. быть стерильной; 6. обладать определенным окислительно - восстановительным потенциалом; 7. быть унифицированной в отношении отдельных компонентов (аминный азот - 2,5 – 3 ,0 г/л), хлоридов (на хлорид натрия – 0,5 - 0,8%). Все химические элементы, необходимые для жизнедеятельности микроорганизмов, подразделяют на макро - и микроэлементы. К макроэлементам (биогенным) относятся десять элементов, содержа - щихся в основных биополимерах всех организмов: С, O, H, N, S, P, K, Ca,Mg, Fe. Микроэлементы включают в себя Mn, Mo, Zn, Cu, Co, Ni, Ba, B, Cr, Na, Se, Si, W и другие, однако в них нуждаются не все организмы. Из макро - и микроэлементов бактерии синтезируют все вещества, необходимые для построения клетки: белки, аминокислоты, нуклеиновые кислоты, витамины, липиды и т д. В зависимости от использования источников углерода все микроорганизмы разделяются на автотрофы и гетеротрофы. Автотрофы (от греч. autos – сам, trophe – пища, питание) – это микроорганизмы, способные усваивать или фиксировать углекислый газ воздуха в качестве единственного источника углерода и синтезировать из него органические вещества своих клеток. Гетеротрофы – организмы, нуждающиеся в готовых органических веществах. Как автотрофы, так и гетеротрофы подразделяют на две группы в зависимости от того, какой источник 80 энергии они используют: фототрофы используют энергию света и трансформируют ее в химическую, хемотрофы используют энергию, освобождаемую при реакциях окисления - восстановления. В зависимости от того, какие питательные вещества – органические или неорганические – являются донорами электронов, все микроорганизмы также подразделяют на две группы. Органотрофными являются организмы, использующие в качестве доноров электронов органические соединения, к литотрофным относятся организмы, способные использовать в качестве доноров электронов неорганические вещества (H 2 , NH 3 ,H 2 S, CO, Fe 2+ и т. д.). Группа микроорганизмов, способная к росту на простых средах, содержащих источник углерода и энергии, а также набор основных биогенных элементов, получила название прототрофных. Следует учитывать и то, что в природе встречаются бактерии, которые способны размножаться в местах с низким пищевым потоком углерода – до 0,1 мг/л в день. Они получили название олиготрорфных , противоположную группу для них составляют бактерии копиотрофные – способные к росту на богатых пищевых субстратах. E.coli (кишечная палочка) способна к росту на простой среде, содержащей только глюкозу и неорганические соли. Молочнокислые же бактерии растут на сложных средах, содержащих в качестве добавок ряд органических соединений (витамины, аминокислоты и др.), которые клетки не в состоянии синтезировать самостоятельно. Такие соединения называются факторами роста . Организмы, которые нуждаются в их добавлении к ростовой среде, называются |