ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ ПО МИКРОБИОЛОГИИ. Учебном пособии представлены лабораторные работы по микробиологии для студентов педагогических университетов по специальностям 1
 Скачать 4.85 Mb.
|
|
Рисунок 39 - Определение антагонистической активности микроорганизмов методом перпендикулярных штрихов (1, 2, 4, 5, 7 - рост нечувствительных, 3, 6 – рост чувствительных к антибактериальному веществу микроорганизма - антагониста (8) тест - культур) Метод агаровых блоков удобен тем, что выращивание штаммов - антагонистов и тест - культур производится на разных питательных средах. Изучаемый на антагонистическую активность микроорганизм засевают на поверхность агаризованной среды в 104 чашке Петри таким образом, чтобы в процессе его роста сформировался «сплошной газон». После того, как клетки микроорганизма хорошо вырастут, стерильным пробочным сверлом (или пробиркой) вырезают агаровые блоки, которые переносят на предварительно засеянную тест - культурой поверхность среды в другой чашке Петри. Тест - культура засевается шпателем, а агаровые блоки накладывают ростом вверх на равном расстоянии один от другого и от краев чашки, плотно прижимая к агаровой пластинке. На одной чашке Петри можно разместить 4 – 5 агаровых блоков с различными продуцентами антибиотических веществ (рис. 40 ). Рисунок 40 - Определение антагонистической активности методом агаровых блоков (1- тест - культура, 2 – агаровый блок, 3 – зона задержки роста тест - культуры) Чашки инкубируют в термостате при температуре, оптимальной для роста тест - культуры. В случае чувствительности последних к антибактериальному веществу продуцента вокруг агаровых блоков образуются зоны отсутствия роста. Чем больше выделяется антибактериального вещества, чем оно активнее и лучше диффундирует в среде, тем больше диаметр зоны задержки роста 105 тест - культуры. Нечувствительные к антибиотическому веществу данного продуцента клетки растут на всей поверхности среды. Метод отсроченного антагонизма применяется главным образом для исследования антагонистической активности бактерий, продуцирующих бактериоцины. Испытуемые клетки засевают макроколониями («пятнами») 0,3 – 0,5 см в диаметре на поверхность плотной питательной среды в чашке Петри. На одной чашке можно проверить до 10 штаммов. Выросшие в результате инкубирования в течение 48 часов в оптимальных условиях бактерии стерилизуют в парах хлороформа (30 мин) и заливают тонким слоем агаризованной 0,7 % среды, в которую предварительно вносят 0,1 мл тест - культуры. Результаты учитывают через 24 часа инкубирования при температуре, оптимальной для роста индикаторных бактерий. Степень антагонистической активности характеризуется размером зон задержки роста тест - культуры вокруг макроколонии антагониста. Изучение антагонистических взаимоотношений при совместном культивировании в жидкой питательной среде основано на подсчете числа жизнеспособных особей после совместного культивирования двух штаммов микроорганизмов, клетки которых при этом должны различаться друг от друга легко определяемыми признаками (пигментация, сбраживание углеводов, устойчивость к антибиотикам, ауксотрофность и др.). Кроме того, необходимо, чтобы оба микроорганизма одинаково хорошо росли при используемых условиях (температуре, составе среды и т. д.). Культуры изучаемых бактерий, находящихся в стационарной стадии роста, разводят свежей питательной средой в 10 раз, смешивают в равных объемах и инкубируют в оптимальных для их развития условиях. Параллельно в тех же условиях инкубируют данные культуры независимо. Через определенные промежутки времени отбирают пробы по 1 мл всех культур и после соответствующих 106 разведений по 0,1 мл высевают на селективные для каждого штамма среды. Чашки помещают в термостат и после инкубирования подсчитывают количество сформировавшихся колоний. Определяют титр клеток и строят кривые роста бактерий при совместном и раздельном культивировании. По оси абсцисс откладывают время культивирования бактерий, по оси ординат – количество жизнеспособных клеток в 1 мл. Учебная карта к лабораторной работе № 8 Исследовать антагонистическую активность микроорганизмов методом перпендикулярных штрихов. Работа выполняется в 2 этапа. Этап 1. С внешней стороны разметить маркером чашку Петри согласно рисунку 1. С соблюдением правил асептики произвести засев штрихом микроорганизма - антагониста на поверхность плотной питательной среды в чашку Петри. Перпендикулярно к линии роста микроорганизма - антагониста микробиологической петлей произвести засев тест - культур. Результаты оценить на следующем занятии, заполнив таблицу 1. Таблица 1. Метод перпендикулярных штрихов Микроорганизм – антагонист Тест - культура Результат исследования 1. Сделать обобщающий вывод по результатам исследования. Вопросы к лабораторной работе № 8 . 1. Типы взаимоотношений между микроорганизмами. 2. Методы исследования антагонистической активности микроорганизмов. 107 СЛОВАРЬ МИКРОБИЛОГИЧЕСКИХ ТЕРМИНОВ Термин Определение Автолиз разрушение или саморастворение клеток за счет собственных (эндогенных) ферментов Автотрофы микроорганизмы, синтезирующие все углеродсодержащие компоненты клетки из СО 2 , как единственного источника углерода Автохтонная микрофлора специфические для данного биотопа виды Азотфиксация усвоение молекулярного азота воздуха азотфиксирующими прокариотными организмами с образованием соединений азота, доступных для использования другими организмами Алкалофилы микроорганизмы, развивающиеся в щелочных средах (рН 9,0— 11,0). Облигатные А. растут в пределах рН 8,5 —11,0; факультативные – 5,0 — 11,0 Аллохтонная микрофлора микроорганизмы, наличие которых в определенной экосистеме обусловлено случайным повышением концентрации питательных веществ или появлением новых Анаэробы организмы (в основном прокариоты), способные жить при отсутствии в среде свободного кислорода Антагонизм или конкуренция взаимоотношения микроорганизмов в природных или лабораторных условиях, при которых один вид задерживает или подавляет полностью рост другого. Антагонистами могут быть представители всех групп микроорганизмов 108 Антисептика комплекс мероприятий с использованием механических и физических методов воздействия, активных химических веществ и биологических факторов (антисептиков), убивающих или подавляющих размножение микроорганизмов Антибиотики высокоактивные, наследственно закрепленные метаболические продукты микроорганизмов, избирательно подавляющие рост различных бактерий Асептика в микробиологии - комплекс мероприятий, направленных на предупреждение попадания микроорганизмов из окружающей среды в материал для исследования, питательные среды и культуры микроорганизмов при лабораторных условиях Ацидофильные прокариоты те, для которых оптимальная среда обитания кислая (рН 4 и ниже) Аэробы микроорганизмы, получающие энергию используя кислород. Облигатные аэробы размножаются только в присутствии кислорода Ауксотрофы микроорганизмы, утратившие способность синтезировать одно из веществ, необходимых для их роста (аминокислоту, витамин или др.). Без добавления в питательную среду этого вещества ауксотрофы не растут Бактериоцины антибактериальные вещества, синтезируемые бактериями, способные вызывать гибель бактерий того же вида или близких видов. Колицины - бактериоцины кишечных бактерий 109 Биотоп территориально ограниченный участок биосферы с относительно однородными условиями жизни Вид эволюционно сложившаяся совокупность особей, имеющая единый генотип, который в стандартных условиях проявляется сходными морфологическими, физиологическими, биохимическими, молекулярно - биологическими признаками Волютин включения в клетках бактерий, представляющие собой полифосфаты Галофильные микроорганизмы , растущие в средах с высокой концентрацией солей Ингибировать (от лат. inhibeo - сдерживаю, останавливаю) сдерживать, подавлять, угнетать Индуцировать (от лат. inductio - побуждение, наведение ) возбуждать, стимулировать Дезинфекция совокупность химических , физических и механических способов полного уничтожения вегетативных и споровых форм определенных групп патогенных для человека организмов с целью разрыва путей передачи возбудителей инфекционных заболеваний от источников инфекции к восприимчивым людям Деконтаминация микробная полное или частичное удаление микроорганизмов с объектов внешней среды и биотопов человека с помощью факторов прямого повреждающего действия Идентификация (индикация) диагностическое исследование, которое достигается путем определения морфологических, культуральных, биохимических и 110 других признаков микроорганизмов Is- последовательности простые вставочные последовательности ( IS- элементы — insertion sequences – вставочные последовательности) ДНК , способные к самостоятельному перемещению из одного участка в другой в пределах одного репликона, а также перемещению из одного репликона ДНК бактериальной клетки в другой. Индекс количество санитарно - показательных бактерий, содержащихся в 1л жидкости, 1г плотных веществ, 1см 3 воздуха Инокуляция введение живых организмов в среды ; в микробиологической практике также употребляют термин посев Клон культура микроорганизма (популяция клеток), полученная из одной (родительской) клетки с известным генотипом путем бесполого размножения Колония видимое изолированное скопление особей одного вида микроорганизмов, образующихся в результате размножения одной бактериальной клетки на плотной питательной среде Коньюгация перенос генетического материала из клетки - донора в клетку реципиента при их скрещивании с помощью половых пилей Культивирование выращивание микроорганизмов в искусственных условиях Культура микроорганизмов вся совокупность микроорганизмов одного вида, выросших на плотной или жидкой питательной среде 111 L- формы бактерии, полностью или частично утратившие клеточную стенку, но сохранившие способность к размножению Микробиоценоз сообщество популяций микроорганизмов, обитающих в определенном биотопе Микробное число общее количество микроорганизмов, содержащихся в единице объема или массы исследуемого объекта (1 см 3 воды, 1г почвы, 1 м 3 воздуха) Нейтрофилы микроорганизмы, для которых оптимальной для роста является среда близкая к нейтральной (рН от 4 до 9) Осмофильными называют микроорганизмы, развивающиеся в средах с высокой концентрацией сахара Паразиты организмы, которые использует хозяина как источник питания и среду обитания, при этом они находятся в антагонистических отношениях с хозяином Пастеризация освобождение от вегетативных форм микроорганизмов путем однократного прогревания при 70 - 80 °С в течение 10 - 30 мин с последующим быстрым охлаждением Патогенные микроорганизмы микроорганизмы, которые могут вызывать заболевание Питательные среды среды, содержащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения бактерий или других микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях 112 Плазмотип совокупность внехромосомных генов (плазмид). Функция плазмотипа - передача нежизненно важных свойств, обладая которыми микроорганизм может получать определенные преимущества Психрофилы холодолюбивые микроорганизмы, зона оптимального роста 10–15°С. Протопласты бактерии, полностью лишенные клеточной стенки Прототрофы микроорганизмы, которые способны сами синтезировать необходимые для роста соединения Резидентная (постоянная) облигатная микрофлора представлена микроорганизмами, постоянно присутствующими в организме Резистентность невосприимчивость, устойчивость к действию определенных факторов Сапрофиты гетеротрофы, утилизирующие органические остатки отмерших организмов в окружающей среде Симбиоз взаимоотношения микроорга - низмов, при которых два или более вида микроорганизмов при совместном развитии создают для себя взаимовыгодные условия Степень взаимозависимости симбионтов варьирует от слабой (сотрудничество) до полной (мутуализм) Стерилизация совокупность физических и химических способов полного освобождения объектов внешней среды от вегетативных и покоящихся форм микроорганизмов Серовары штаммы одного вида, различающиеся по антигенным 113 характеристикам Сферопласты бактерии, частично лишенные клеточной стенки Термофилы теплолюбивые микроорганизмы, зона оптимального роста равна 50 - 60°С Тинкториальные свойства микроорганизмов свойство микроорганизмов, характеризующее их способность вступать в реакцию с красителями и окрашиваться определенным образом Тиндализация (дробная стерилизация) стерилизация термолабильных материалов 3 - 4 кратным прогреванием текучим паром при 100°С по 1ч с перерывами в сутки, в течение которых материал содержат в термостате при 37°С (для прорастания спор) Типовой штамм штамм, выбранный в качестве постоянного образца того, что подразумевается под данным видом Титр минимальный объем или масса, в которой обнаруживаются данные бактерии Транспозоны нуклеотидные последовательности бактериальной клетки, несущие генетическую информацию, необходимую для транспозиции (перемещения с одного репликона на другой) или выполняющие регуляторные и кодирующие функции Трансдукция передача генетического материала от одних бактерий другим с помощью фагов Трансформация непосредственная передача генетического материала (фрагмента ДНК) от донора реципиентной клетке 114 Фаготипы штаммы одного вида, различающиеся по чувствительности к специфическим фагам Фототрофы микроорганизмы, способные использовать солнечную энергию Фитонциды антибактериальные вещества, которые образуют растения Хемотрофы микроорганизмы, получающие энергию за счет окислительно - восстановительных реакций Хищничество вид взаимоотношений, когда одна популяция использует другую популяцию в качестве источника питания Чистая культура это культура, состоящая из клеток одного вида. По способу получения она представляет собой потомство (клон) одной клетки Штамм культура бактерий одного вида, выделенная из определенного источника (организм человека, животного, окружающая среда) в определенное время и на определенной фазе роста 115 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Лысак, В.В. Микробиология: учебное пособие / В.В. Лысак – Минск: Изд. БГУ, 2007 - 426 с. 2. Гусев , М. В Микробиология / М. В Гусев., Л. А. Минеева - М .: Изд–во МГУ , 1992, 448 с 3. Шлегель , Г. Общая микробиология / Г. Шлегель - М .: Мир , 1987, 567 с 4. Громов , Б. В. Строение бактерий / Б.В. Громов - Л .: Изд–во Ленингр ун–та , 1985, 192 с 5. Громов , Б. В. Экология бактерий / Б. В. Громов Б. В., Г. В. Павленко - Л .: Изд–во Ленингр ун–та , 1989, 248 с 6. Колешко , О.И. Микробиология с основами вирусологи / О. И. Колешко, Т. В. Завезенова - Иркутск : Изд–во Иркут ун–та , 1999, 452 с 7. Определитель бактерий Берджи : В 2 т . / Под ред Хоулта Дж и др М .: Мир , 1997. 8. Зеленова, Е.Г. Микрофлора полости рта: норма и патология: Учебное пособие / Зеленова, Е.Г., Заславская М.И., Салина Е.В., Рассанов СП. - Нижний Новгород: Издательство НГМА, 20 04. - 158с. 9. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии: учебное пособие для студентов медицинских вузов / А. А. Воробьев, А. С. Быков – М : Медицинское информационное агенство, 2003 – 236 с. 10. СанПиН 10 - 124 РБ 99 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества». 11. A report from the American Academy of Microbiology - E. с oli: good, bad and deadly/ Michael P. Doyle [et al] - Washington, American Academy of Microbiology 1752 N Street, N – 2011. - 16 p. 116 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ СЭМ – сканирующая электронная микроскопия ФКМ – фазово - контрастная микроскопия ТЭМ – трансмиссивная электронная микроскопия ОМЧ – общее микробное число ЛПС – липополисахарид МПА – мясопептонный агар МПБ – мясопептонный бульон 117 ПРИЛОЖЕНИЕ 1 МОРФОТИПЫ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК шаровидные (кокки) микрококки диплококки тетракокки стрептококки сарцины стафилококки палочковидные правильная форма неправильная форма извитые вибрионы спириллы спирохеты 118 ПРИЛОЖЕНИЕ 2 ПРАВИЛА ИММЕРСИОННОЙ МИКРОСКОПИИ 1. Микроскоп устанавливают в рабочее положение. 2. Устанавливают освещение, включая лампу и направляя свет на вогнутое зеркало микроскопа. Конденсор должен быть поднят до упора, диафрагма открыта. При правильной установке освещения поле зрения микроскопа имеет форму круга, хорошо и равномерно освещенного. 3. На препарат наносят каплю иммерсионного масла. 4. Препарат помещают на предметный столик и фиксируют его клеммами. 5. Наблюдая сбоку, опускают тубус с объективом 90х, макровинтами в масло почти до соприкосновения с препаратом. 6. Затем, глядя в окуляр, макровинтом очень медленно поднимают объектив до появления изображения и с помощью микровинта производят окончательную фокусировку четкого изображения. 7. При микроскопии определяют взаимное расположение микроорганизмов, их размеры, форму, структуру, окраску. 8. После просмотра препарата револьвер переводят на малое увеличение 8х и только после этого препарат снимают со столика. 9. Фронтальную линзу объектива протирают марлей, смоченной чистым бензином или эфиром для удаления остатков иммерсионного масла. 10. Затем опускают предметный столик (или конденсор в микроскопах с неподвижным столиком) и накрывают микроскоп чехлом. |