ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ ПО МИКРОБИОЛОГИИ. Учебном пособии представлены лабораторные работы по микробиологии для студентов педагогических университетов по специальностям 1
 Скачать 4.85 Mb.
|
|
Учебная карта к лабораторной работе № 1 Ознакомиться с техникой безопасности при работе в микробиологической лаборатории. Законспектировать основные положения техники безопасности в тетрадь. Ознакомиться с оборудованием микробиологической лаборатории и заполнить таблицу 1. Таблица 1. Оборудование учебной микробиологической лаборатории Основное оборудование учебной микробиологической лаборатории Назначение, схематичное изображение 1 2 ….. Освоить приготовление препаратов «висячая» и «раздавленная» капля из чистых культур микроорганизмов. Законспектировать (кратко) методику получения препаратов «висячая» и «раздавленная» капля. Получить препараты «висячая» и «раздавленная» капля для различных морфологических форм из чистых культур микроорганизмов В приготовленных препаратах «висячая» и «раздавленная» капля изучить морфологию клеток и зарисовать форму и расположение клеток в пространстве в таблице 2. Таблица 2. Морфология бактериальных клеток Культура Препарат Морфологическое описание Схематическое изображение (рисунок) 33 Сделать выводы о морфологических формах изученных микроорганизмов. Приготовить препараты «раздавленная капля» , взяв мазки из зубодесневого кармана и с языка. Изучить морфологию клеток и заполнить таблицу 3. Таблица 3. Морфология микроорганизмов ротовой полости. Мазок Морфологичес - кое описание наблюдаемых микроорганизмов Схематичес - кое изображение (рисунок) Вывод о возможной таксономической принадлежности наблюдаемых микроорганизмов из зубодесневого кармана с языка Сделать вывод о качественном составе микрофлоры рта. Вопросы к лабораторному занятию 1. 1 . Основные правила техники безопасности при работе с микроорганизмами. 2 . Виды оборудования, применяемого в микробиологической лаборатории. 3 . Методики приготовления препаратов «висячая» и «раздавленная» капля. 4 . Основные морфологические типы бактерий. Использование морфологической характеристики в идентификации микроорганизмов. Система классификации микроорганизмов по Берджи. 5 . Микрофлора человека и ее значение для организма. Понятие об автохтонных, аллохтонных микроорганизмах. 34 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2 ПРИГОТОВЛЕНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ОРГАНОИДОВ, СТРУКТУРНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ И ВКЛЮЧЕНИЙ Цель занятия. Овладеть методиками фиксации и окраски микроорганизмов. Материалы и оборудование: посевы микроорганизмов на чашках Петри, в пробирках со скошенным агаром; спички, карандаш по стеклу; иммерсионное масло; микроскоп; микробиологическая петля с петледержателем; спиртовка; предметные стекла; покровные стекла; прибор для окрашивания и промывания мазков; полоски фильтровальной бумаги; реактивы для окраски микробиологических препаратов; реактив Никифорова. Задачи. 1. Ознакомиться с основными органоидами и включениями микроорганизмов. 2. Освоить методы фиксации и окраски мазков. 3. Освоить методику окраски бактерий по методу Грама. 4. Изучить методы исследования органоидов и включений. Задание 1. Ознакомиться с основными органоидами и включениями микроорганизмов. Обязательными органоидами бактериальной клетки являются : нуклеоид , цитоплазма, цитоплазматическая мембрана. 35 Необязательными структурными элементами являются : клеточная стенка, капсула, споры, пили, жгутики. 1. В центре бактериальной клетки находится нуклеоид - ядерное образование, представленное чаще всего одной хромосомой кольцевидной формы. Состоит из двухцепочечной нити ДНК. Нуклеоид не отделен от цитоплазмы ядерной мембраной. 2. Цитоплазма - сложная коллоидная система, содержащая различные включения метаболического происхождения (зерна волютина, гликогена, гранулезы и др.), рибосомы и другие элементы белоксинтезирующей системы, плазмиды (вненуклеоидное ДНК), мезосомы (образуются в результате инвагинации цитоплазматической мембраны в цитоплазму, участвуют в энергетическом обмене, спорообразовании, формировании межклеточной перегородки при делении). 3. Цитоплазматическая мембрана ограничивает с наружной стороны цитоплазму и выполняет ряд важнейших функций - барьерную (создает и поддерживает осмотическое давление), энергетическую (содержит многие ферментные системы – дыхательные, окислительно - восстановительные, осуществляет перенос электронов), транспортную (перенос различных веществ в клетку и из клетки) , рецепторную и сигнальную 4. Клеточная стенка - присуща большинству бактерий (кроме микоплазм и некоторых других , не имеющих истинной клеточной стенки микроорганизмов). Она обладает рядом функций, прежде всего , обеспечивает механическую защиту и постоянную форму клеток, с ее наличием в значительной степени связаны антигенные свойства бактерий. Основное химическое соединение клеточной стенки, которое специфично только для бактерий - пептидогликан (муреин). От структуры и химического состава клеточной стенки 36 бактерий зависит важный для систематики признак бактерий - отношение к окраске по Граму. В соответствии с ним выделяют две большие группы - грамположительные и грамотрицательные бактерии. Стенка грамположительных бактерий после окраски по Граму и последующем промывании этанолом сохраняет комплекс йода с генцианвиолетом и магниевыми солями рибонуклеиновых кислот (окрашены в сине - фиолетовый цвет), грамотрицательные бактерии теряют этот комплекс и соответствующий цвет после обработки , и они окрашиваются в розовый цвет за счет докрашивания фуксином. Особенности клеточной стенки грамположительных бактерий Мощная, толстая, несложно организованная клеточная стенка, в составе которой преобладают пептидогликан и тейхоевые кислоты, нет липополисахаридов (ЛПС) , часто нет диаминопимелиновой кислоты. А Б Рисунок 26 - Строение клеточной стенки Гр + (А) и Гр - (Б) - бактерий Особенности клеточной стенки грамотрицательных бактерий Клеточная стенка значительно тоньше, чем у грамположительных бактерий, содержит ЛПС, липопротеины, 37 фосфолипиды, диаминопимелиновую кислоту. Устроена более сложно - имеется внешняя мембрана, поэтому клеточная стенка трехслойная. При обработке грамположительных бактерий ферментами, разрушающими пептидогликан, возникают полностью лишенные клеточной стенки структуры - протопласты. Обработка грамотрицательных бактерий лизоцимом разрушает только слой пептидогликана, не разрушая полностью внешней мембраны; такие структуры называют сферопластами . К поверхностным структурам бактерий относятся капсула, жгутики, микроворсинки. Капсула или слизистый слой окружает оболочку ряда бактерий. Капсула является защитной структурой (прежде всего от высыхания), у ряда микроорганизмов - фактором патогенности, препятствует фагоцитозу, ингибирует первые этапы защитных реакций – распознавание и поглощение. У сапрофитов капсулы образуются во внешней среде, у патогенов – чаще в организме хозяина. Существует ряд методов окраски капсул в зависимости от их химического состава. Капсула чаще состоит из полисахаридов, реже – из полипептидов. Жгутики. Подвижные бактерии могут быть скользящие (передвигаются по твердой поверхности в результате волнообразных сокращений) или плавающие, передвигающиеся за счет нитевидных спирально изогнутых белковых (флагеллиновых по химическому составу) образований - жгутиков. Фимбрии или реснички — короткие нити, в большом количестве окружающую бактериальную клетку, с помощью которых бактерии прикрепляются к субстратам (например, к поверхности слизистых оболочек). Пили первого типа. Белковой природы, жесткие, закреплены в клеточной стенке. Способствуют адгезии микробных клеток на субстрате. 38 Пили второго типа. Имеют точно такое же строение, что и пили первого типа. Они обеспечивают конъюгацию у бактерий ( F- пили (фактор фертильности). Они передают генетическую информацию от F+ к F - бактерии. Пили третьего типа Имеют очень большую длину. На этих пилях адсорбируются бактериофаги. Они участвуют в процессах лизиса бактерий и передачи генетической информации. Эндоспоры и спорообразование Спорообразование - способ сохранения определенных видов бактерий в неблагоприятных условиях среды. Эндоспоры образуются в цитоплазме, представляют собой клетки с низкой метаболической активностью и высокой устойчивостью ( резистентностью ) к высушиванию, действию химических факторов, высокой температуры и других неблагоприятных факторов окружающей среды. Высокая резистентность связана с большим содержанием кальциевой соли дипиколиновой кислоты в оболочке спор. Расположение и размеры спор у различных микроорганизмов отличаются, что имеет дифференциально - диагностическое (таксономическое) значение. Основные фазы “жизненного цикла” спор - споруляция (включает подготовительную стадию, стадию предспоры, образования оболочки, созревания и покоя) и прорастание , заканчивающееся образованием вегетативной формы. Процесс спорообразования генетически обусловлен. У многих микроорганизмов, выращенных в результате обменных процессов в цитоплазме образуются включения. К ним относятся отложения жира, полиоксимаслянной кислоты, волютина (полифосфатов), крахмалоподобных полисахаридов (гликогена, гранулезы), серы и других веществ. 39 Задание 2. Освоить методы фиксации и окраски мазков. Для количественного учета, изучения морфологии, выявления структурных элементов, органоидов, внутриклеточных включений мазок бактериальной культуры необходимо зафиксировать и окрасить. ЭТАПЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ МАЗКА 1. Нанесение бактериальной культуры 2. Высушивание 3. Фиксация 4. Окрашивание Мазок готовят на обезжиренном чистом предметном стекле, куда наносят небольшую каплю воды. В этой капле эмульгируют исследуемый материал, который распределяют тонким слоем на поверхности около 2 см 2 . Если микроорганизмы выращены на жидкой питательной среде, то культуру берут петлей или стерильной пипеткой и каплю наносят непосредственно на стекло (без воды). После этого мазок высушивают на воздухе и фиксируют. Методы фиксации : Физический – над пламенем спиртовки Химический – в растворах спирта, ацетона, смеси Никифорова, формалина. Фиксацию мазка над пламенем спиртовки производят в течение нескольких секунд мазком вверх. Эту операцию проводят достаточно быстро после полного высушивания мазка, не перегревая его (прикладывание предметного стекла к тыльной стороне ладони должно вызывать чувство выраженного тепла, но не жжения). Цели фиксации Обеззараживание патогенных микроорганизмов Закрепление клеток на стекле Убитые микроорганизмы лучше воспринимают красители 40 Методы окраски. Различают простые и сложные методы окраски мазков. При простых методах окраски мазок окрашивают каким - либо одним красителем, используя красители анилинового ряда. Если красящий ион (хромофор) – катион, то краситель обладает основными свойствами, если хромофор - анион, то краситель имеет кислые свойства. Кислые красители – эритрозин, кислый фуксин, эозин. Основные красители – генцианвиолет, кристаллический фиолетовый, метиленовый синий, основной фуксин. Преимущественно для окраски микроорганизмов используются основные красители, которые более интенсивно связываются кислыми компонентами клетки. Микроорганизмы окрашивают, нанося краситель на полоску фильтровальной бумаги, находящейся на поверхности мазка. Задание 3. Ознакомиться с методикой окраски бактерий по методу Грама. МЕТОДИКА ОКРАСКИ БАКТЕРИЙ ПО МЕТОДУ ГРАМА 1. Нанести каплю воды на прямое предметное стекло. 2. В каплю воды поместить бактериальную культуру. 3. Мазок высушить и зафиксировать над пламенем спиртовки. 4. На фиксированный мазок поместить полоску фильтровальной бумаги. 5. На полоску фильтровальной бумаги нанести генцианвиолет на 1 - 2 мин. 6. Фильтровальную бумагу удалить, краску слить и нанести раствор Люголя дважды: 1 раз – для того, чтобы смыть остатки красителя с мазка (при этом раствор не задерживают на мазке, а сразу же при легком покачивании сливают), 2 раз - на 2 минуты (до почернения мазка). 41 7. Раствор Люголя слить и на мазок нанести 96% спирт на 15 -20 секунд в зависимости от толщины мазка, пока мазок не станет серо - стального цвета. 8. Мазок промыть дистиллированной водой. 9. Мазок дополнительно окрасить фуксином Циля на 2 - 3 мин (воспользовавшись полоской фильтровальной бумаги). 10. Краситель смыть водой, препарат высушить, промикроскопировать. Грамположительные (Гр+) бактерии окрашиваются в сине - фиолетовый цвет. Грамотрицательные (Гр - ) бактерии окрашиваются в красный (розовый) цвет. Задание 4. Освоить методики выявления спор, капсул и включений у бактерий. В связи с особенностями физико - химического состава и плотной малопроницаемой оболочкой для окраски спор применяют сначала химические вещества, меняющие структуру оболочки. Все способы окраски спор построены на едином принципе: сначала споры протравливаются различными веществами (хромовой, соляной, серной кислотами), окрашивают клетку со спорой при нагревании, затем обесцвечивают цитоплазму и дополнительно окрашивают ее контрастным красителем. МЕТОДИКА ОКРАСКИ СПОР ПО СПОСОБУ АУЭСКИ 1. На приготовленный высушенный мазок наливают 1 - 2% раствор соляной кислоты и подогревают на пламени до отхождения паров (3–4 раза). 2. Промыть водой, высушить, фиксировать над пламенем. 3. Окрасить через фильтровальную бумагу раствором фуксина при нагревании (до появления паров) в течение 3–5 мин. 42 4. Препарат обесцвечивают 5% раствором серной кислоты в течение нескольких секунд (16–18 с) (до бледно - розовой окраски), медленно считая от 21 до 40. 5. Промывают водой и дополнительно окрашивают метиленовым синим в течение 2 мин. 6. Промывают водой и высушивают. 7. При микроскопии видны споры (красные) и вегетативные клетки (синие). Рисунок 27 - Пример окраски спор у Bacillus subtilis В связи с тем, что капсулы не окрашиваются подавляющим большинством красителей, для их выявления используют негативные препараты, в которых на окрашенном фоне можно наблюдать неокрашенные капсулы вокруг клеток. МЕТОДИКИ ОКРАСКИ КАПСУЛ ОБНАРУЖЕНИЕ КАПСУЛ ПО МЕТОДУ БУРРИ А. Нанести на предметное стекло немного культуры (1) и каплю туши (2) на расстоянии примерно одной трети от края. Б. Правой рукой приставляют шлифованное стекло узким краем к стеклу слева от капель под углом 45°. В. Продвигают шлифованное стекло вправо до соприкосновения с каплей. 43 Г. Затем быстрым движением справа налево делают мазок. Капля должна быть небольшой и соразмерена так, чтобы весь мазок помещался на стекле, не доходя 1—1,5 см до его края. Нельзя прекращать размазывание и отнимать стекло раньше , чем капля будет исчерпана. Д. Мазок высушить на воздухе и микроскопировать. Рисунок 2 8 - Растяжка мазка ОБНАРУЖЕНИЕ КАПСУЛ ПО МЕТОДУ БУРРИ - ГИНСА 1. Приготовить мазок на предметном стекле по методу Бурри. 2. Высушить на воздухе 3. Фиксировать со смесью Никифорова (спирт и эфир 1:1) на 15- 20 мин 4. Осторожно промыть водой 5. На мазок нанести фуксин на 3 - 5 мин. 6. Промыть водой. 7. Высушить на воздухе. 8. Микроскопия с иммерсией. 44 Внимание! Фильтровальной бумагой не пользоваться, чтобы не повредить препарат. Препарат по Бурри – Гинсу под микроскопом: фон черный, клетки бактерий красные, капсулы неокрашенные (красители не воспринимают). Окраска по Бурри Окраска по Бурри - Гинсу Рисунок 29 – Препараты для обнаружения капсул у бактерий МЕТОДИКА ОКРАСКИ ВОЛЮТИНА ПО МЕТОДУ ОМЕЛЯНСКОГО 1. Тонкий мазок культуры микроорганизмов высушивают на воздухе, фиксируют на пламени. 2. Окрашивают мазок через полоску фильтровальной бумаги фуксином Циля в течение 30 с. Промывают водой. 3. Обесцвечивают 30 с 1% серной кислотой и немедленно промывают водой. При этом серная кислота обесцвечивает цитоплазму, а зерна волютина остаются окрашенными фуксином. 4. Препарат докрашивают раствором метиленового синего в течение 20 – 30 секунд, промывают водой, высушивают и микроскопируют. На препарате видны гранулы волютина, 45 окрашенные в красный цвет, на фоне цитоплазмы клеток, окрашенных в голубой. МЕТОДИКА ОКРАСКИ ГРАНУЛЕЗЫ И ГЛИКОГЕНА Для выявления гликогена - 1. Готовят мазок, сушат на воздухе, фиксируют раствором Никифорова в течение 5 минут. 2. Мазок окрашивают раствором Люголя в течение 1 - 2 мин. Промывают водой, накрывают покровным стеклом и микроскопируют с иммерсией. Гранулы гликогена окрашиваются в красновато - коричневый цвет. Если препарат нагреть до 60◦С, окраска гликогена исчезает, а при охлаждении препарата восстанавливается. Для выявления гранулезы – 1. На предметное стекло наносят каплю исследуемого материала, добавляют каплю раствора Люголя. 2. Препарат закрывают покровным стеклом и микроскопируют. Включения гранулезы окрашиваются в серо - синий цвет. |