Иммунология Хаитов. В. Н. Ярыгин профессор, академик рамн, ректорРоссийского государственного медицинского университета академик рамн, председатель Уральского отделения ран. Хаитов P. M., Игнатьева га, Сидорович И. Г
 Скачать 6.93 Mb.
|
|
Цитотоксические препараты К ним относятся алкилирую- щие агенты, блокирующие синтез ДНК в премитотической фазе клеточного цикла. Цикл о ф ос фа ми д превращается в активное вещество только в печени. Его используют в тяжелых случаях васкулитов (системная красная волчанка, гранулематоз Вегенера и др) и при трансплантациях костного мозга. Х лорам б у ц ил отличается активным воздействием на В-лимфоциты, его применяют преимущественно при лечении злокачественных лимфом. из грибов Цикл ос пори н (cyclo- sporin) представляет собой высокогидрофобный циклический пептид из 11 аминокислот. В клетках млекопитающих для него есть рецептор — внутриклеточная молекула (белок с молекулярной массой 17 000), названная циклофилином (cyclophilin). Циклофилин присутствует во многих клетках организма, но эффект циклоспорина наиболее выражен именно в Т-лимфо- цитах, где комплекс циклоспорин — циклофилин вступает во взаимодействие с кальмодулином, который в свою очередь связывает Эти взаимодействия внутри Т-лимфо- цита приводят к нарушению процесса конформации (фолдин- га) факторов транскрипции, ив результате в Т-лимфоците становятся невозможными биосинтезы цитокинов — IL- 3, и др. В итоге подавляется иммунное воспаление В настоящее время циклоспорин используют как обязательный препарат для при транспланта- циях органов. Его применяют при агрессивных формах аутоиммунных болезней (псориаз, увеит, апластическая анемия, ревматоидный артрит, но следует помнить, что релапс наступает сразу после отмены препарата. Обычно циклоспорин назначают только в случае стероидрезистентных форм заболеваний. На фоне циклоспорина усиленно проявляется онкогенный потенциал герпес-вирусов — Эпштейна — Барр, саркомы и др. Неходжкинские развиваются у — 10 % пациентов, получающих продолжительные курсы циклоспорина. Все чаще стала манифестировать саркома Ка- поши у реципиентов органных трансплантатов — это тоже препарат из грибов, но имеющий иные структуру и акцептор в клетках млекопитающих, чем циклоспорин. FK506 враз сильнее, чем циклоспо- рин, подавляет биосинтез иммуноцитокинов IL-2, IL-5, IFN-y и др. Побочные эффекты те же, что у цикло- спорина. М и кофе но лова я блокирует синтез пуринов (следовательно, синтез ДНК, а также ингибирует гли- козилирование молекул адгезии (следовательно, взаимодействие клеток, в том числе в иммунном ответе) и пролиферацию гладкомышечных клеток ин активно подавляет пролиферацию В-лимфоцитов и синтез иммуногло- булинов. Р а па ми ц и н (rapamycin) нарушает функционирование протеинкиназ, обеспечивающих проведение сигналов внутрь клеток, в том числе лимфоцитов, блокирует пролиферацию лимфоцитов. Б рек вина р натрия) ингибирует синтезы пиримидинов, следовательно, ДНК. Вакцинация Вакцинация — целенаправленное введение в организм человека заданного антигена в неагрессивной форме ив неагрес- сивных, но иммуногенных дозах с целью индукции защитного иммунного ответа и формирования иммунологической памяти для профилактики реального инфекционного заболевания в будущем. Динамика индукции иммунологической памяти при вакцинации и реализации ее при вторичном иммунном ответе приведена на рис. Вакцинация теоретически — самый лучший метод иммунотерапии и иммунопрофилактики. Вакцинация — это анти- генспецифичная стимуляция иммунитета. Но при вакцинации есть свои проблемы, наиболее трудные из них мы рассмотрим. Первая проблема — биогенное (биотехнологическое) происхождение вакцинных препаратов, одна из сторон которого применение живых аттенуированных вирусных вак- цин. В «аттенуации» (манипуляциях по ослаблению патогенных свойств микроорганизмов in vitro или на животных) скрыта следующая проблема. Дело в том, что выпуская аттенуиро- ванного в лабораториях, но живого микроба в живые человеческие тела, мы не можем отменить и даже контролировать дальнейшую эволюцию микроорганизма в сторону нарастания его патогенности, генетических рекомбинаций с другими микроорганизмами (а таких фактов много) с образованием новых форм жизни. Поэтому как бы ни хорош был защитный эффект живых вакцин, применяя их, никто немо- жет реально прогнозировать персональный риск неблагоприятных последствий для конкретного человека, даже если большинству других людей такая вакцинация не приносит видимого вреда. Еще одна проблема уже обсуждалась выше. Она заключается в том, что вакцина — одна на всех людей в популяции, а антигенпредставляющие возможности молекулу каждого человека свои согласно семейной наследственности. Поэтому закономерным является то, что не каждого человека в принципе может защитить какая бы тони была стандартная вакцина. Кроме того, традиционными методами изготовления вакцинных препаратов пока не удалось получить протективных вакцин против многих инфекционных заболеваний (в частности, большинства венерических, паразитарных, многих вирусных. Многие применяемые вакцинные препараты содержат значительное количество (до 90 примесей, ломимо целе- вого(ых) антигена(ов). Более 20 лет в Институте иммунологии под руководством академика Р.В.Петрова и академика РАМН Р.М.Хаи- това идут работы по созданию принципиально новых вакцинирующих препаратов контролируемого содержания. В их основе определенные высокоочищенные антигены, в том числе синтетические или рекомбинантные аналоги протективных антигенов возбудителей. Носам по себе антиген — еще не вакцина. Для индукции протективного иммунного ответа существенно молекулярное сопровождение антигена или носители. В Институте иммунологии ведут приоритетные работы по созданию особых полимерных молекул-носителей для целевых антигенов. Эксперименты на животных показывают, что определенные полимерные носители в составе вакцинирующих препаратов позволяют индуцировать значимый иммунный ответу особей (линий животных, которые по генетическим причинам сами по себе слабо отвечают на данный антиген (фенотипическая коррекция иммунного ответа. Прошла успешные клинические испытания и получила разрешение на применение в клинической практике трехвалентная противогриппозная вакцина «гриппол». Эта вакцина уже несколько лет применяется для защиты населения от гриппа. Гриппол первая в мире вакцина, которая представляет собой химический конъюгат основного антигена вируса гриппа с полимерным иммуномодулятором. Разрабатываются аналогичные вакцинные препараты против бруцеллеза, брюшного тифа, лепры, туберкулеза. Эти разработки не имеют аналогов в мире. Делом разработчиков вакцин должны стать разумное решение проблем и создание вакцинирующих препаратов, удовлетворяющих необходимым критериям вакцина не должна быть источником побочной биологической опасности вакцина не должна индуцировать патогенные иммунные процессы (типа усиливающих инфекцию антител и др вакцина должна эффективно индуцировать протектив- иммунитет • если цель вакцинации, напротив, подавить какой-либо нежелательный иммунный процесс в организме, то вакцинный препарат должен индуцировать антигенспеци- фичную иммунологическую толерантность (те. ареактив- ность или делецию клона лимфоцитов врач-иммунолог должен уметь контролировать создание заданного иммунитета у человека с помощью лабораторных методов. Общая задача всей современной медицины и, вероятно, шире — всего общества, но отнюдь не только иммунологии, сосредоточиться, собраться с силами и начать настоящие разработки по созданию биологически безопасных и при этом эффективных в плане защиты от реального инфекционного заболевания вакцинных препаратов. Иммуностимулирующая терапия В результате интенсивных исследований отечественными учеными иммунотропных лекарственных средств стимулирующего назначения в настоящее время в клиническую практику внедрен ряд препаратов) синтетический полимер — полиоксидоний (оксидированное производное (авторы: Р.В.Петров, А.В.Некрасов, Р.М.Хаитов, Р.И.Атауллаханов и др. Механизм действия — стимуляция активности макрофагов, а также Т- и) миелопид (авторы Р.В.Петров, А.А.Михайлова и др) комплекс пептидов из кроветворного костного мозга свиней. В настоящее время ведутся успешные работы по химическому синтезу аналогичных пептидов. Механизм действия широкомасштабный препарат влияет практически на все компоненты иммунной системы) ликопид (авторы Ю.А.Овчинников, И.Б.Сорокина, Т.М.Андронова и др) — производное Первоначально препарат выделили из клеточной стенки бактерии, затем его воспроизвели химическим синтезом. В механизме действия на первый план выступает активация макрофагов. В отечественных справочниках по лекарственным средствам описан еще ряд препаратов (синтетических и природного происхождения) иммуностимулирующего назначения. Материалы по их составу и механизмам действия приведены в специальной периодической литературе и монографиях ПРИЛОЖЕНИЕ Избранные методы исследования в иммунологии Кратко остановимся всего на двух принципах методов исследования в иммунологии, которые являются основными методами «добычи» современных знаний о природе — клонировании и твердофазных иммуноанализах. /. Клонирование Клонирование — получение множества одинаковых копий некоторого биологического объекта. Клонируют организмы, отдельные клетки, отдельные гены. Возможность какого бы тони было клонирования в исследовательских целях основана на использовании фундаментального свойства живого вещества земной природы — способности к репликации, те. воссозданию, синтезу себе подобного. Размножение живого основано на свойстве нуклеиновых кислот синтезировать свою копию при участии полимераз, с использованием себя в качестве матрицы. Вслед за ДНК удваиваются клетки. Деление клеток позволяет воссоздать целый дочерний организм Клонирование животных инбредные линии мышей Иммунология как экспериментальная наука началась в конце прошлого века с выведения чистых линий мышей. Это пример клонирования организмов. Как уже отмечалось вначале учебника, мышами воспользовались потому, что это мелкие млекопитающие, имеющие продолжительность беременности 21 день, число детенышей в потомстве — 5—7 народы. Такие количественные параметры репродукции популяции позволяют в приемлемые для человека (относительно периода трудоспособной жизни и творчества исследователя) сроки провести инбридинг ив итоге вывести чистую линию мышей Инбридинг — близкородственное скрещивание родных братьев и сестер, родителей и детей. После нескольких инбредных скре- щиваний у потомков начинают взаимно пересаживать кожные лоскуты и для будущих скрещиваний отбирают только те пары, которые дольше других не отторгают трансплантаты друг друга. Вспомним, что быстрое отторжение трансплантата зависит от генов/анти- генов главного комплекса гистосовместимости, не очень быстрое от неглавных генов/антигенов гистосовместимости, которыми являются все белки организма. Поэтому понятно, что в результате инбридинга и отбора для скрещивания пар, все хуже и хуже отторгающих и, наконец, не отторгающих кожный трансплантат, получаются мыши генетически одинаковые — сингенные. Понятно, что син- инбредные мыши одного пола гомозиготны по всем генам, самцы отличаются от самок по генам хромосомы Y. Чистоту инб- редной линии необходимо контролировать и поддерживать, выбраковывая мутантов по возможности в каждом поколении или сне- обходимой достаточной регулярностью Клонирование клеток В начале х годов XX в. научились клонировать клетки. Для этого понадобилось разработать питательные среды, материалы для лабораторной посуды и термостаты-инкубаторы, условия которых смогли бы сымитировать для клеток млекопитающих внутреннюю среду организма. В течение 10—12 лет удавалось клонировать только опухолевые клетки, поскольку их собственным свойством является способность неограниченно делиться митозом. Г.Келлер и У.Мильштейн в 1974—1975 гг. разработали методику получения гибридных клеток, одна из которых опухолевая (миелома), вторая — нормальный лимфоцит (рис. П. Получающиеся гибридные клетки имели какую-то часть хромосом (следовательно, и свойств) нормального лимфоцита (другая часть хромосом выбрасывалась из клеток в течение первых делений, пока геном не стабилизировался) и какую-то часть — от опухоли. Росли только клетки, унаследовавшие способность к неограниченному делению. Параллельно в них шел биосинтез тех или иных продуктов нормального лимфоцита, например антител. Неограниченно делящиеся клетки позволяют себя клонировать, те. физически рассадить по одной (каждую в отдельную посуду) и получить клоны клеток — потомков одной клетки. Такие клетки назвали гибридомами. Если гибридома синтезирует антитела, то их называют нальными. Как показал опыт, все клетки клонированной гибридомы синтезируют одинаковые антитела и по специфичности активного центра, и по изотипу тяжелой цепи, те. моноклональные антитела не только продукт моноклона, но это и чистый препарат одинаковых иммуноглобулинов. В конце х годов научились выращивать in vitro и клонировать Т-лимфоциты. Это стало возможным только после открытия фактора роста для Т-лимфоцитов, позже названного IL- 2. Именно клонирование Т-лимфоцитов позволило открыть субпопу- ляции и и сделать множество других открытий в том числе идентифицировать ВИЧ (достаточные для исследования количества генов и белков вируса смогли наработать только на Т-лимфо- цитах, культивируемых in vitro в присутствии фактора роста. В-лим- фоциты без превращения их в гибридомы можно заставить делиться (что позволяет их клонировать, если инфицировать их вирусом Эпштейна — Барр (он трансформирует нормальные В-лимфоциты в опухоль из В-лимфоцитов). Клонирование генов. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) Следующим методическим этапом исследования природы «вглубь» стало клонирование генов. Еще его называют молекулярным клонированием, поскольку где там и белок, транслированный с этого гена. Когда говорят о белках то имеют ввиду Опухолевая клетка (мивлома) Нормальный иммунный лимфоцит О) Гибридная клетка Гибридная клетка Клонирование (рассаживание по клетке в лунку) гибридомы Рис. П. Получение гибридом. Клеточный реактор или мышь для массовой наработки гибридных клеток и их продуктов именно белки, синтезированные в той или иной системе экспрессии (в бактериальных клетках, дрожжевых клетках и др) с клонированного гена, который ввели (трансфицировали) в систему экспрессии. Таким образом молекулярное клонирование — это получение чистого клона гена и вслед за ним чистого клона молекул белка, кодируемого этим геном. Для того чтобы клонировать конкретный ген, сначала надо узнать первичную последовательность нуклеотидов этого гена, если не целиком (что, конечно, лучше всего, то хотя бы последовательности нуклеотидов по краям гена и соседние сними (фланкирующие последовательности. Таким образом, возможность развития методов молекулярного клонирования появилась после развития методов молекулярной биологии и биохимии нуклеиновых кислот, позволяющих определять первичную последовательность нуклеотидов (так называемый сиквенс, от англ. sequence — последовательность). Необходимо было также научиться искусственно синтезировать недлинные отрезки ДНК (20—30 нуклеотидов) со строго заданной последовательностью нуклеотидов. Их называют и используют в качестве затравки (праймера, от англ. priemer — инициатор, зачинщик) для синтеза длинных молекул ДНК, пользуясь естественным свойством природы, которое заключается в том, что все ДНК-полимеразы хотя и используют в качестве матрицы одну из цепей двойной спирали ДНК, но начать синтез могут только с двуспирального участка. Двуспиральный участок в нужном месте (вначале искомого гена) создают с помощью олигонуклеотидных праймеров, предварительно вызвав диссоциацию двойной спирали ДНК на одиночные цепи нагреванием до 92—95 С (термоденатура- ция). Научившись этому, а также открыв и выделив целый ряд ферментов, работающих с ДНК (рестриктазы эндо- нуклеазы, которые расщепляют цепь ДНК в специфических точках, термостабильные ДНК-полимеразы), молекулярные биологи разработали новый и очень мощный метод получения препаративных количеств копий заданного гена. В 1983 г. Кэри Б.Мюллис описал метод цепной полимеразной реакции (polymerase reaction, PCR) — ПЦР. Он догадался, как можно за один рабочий день биохимика получить 100 млрд копий заданного гена. Если так много ненужно, то за 20 циклов реакции (это золотая середина, при которой и количество продукта достаточное, и ошибок накапливается в пределах терпимого, можно получить копий искомого гена (это примерно 1 млн). За прошедшие 17 лет этот метод использовали столь широко по всему миру, что возникло большое количество конкретных методик (гнездная ПЦР, RT/PHK — ПЦР, вырожденная ПЦР, ПЦР с горячим стартом и т.д.). Суть и техническое исполнение самой ПЦР просты (рис. П. Сложно то, что необходимо сделать перед этим Рис. П. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). 1 — ДНК цикл ПЦР: а — термоденатурация (94—96 б — отжиг праймеров (40—60 в — элонгация цепи (72 Если η — число циклов реакции, то число получаемых в результате копий заданного гена равно не ошибиться в определении сиквенса ДНК искомого гена и/или фланкирующих последовательностей, не ошибиться в синтезе прай- меров, запастись высококачественными исходными реагентами. В самом простом варианте реакция выполняется следующим образом. В одну пробирку вносят все компоненты реакции сразу, т.е. смешивают ДНК (содержащую искомый ген, два вида олигонукле- отидных праймеров, один из которых комплементарен последовательности нуклеотидов одной из цепей ДНК вначале гена (или по соседству с левого фланга, второй комплементарен последовательности нуклеотидов второй цепи в конце гена (или по соседству с «правого фланга, добавляют 4 типа фатов (из которых строится ДНК, термостабильную ДНК-полиме- разу Taq (из термофильной бактерии Thermus солевой буфер (с оптимальным для работы фермента солевым составом). Общий объем реакционной смеси может быть всего несколько десятков микролитров (или по потребности. Пробирку тщательно закрывают плотной пробкой и ни разу не открывают до конца реакции. Один цикл реакции представляет собой следующее. 1. Термоде- натурация: пробирку нагревают до 94—96 в течение 1—2 мин, при этом цепи двойной спирали ДНК несколько расплетаются вколи- честве, достаточном, чтобы праймеры могли присоединиться к своим комплементарным последовательностям. 2. Гибридизация (отжиг) праймера: чтобы это произошло, пробирку охлаждают до оптимальной для отжига температуры 40—60 3. Элонгация — биосинтез двойной спирали ДНК от праймеров ив сторону конца пробирку нагревают до оптимальной для элонгации температуры 72 Цель одного цикла достигнута — получены две копии заданного гена. Общее время одного цикла — от 5 домин (в зависимости от объема реакционной смеси и параметров прибора — ера). Можно проводить второй цикл — нагревать пробирку вновь дои все повторить, итак раз (сколько требуется и какое качество воспроизведения гена необходимо. За 20 циклов получают около 1 млн одинаковых копий одного искомого гена. Итоговый продукт анализируют (электрофорезом в геле) и препаративно выделяют из реакционной смеси (разными методами, например аффинной гибридизацией на твердой фазе или препаративным электрофоре- зом). Получив столь мощный метод биосинтеза отдельных генов в чистом виде, стали делать трансгенных мышей и мышей с направленным разрушением определенного гена — мышей с генетическим knock-out. Это два самых сильных гносеологических метода исследования в современной биологии. Разрешающий уровень — отдельный ген и даже отдельные участки определенного гена. Вероятно, это методически предельный уровень раскладывания природы по полочкам, ибо дальше дробить некуда — отдельные атомы в молекуле уже не несут признаков биологической специфичности Трансгенные мыши Трансгенная мышь — это мышь, в геном которой введен посторонний экзоген. Чтобы сделать трансгенную мышь, необходимо иметь в качестве препарата чистую ДНК, строго воспроизводящую последовательность заданного экзогена (как минимум. Обычно к ДНК экзогена с определенным смыслом пристраивают еще регуляторные последовательности ДНК — промоторы и энхансеры. Получают вектор экспрессии. «Готовят» мышь-самку: ей вводят фолликулостимулирующий гормон и хорионический гонадотропин для индукции суперовуляции. Такую самку спаривают с самцом, после чего из самки быстро извлекают оплодотворенные яйцеклетки. Микроманипулятором в мужской пронуклеус инъецируют ДНК экзогена в дозе несколько сот копий, и такие яйцеклетки имплантируют в матку или яйцеводы другой подготовленной псевдобеременной самки. И ждут от нее потомства. Опыт показывает, что примерно 25 % новорожденных мышат несут экзоген (теперь уже трансген) в своем геноме. Экзогены ковалентно встраиваются (интегрируются) водно или до нескольких десятков мест собственного генома мыши (кстати, как ретрови- русы ВИЧ. Если в собственном геноме нет генов, гомологичных экзогену, то встраивание экзогена происходит в случайные места генома. Встраивание осуществляется очень быстро после ввода экзогенной ДНК в пронуклеус — до первой репликации ДНК зиготы, так как большинство мышей, получивших экзоген (75 имеют его в каждой клетке своего тела, включая гаметы. Интересно, но факт, что встраивание чужеродной ДНК в геном в большинстве случаев допускает нормальное развитие и рождение организма, разумеется, если трансген не кодирует синтез токсичного для организма белка. В первом поколении мышей трансген находится в гетерозиготном состоянии. Таких мышей спаривают, и во втором поколении отбирают гомозигот по трансгену. Вот они уже и есть полноценные трансгенные Дополнение трансгена тканеспецифичными и/или индуцибельны- ми промоторами позволяет манипулировать экспрессией трансгена по усмотрению экспериментатора (не во всех клетках, а только, например, в Т-лимфоцитах или только в островков Лан- герганса, непостоянно, а только после введения в организм индуктора. Таким образом можно изучить, как будут проходить развитие и жизнедеятельность организма при излишней экспрессии определенного гена (overexpression). Генетический нокаут (или направленный мутагенез Метод нокаута генов — это метод получения клеток или целых организмов (мышей, в которых целенаправленно разрушен определенный ген. Для того чтобы это сделать, необходимо иметь 1) клонированный заданный ген 2) два методических гена для целей селекции искомых клеток с удачно инактивированным геном и соответствующую селективную среду культивирования 3) особую уникальную линию перевивных стволовых эмбриональных клеток мышей — ES (embryonic stem cell line), которые сохраняют способность дифференцироваться в надлежащих условиях вовсе без исключения типы клеток организма мыши и, кроме этого, здоровых мышей и трудолюбие примерно на год упорной работы. Такой метод основан на природном феномене гомологичной рекомбинации При половом размножении живых организмов природа «предусмотрела» мейоз и кроссинговер в мейозе, при котором про HSV-tk |