Иммунология Хаитов. В. Н. Ярыгин профессор, академик рамн, ректорРоссийского государственного медицинского университета академик рамн, председатель Уральского отделения ран. Хаитов P. M., Игнатьева га, Сидорович И. Г
 Скачать 6.93 Mb.
|
|
О Рис. П.З. Метод генетического нокаута (гомологичной рекомбинации, или направленного мутагенеза — искусственная генетическая конструкция, содержащая разрушенный заданный ген (разрушение достигается встраиванием внутрь данного гена постороннего гена, например и специальные гены, которые в дальнейшем позволят провести метаболическую селекцию нужных клеток 1 — HSV- tk — тимидинкиназы вируса простого герпеса 2 — заданный ген, внутрь которого встроен ген резистентности к — схема собственно гомологичной рекомбинации 3 — хромосома в клетке, несущая нормальный искомый ген 4 — искусственная генетическая конструкция — трансген (1) находит в клетке именно хромосому (3) благодаря наличию в трансгене некоторого, но достаточного количества последовательностей нуклеотидов, комплементарных последовательностям в нормальном (гомологичные последовательности спариваются 5 — между последовательностями нуклеотидов нормального гена и последовательностями трансгена происходит обмен — это и есть гомологическая рекомбинация ДНК, в результате на месте нормального гена оказываются мутантные последовательности и клетка- носитель такого гена лишается функций и продукта нормального гена 6 хромосома, которой достался ген тимидинкиназы вируса простого герпеса. Клетки, имеющие такие хромосомы, погибнут в селективной среде с ганцикловиром; 7 — хромосома, в которую на месте нормального гена встроился ген с включением гена резистентности к неомицину клетки, имеющие такую хромосому, выживут в среде с неомицином, что и позволит их отделить от ненужных вариантов клеток. Сначала делают искусственную генетическую конструкцию (трансген), содержащую последовательности ДНК, гомологичные ДНК заданного гена. Внутрь этой гомологичной последовательности встраивают постороннюю ДНК методического назначения, например ген резистентности к неомицину Такая вставка и является разрушителем нормальной структуры гена, превращающая в мутантный. Рядом на коротком, но значимом расстоянии исходят физическое сближение гомологичных генов в гомологичных хромосомах и обмен участками ДНК между гомологичными генами. Оказывается, если в клетку ввести отдельный то он тоже в состоянии найти в хромосомах гомологичный себе ген (одноименный) и вступить с ним в гомологичную рекомбинацию, те. произвести обмен участками ДНК. С целью направленного мутагенеза, или нокаута, заданного гена в клетку вводят не интактный гомологичный гена умышленно поврежденный. Дальше все происходит по природным механизмам поврежденный, но гомологичный экзоген находит одноименный интактный клеточный ген, вступает с ним в гомологичную рекомбинацию ив результате в хромосоме на месте прежнего интактного гена появляется поврежденный Цель достигнута. Учитывая выдающиеся возможности этой методики, опишем ее подробнее (рис. П.З). В качестве методических генов используют обычно два — ген резистентности к неомицину и ген вирусной тимидинкиназы из вируса простого герпеса Если вне- кой клетке есть ген то такая клетка способна жить в присутствии препарата — аналога неомицина G418. Клетки, не имеющие гена погибают в присутствии Если в клетке есть вирусный ген HSV-tk, то такая клетка погибнет при добавлении в среду культивирования противовирусного препарата ганцикловира. Клеткам, не имеющим гена HSV-tk, ганцикловир не страшен. Сначала в ДНК препарата заданного гена (те. in vitro) примерно в середину последовательности встраивают ген Сбоку на некотором расстоянии пристраивают ген HSV-tk. Это и есть экзогенети- ческая конструкция, необходимая и достаточная для попытки направленного мутагенеза в какой-либо клетке. Для создания целой мыши без заданного гена используют клетки линии ES. них транс- фицируют описанную выше генетическую конструкцию, клетки помещают в селективную культуральную среду, содержащую и ганцикловир. Возможны 3 варианта внутриклеточной «судьбы» кой конструкции) она не встраивается в хромосомы и бесследно теряется при делении клетки. Такие клетки, просто ES, погибают в селективной среде от отравления препаратом присоединяют ген селективного назначения, например тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV-tk). Такой искусственный трансген вводят в клетки линии (эмбриональные стволовые клетки мыши. Рассчитывают на то (итак оно и происходит в действительности, что трансген вступит в гомологичную рекомбинацию с гомологичным геном клетки. В результате в культуре образуется типа клеток, которые можно отделить (точнее, выделить единственный искомый) на селективной среде, содержащей иеомицин (яд для клеток, не имеющих гена резистентности к неомицину) и ганцикловир (яд для клеток, несущих ген тимидинкиназы вируса простого герпеса). Клетки, не включившие трансген, погибают под действием неомицина; клетки, встроившие трансген в случайные места в хромосомах, погибают под действием ганцикловира; и только искомые клетки, в которых в результате гомологичной рекомбинации на месте нормального гена встроился разрушенный ген с включением выживают на среде с неомицином и ганцикловиром, вместе взятыми 2) экзогенетическая конструкция встраивается в случайные места в геноме. При этом она, как правило, сохраняет свою целостность и несет и ген и ген HSV-tk. Такие клетки тоже погибают в селективной среде, но под действием) экзогенетическая конструкция находит гомологичный клеточный ген и вступает с ним в гомологичную рекомбинацию. Эти клетки и есть искомые. При этом хвост с геном HSV-tk (он вне гомологичной области) выщепляется и теряется при делении клетки. Ген поскольку он расположен в середине гомологичной последовательности ДНК, как раз оказывается встроенным в хромосому. В результате искомые клетки несут ген ноне несут ген HSV- tk и поэтому способны жить и делиться на селективной среде, содержащей и G418, и ганцикловир. Таким образом их и выделяют из массы ненужных клеток. В описанном варианте направленный мутагенез, или нокаут гена, произошел на одной из гомологичных хромосом. Его можно выполнить и на обеих гомологичных хромосомах, для чего нужны еще два других методических гена для селекции. Но мышей с нокаутом гена можно получить ив случае нокаута одного из гомологичных генов в клетках ES. Для этого поступают следующим образом. От «свежезабеременевшей» мыши выделяют эмбрионы на стадии блас- тулы (или проводят оплодотворение in vitro). В бластулы инъецируют одномутированные клетки ES и имплантируют подготовленной псев- добеременной самке. Из такой сконструированной бластулы развиваются здоровые эмбрионы, рождаются мышата-мозаики, часть клеток которых во всех тканях, включая половые клетки, происходит из одномутированных клеток ES. Поскольку половые клетки гапло- идны, то часть из них несет в чистом виде нокаутированный ген. Таких мышат используют для инбредного размножения, ив потомстве второго поколения какая-то часть мышат обязательно получается гомозиготной по нокаутированному (испорченному Это и есть конечная цель работы. Чтобы удостовериться в правильности полученного результата, выполняют контрольную ПЦР на ген Таких мышей можно размножить инбридингом и получить необходимое и достаточное для запланированной работы число особей с заданным генетическим нокаутом (тес отсутствием функционально дееспособного гена). Получить организм с генетическим нокаутом можно только в отношении генов, отсутствие которых тем не менее позволяет организму развиться, родиться и начать жить. Если какой-то ген абсолютно необходим для реализации онтогенеза организма, то нокаут поэтому гену можно осуществить в перевиваемых in vitro клетках ив какой-то мерена моделях in vitro исследовать последствия отсутствия гена для жизнедеятельности клетки. Этим исследовательские возможности метода не исчерпываются. Можно получить библиотеку экзогенов, в которых «методический» ген (а собственно, его внедрение и нарушает генетический код, т.е. является мутирующим фактором) повреждает разные участки исследуемого гена. Одним из генов библиотеки производят нокаут. Затем в отдельные нокаутированные клетки трансфицируют интактный ген (если происходит реставрация экспрессии соответствующего белка, то это является доказательством от противного того, что исходно сделанный нокаут был истинным, а также по одному разные гены из библиотеки поврежденных. Анализируют, не произойдет ли реставрация экспрессии продукта в случае ретрансфекции каких-то генов из поврежденных. Таким образом удается установить функциональную нагрузку разных участков одного гена Методы иммуноанализов Как Вы помните, еще в е годы после работ по получению антител к искусственно синтезированным к антителам стали относиться как к специфическим реагентам избирательно связывающим то или иное вещество (способное быть антигеном для иммунизации животного, и, следовательно, антитела можно использовать для обнаружения и определения количества этого вещества в тех или иных смесях Иммуноанализами называют различные тест-системы для выявления какого-либо вещества, в которых ключевой специфической реакцией является связывание антитела с антигеном Антитела — растворимые молекулы белков. Антигены бывают разные, но далеко не все видны невооруженным глазом и большинство также растворимые. Связывание двух растворимых молекул часто приводит к образованию также растворимого комплекса, следовательно, невидимого глазом. Поэтому с технической стороны разные тест-системы иммуноанализов различаются между собой средствами визуализации факта связывания антитела сан- тигеном. С хи до концах годов методы визуализации комплексов антиген — антитело представляли собой преципитацию в геле (методы Манчини, разнообразные иммуноэлектрофоре- зы в гелях, — те. выпадение этих комплексов в осадок, а также гемолиз или гемагглютинацию, те. использовали хорошо видимые эритроциты, на поверхность которых сорбировали либо антиген, либо (реже) антитела. До настоящего времени в некоторых случаях эти методы применяют (например, метод Манчини) для определения содержания иммуноглобулинов классов Ми А в сыворотке крови. Но для определения уровня метод преципитации в геле уже неприменим, так как не хватает его чувствительности (как той наименьшей концентрации искомого вещества, которая еще может быть достоверно определена данным методом). В фундаментальных исследованиях по иммунологии используют все известные в естественных науках методы. Самые современные методы в иммунологии — это методы молекулярной биологии и молекулярной генетики. В прикладной клинической иммунологии методическая база не столь широка. Применяемые методы можно разделить на 6 категорий. По сути иммунологическими методами называют такие методы, в которых так или иначе визуализируются реакции антиген — антитело Методы фракционирования — физического разделения гуморальных факторов иммунитета (молекул) или клеток электрофорезы; — проточная микроцитофлюорометрия. • Методы, использующие партикулярные антигены (непосредственная агглютинация антигена латекс-аг- глютинация, нефелометрия Методы, использующие технологию гемолиза (тесты фиксации комплемента, метод Йерне). • Иммуногистохимические методы (иммунофлюоресцентная 377 микроскопия микроскопия препаратов тканей или клеток с фиксированными антителами, меченными ферментной меткой Методы иммуноанализов (радиоиммуноанализ, иммунофер- ментный анализ Методы молекулярной биологии полимеразная цепная реакция иммуноблоттинг (определяет белки); (определяет ДНК (определяет РНК)]. Кратко рассмотрим только методы иммуноанализов как наиболее широко применяемые Б клинической диагностике в самых разных областях медицины. Как правило, термин иммуноанализы используют не вообще в случае любого анализа в иммунологии, а конкретно применительно к и радиоиммунным методикам определения тех или иных растворимых веществ в самых разных их модификациях называют такие методы качественного и количественного определения растворимых веществ, в основе которых лежит взаимодействие антигена с антителом (те. иммунологическое распознавание, которое детектируется (визу- ализуется) с помощью специальной метки, заранее конъюгированной либо с антителом, либо с антигеном. В качестве меток используют вещества, которые при определенных условиях может увидеть либо тот или иной прибор, либо глаз человека. Приборы могут не только увидеть, но и измерить количество метки. Метки: 1) радионуклид, анализ называют радиоиммунным (РИА); 2) ферменты, катализирующие превращение субстрата с образованием цветного или флюоресцирующего продукта. В данном случае анализы называют иммуноферментными или, как разновидность, иммунофлюоресцентными; 3) флюоресцирующие или вещества и др. В случае РИА результат измеряют на тех или иных счетчиках радиоактивности в зависимости оттого, какие частицы или кванты излучает конкретная метка-радионуклид. Результаты РИА нельзя зарегистрировать без приборов. В случае ИФА при образовании цветного продукта результат реакции определяют с помощью спектрофотометра, измеряющего поглощение света с определенной длиной волны. Без прибора на глаз реакцию можно оценить качественно да или нет. При использовании в качестве метки фермента, катализирующего образование флюоресцирующего продукта, результат реакции определяют на измеряющем излучение в определенном диапазоне длин волн. Без прибора в данном случае не обойтись. Принцип любого иллюстрирует рис. Первыми были разработаны методы РИА в самом начале х годов. За разработку РИА Розалин Ялоу была удостоена Нобелевской премии. Менее чем через год после описания РИА в качестве Рис. П. Общий принцип иммуноанализов. 1 — антиген 2 — антитело 3 — метка (фермент, радионуклид, краситель). метки стали использовать ферменты, и появились ИФА. По чувствительности и специфичности РИА и ИФА одинаковы, так как эти показатели определяются антителом и антигеном, а не качеством метки. Однако ИФА применяется значительно шире, чем РИА, главным образом потому, что реагенты для ИФА существенно более стабильны во времени и, следовательно, технологию ИФА проще стандартизировать, чем РИА. В РИА используют радионуклиды, которые излучают непрерывно, и радиоактивность их также непрерывно изменяется со временем. Для мечения белков применяют радионуклиды йода, у которых период полураспада весьма короток и реагенты необходимо обновлять примерно разв Первые разработки иммуноанализов были в так называемых гомогенных вариантах, или без разделения компонентов, те. в растворе. Но вскоре стали использовать твердую фазу, анализы стали называть твердофазными или с разделением компонентов, или иммуно- сорбентными (по-английски — ELISA — Enzyme-Linked Immuno- sorbent Assay). Технологически твердофазные анализы несравнимо удобнее гомогенных, ив настоящее время применяют только твердофазные варианты методик ИФА. На твердую фазу сорбируют либо антиген, либо антитело. В качестве такой фазы используют следующие материалы) пластмассу (полистиролы, поливинилхлориды) в виде стандартно штампованных микропанелей с 96 или 60 лунками (или шарики, колпачки и т.п. для постановки единичных проб в пробирках) пористые материалы типа нитроцеллюлозы в виде наполнителей в объеме или в виде плоских листов или полосок (стрипов). Стрипы используют в методиках типа иммуноблоттинга и иммуно- хроматографии. В пористых материалах часть реагентов фиксирован- но сорбирована, а другая часть диффундирует по порам. Принцип иммуноанализов заключается в том, что на материале твердой фазы просто в соответствии с физико-химичес- кими свойствами сорбируется либо антиген, либо антитело (рис. Если заданный антиген в силу своей химической природы плохо сорбируется на выбранной твердой фазе, то подбирают посредника подложку, которая с одной стороны хорошо свяжет твердую фазу, с другой — антиген. Практически потребность в подложке возникает крайне редко. Все остальные реагенты тест-системы используют в виде растворов. Их добавляют поочередно, и реагенты легко удаляют отмывкой твердой фазы (в этом главное технологическое преимущество твердофазных иммуноанализов). Результат реакции остается на твердой фазе, на которой его регистрируют количественно. Существует много вариантов конструкций тест-систем для имму- ноанализов. Мы разберем всего несколько базисных, на которых проиллюстрируем значения терминов 1 2 П. Твердофазный — на твердой фазе сорбирован антиген 2 — на твердой фазе сорбированы антитела Прямые иммуноанализы Прямыми называют анализы, в которых метку присоединяют либо к заданному антигену, либо к специфичному против заданного антигена антителу непосредственно. Прямой вариант используют в гомогенных системах и некоторых гетерогенных в конкурентном, ингибитор- ном, сэндвич-ИФА и иммуноферментометрическом анализе. Конкурентный ИФА (рис. П. Если целевой антиген — какое-либо вещество, подлежащее определению в биологических жидкостях, тона твердой фазе сорбируют антитела к этому антигену. Антиген-пре- парат метят ферментом. При проведении анализа к твердой фазе добавляют испытуемую биологическую жидкость и меченый антиген. Последний конкурирует с антигеном в испытуемой пробе за иммобилизованные на твердой фазе антитела. В результате реакции ферментативная активность на твердой фазе оказывается обратно пропорциональной концентрации определяемого в пробе антигена ИФА (рис В ингибиторном ИФА на твердой фазе иммобилизуют антиген. Растворимые антитела как реагент конъюгированы с ферментом. Определяемый антиген в испытуемой пробе конкурирует с иммобилизованным на твердой фазе антигеном за растворимые антитела. В итоге ферментативная активность, измеряемая на твердой фазе, обратно пропорциональна концентрации определяемого вещества в пробе. Рис. П. Конкурентный иммуноанализ. 1 — антитела иммобилизованы на твердой фазе 2 — чистый меченый антиген — биопроба, испытуемая на содержание антигена. Меченый антиген конкурирует с антигеном в испытуемой пробе за иммобилизованные на твердой фазе антитела. Результат реакции на твердой фазе обратно пропорционален концентрации определяемого антигена в пробе П. Ингибиторный 1 — антиген, иммобилизованный на твердой фазе 2 — биопроба с антигеном — меченые антитела. Антиген из биопробы конкурирует с антигеном на твердой фазе за растворимые меченые антитела. В итоге результат реакции на твердой фазе обратно пропорционален концентрации определяемого вещества в пробе. Сэндвич-ИФА (рис. П. Сэндвич-ИФА разработан для антигенов, на которых есть не менее двух неперекрывающихся эпитопов. Против обоих эпитопов получают в качестве реагентов специфичные антитела. Антитела к одному из эпитопов сорбируют на твердой фазе. Испытуемую пробу добавляют к твердой фазе, инкубируют, отмывают. После отмывки вносят конъюгат антител ко второму эпитопу с ферментом Ферментативная активность, остающаяся на твердой фазе, прямо пропорциональна содержанию антигена в пробе. Сэндвич-ИФА не требует препаратов очищенных антигенов, что выгодно отличает его от конкурентных и ингибиторных методик, поскольку чистые антигены всегда дороги. Чувствительность сэндвич- потенциально выше, чем конкурентных и ингибиторных. Аналогичная технология применима и с использованием одного антитела (и на твердой фазе, ив составе конъюгата с ферментом) в случаях наличия на целевом антигене повторяющихся эпитопов. В современных модификациях туже технологию называют ловушечным ИФА (capture IA) — антитела на твердой фазе ловят свой антиген из смеси веществ в биопробе. |