Вирусология. вирь. Вакцин требует знаний структурных и функциональных особенностей вирусных антигенов, различаемых иммунной системой организма. Вирусными антигенами

• Название: Вакцин требует знаний структурных и функциональных особенностей вирусных антигенов, различаемых иммунной системой организма. Вирусными антигенами
• Анкор: Вирусология
• Дата: 14.04.2022
• Размер: 2.43 Mb.
• Имя файла: вирь.doc
• Тип: Документы; #473988
• страница: 10 из 31

В качестве тест-объектов в лабораториях обычно используют белых мышей, куриные эмбрионы и культуры клеток, у которых инфекционное действие вируса может проявляться гибелью, клиническими симптомами, патологоанатомическими изменениями и цитопатическим эффектом. Для каждого вируса подбирают чувствительный к нему тест-объект и форму учета его инфекционного действия, по которой оценивают эффект заражения. В зависимости от вида тест-объекта и формы проявления инфекционного действия ЭД₅₀ принимает один из следующих видов, приведенных в таблице 6.

Иначе говоря:

1 ЛД₅₀—это доза вируса, убивающая 50 % лабораторных животных (обычно белых мышей);

1 ИД₅₀—доза вируса, вызывающая клинические симптомы или патологоанатомические изменения у 50 % зараженных лабораторных животных;

1 ЭЛД — доза вируса, убивающая 50 % куриных эмбрионов;

1 ЭИД₅₀—доза вируса, вызывающая патологоанатомические изменения у 50 % зараженных куриных эмбрионов;

1 ЦПД₅₀— доза вируса, вызывающая цитопатический эффект у 50 % зараженных культур клеток (обычно пробирок с культурами клеток).

Количество ЭД₅₀ (ЛД₅₀, ИД ЭЛД₅₀, ЭИД₅₀ или ЦПД₅₀) вируса, содержащееся в единице объема вируссодержащего материала, и будет выражением титра (Т) вируса в этом материале. Например, Т=10^3,48 ЦПД₅₀/0,1 мл означает, что в каждой 0,1 мл вируссодержащего материала содержится 10³'⁴⁸ доз вируса (т. е. более 1000, но менее 10 000, а именно 10^3,48=3020), каждая из которых способна вызвать цитопатический эффект в 50 % пробирок с культурой клеток.

Названные единицы 50%-ного инфекционного действия вируса (ЛД₅₀, ИД₅₀, ЭЛД₅₀, ЭИД₅₀, ЦПД₅₀) используются в случаях оценки инфекционного действия вируса со статистически оцениваемым эффектом, имеющим место, когда учет инфекционного действия вируса ведется по летальному действию, клиническим симптомам, патологоанатомическим изменениям или цитопатическому действию.

Титрование вирусов по 50%-ному инфекционному действию — наиболее универсальный прием, пригодный для титрования практически любого вируса, если подобрать чувствительную к нему живую систему (текст-объект). Однако этот метод титрования вирусов довольно трудоемкий, длительный и требует статистических расчетов.

Задача определения титра вируса в единицах 50%-ного инфекционного действия (ЛД₅₀, ИД₅₀, ЭЛД₅₀, ЭИД₅₀, ЦПД₅₀) сводится к тому, чтобы найти такое разведение испытуемого вируссодержащего материала, в объеме заражающей дозы которого содержалась бы одна ЭД₅₀, а затем рассчитать, сколько таких единиц вируса содержится в таком же объеме вируссодержащего материала, что и будет показателем титра вируса в этом материале.

Чтобы решить эту задачу, сначала из исследуемого вируссодержащего материала готовят ряд последовательных 10-кратных разведений. 10-кратные разведения берут по двум причинам:

во-первых, как видно из графика зависимости инфекционного эффекта от дозы вируса (рис. 35), кривая этой зависимости вблизи точки, соответствующей ЭД₅₀, на значительном отрезке приближается к прямой.



Рисунок 35. График зависимости инфекционного эффекта от дозы вируса

Это означает, что в определенных пределах, центр которых в точке ЭД₅₀, между логарифмом дозы (разведения) вируса и инфекционным эффектом существует прямолинейная зависимость, т. е. величина инфекционного эффекта пропорциональна логарифму дозы вируса (или его разведения), в области малых и особенно больших доз эта зависимость нарушается;

во-вторых, при 10-кратном разведении облегчаются последующие расчеты.

Одинаковыми объемами каждого из 10-кратных разведений исследуемого вируссодержащего материала заражают равные группы чувствительных к данному вирусу живых тест-объектов (мышей, куриных эмбрионов или культур клеток). При этом в каждой группе должно быть не менее 4—6 тест-объектов, так как при меньшем количестве статистически рассчитываемая величина титра вируса будет иметь слишком большую погрешность (статистическая величина тем точнее, чем на большем количестве исходных данных она основана).

После заражения учитывают результат действия вируса (гибель, клинические симптомы, патологоанатомические изменения или ЦПЭ) на зараженные объекты и определяют, в каком разведении вирус проявил свое действие на 50 % чувствительных объектов. Разведение, дающее 50%-ный эффект, рассчитывают методом прямолинейной интерполяции. Когда такое разведение нашли, то считают, что в заражающем объеме вируса, разведенного в найденное (соответствующее 50%-ному эффекту) число раз, содержится 1 ЭД₅₀. В таком же объеме исходного (неразведенного) вируссодержащего материала таких доз (ЭД₅₀) содержится больше во столько раз, во сколько был разведен материал, давший 1 ЭД₅₀. Затем пересчитывают, сколько таких единиц 50%-ного инфекционного действия вируса содержится в единице объема (мл) вируссодержащего материала, что и будет выражением титра вируса в данном материале.

30. 
    Понятия о гене и геноме вирусов. Вирусная популяция, вирусный штамм, вирусный клон.
    

Все ДНК-вирусы и многие группы РНК-вирусов имеют геномы, состоящие из одной молекулы нуклеиновой кислоты. Геном некоторых других РНК-вирусов состоит из нескольких отдельных молекул РНК. Если определить ген как нуклеотидную последовательность, кодирующую один полипептид, то можно оценить число генов у разных вирусов, исходя из имеющихся данных о количестве нуклеиновой кислоты в инфекционной частице. Такой подсчет основан на следующих предположениях: 1) в генетической системе вирусов, так же как и у других организмов, используется неперекрывающийся триплетный код (в этом нет оснований сомневаться); 2) в вирусных нуклеиновых кислотах нет длинных повторяющихся последовательностей; 3) вся вирусная нуклеиновая кислота кодирует полипептиды [прежнее предположение (Субак-Шарп и Хей, 1965) о том, что вирус герпеса кодирует некоторые тРНК, сейчас отвергнуто (Белл и др., 1971)]; 4) «средний» вирусный полипептид состоит примерно из 500 аминокислот и имеет мол. вес около 50 000 [эта цифра лучше согласуется с экспериментальными данными, чем цифра 20 000, принятая ранее (Феннер, 1968): средний молекулярный вес 70 вирусных белков, включая гликопротеиды, оказался равным 55 000]; 5) каждый вирусный полипептид кодируется уникальной последовательностью нуклеотидов.

Универсальность последнего положения вызывает сомнения, так как возможно, что у некоторых РНК-вирусов посттрансляционное расщепление полипептидов происходит неоднозначно (Купер и др., 1970b), а у некоторых ДНК-вирусов структурные белки могут состоять из белков-предшественников и образовавшихся из них полипептидов (Кац и Мосс, 1970а). Кроме того, имеется серьезная семантическая проблема. РНК пикорнавирусов, действуя как мРНК, транслируется в одну гигантскую белковую молекулу, которая затем последовательно расщепляется. Возникает вопрос: имеют ли такие вирусы только один ген или же образующиеся в конечном счете белки должны рассматриваться как продукты отдельных генов? Мы будем придерживаться второй интерпретации как более удобной при рассмотрении функций генов.



Даже с учетом того, что электрофорез в геле не выявляет всех полипептидов сложных крупных ДНК-вирионов, очевидно, что структурные белки соответствуют лишь меньшей части генов этих вирусов. Остальные гены, по-видимому, кодируют ферменты, участвующие в репликации ДНК, регуляторные белки, а в случае поксвирусов, возможно, даже ферменты, участвующие в синтезе вирусных полисахаридов и липидов.

У вирусов с фрагментированным геномом (ортомиксовирусы и реовирусы) каждая молекула РНК соответствует одному гену. Имеется достаточно хорошее соответствие между числом фрагментов генома и рассчитанным числом генов. По-видимому, у большинства РНК-вирусов по меньшей мере половина генома кодирует структурные белки.

вирусная «популяция» чаще всего представляет собой суммы полноценных вирионов и дефектных образований, т. е. фактически мертвого материала. Такого рода «популяции», состоящие из живых и мертвых особей, невозможно даже представить в мире организмов. В некоторых случаях сумма дефектных частиц с дефектами в разных участках генома может обеспечить развитие вирусной инфекции (феномен множественной реактивации).

31. 
    Правила работы с вируссодержащими материалами.
    

1.1 Техника безопасности и правила работы с вируссодержащим материалом

При работе с вируссодержащим материалом необходимо выполнять следующие требования:

• 
  не допускать рассеивания вирусов во внешней среде;
  
• 
  предотвратить контаминацию (загрязнение) вируссодержащего материала посторонней микрофлорой;
  
• 
  обеспечить личную безопасность.
  

Режим работы виру­сологической лаборатории регламентируется законами Российской Федерации, международными пра­вилами проведения диагностических лабораторных исследований, правилами внут­реннего распорядка. Весь персонал лаборатории проходит инструктаж и обучение безопасным методам труда, обеспечивается спецодеждой, спецобувью, средствами санитарной защиты и защитными приспособлениями в соответствии с действую­щими нормами. Вход в производственные помещения посторонним лицам катего­рически запрещен. Сотрудники вирусологической лаборатории обязаны соблюдать правила работы, предупреждающие загрязнения бактериями и грибами исследуе­мого материала, возможность заражения персонала и распространения инфекции.

Запрещено выходить за пределы лаборатории в халатах и спецобуви или надевать верхнюю одежду на халат, курить, принимать пищу в производственных помеще­ниях и хранить в них продукты питания. В боксе работают в стерильном халате, маске, шапочке, в некоторых случаях надевают очки и перчатки. Обязательно меня­ют обувь. Не допускаются хождение и разговоры во время работы.

Весь материал, поступающий в лабораторию на исследование, должен рас­сматриваться как инфицированный! С инфекционным материалом следует об­ращаться крайне осторожно. При распаковке его банки необходимо протирать снаружи дезинфицирующим раствором и ставить их на поднос или в кювет. Рабочее место на столе покрывают несколькими слоями марли, увлажненной 3 – 5 % раствором хлорамина. Жидкости, содержащие вирусы, переливают над кюветами с дезинфицирующим раствором. При работе с пипеткой поль­зуются грушей. Пипетки, предметные стекла, стеклянную посуду и резиновые изделия, задействованные в работе с инфекционным материалом, обеззаражива­ют погружением в 5 % раствор хлорамина или растворы фенола, лизола, серной кислоты. Запрещается выносить из лаборатории оборудование, инвен­тарь, материалы и т. д. без предварительной их дезинфекции. По окончании работы рабочее место приводят в порядок и дезинфицируют. Вирусосодержащий материал, необходимый для дальнейшей работы, ставят на хранение в хо­лодильник и опечатывают. Руки в перчатках промывают в банке с 5 % раствором хлорамина, затем перчатки снимают, обеззараживают вторично, де­зинфицируют и моют.

32. 
    Получение и транспортировка патологического материала для вирусологических исследований.
    

См. вопрос № 28.

33. 
    Устройство вирусологической лаборатории.
    

Современ­ные требования к лабораторным диагностическим комплексам и отдельным со­ставляющим (полы, стены, потолки, системы отопления, вентиляции, водоснаб­жения и канализации) изложены в правилах лабораторной практики GLP.

Вирусологические отделы лабораторий и научно-исследовательских ветеринарных станций призваны осуществлять лабораторную диагностику вирусных инфекций, контролировать заболеваемость животных, вызываемую вирусами в межэпизоотический период, а также учитывать состояние и напряженность специфического постинфекционного и поствакцинального противовирусного иммунитета, участвовать в организации и проведении профилактических мероприятий в борьбе с вирусными и хламидийными заболеваниями животных в обслуживаемом регионе.

Структура вирусологической лаборатории определяется задачами и особенностями ее деятельности. Размещать лабораторию желательно в двухэтажном здании или в изолированном отсеке. Бок­сы предпочтительнее располагать с северной, теневой стороны здания, чтобы избежать попадания в них прямых солнечных лучей, или следует застеклить окна боксов молочным или матовым стеклом. Полы в коридорах и комнатах для сотрудников могут быть паркетными, покрытыми лаком; в остальных – из плот­ного, влагонепроницаемого, устойчивого к дезинфектантам материала. Деревян­ные полы покрывают пластиком. Стены и потолки лаборатории должны быть также устойчивыми к дезинфектантам, легко подвергаться мойке. В боксах всю площадь целесообразно отделывать кафельной плиткой. Двери боксов должны быть раздвижными. Это позволяет сэкономить площадь и избежать колебания воздуха. В плоскости двери устраивают окошко с небольшой площадкой Целе­сообразно иметь боксы следующего назначения: для получения и культивирова­ния клеток – 1–2 бокса; для заражения культуры клеток – 1–2, для заражения куриных эмбрионов – 1–2 бокса; для заражения подопытных животных – 1 бокс; для вскрытия подопытных животных – 1 бокс; для склада стерильного стекла – 1 помещение.

Основные диагностические работы должны проводиться в настольных или стационарных ламинарных боксах (разного класса) с системой защиты операто­ра, предупреждения контаминации исследуемого материала, защиты окружаю­щей среды от вредных и опасных выбросов.

Помещения несколько больших размеров (примерно 4х4 м) выделяют для серологических исследований, уничтожения инфекционного материала, приго­товления и стерилизации лабораторной посуды и других материалов, приготов­ления питательных сред и растворов, а также для сотрудников.

Лаборатория (отдел) вирусологии долж­на быть обеспечена холодной и горячей водой, желательны подача пара и газа, наличие централизованного вакуум-провода и подачи воздуха под давлением.

Каждый бокс комплектуют соответствующей мебелью и оборудованием. При­мерная схема размещения оборудования и приборов представлена на рисунке 1. Наиболее важен стол, размер которого зависит от выполняемых на нем работ. В связи с тем, что многие работы приходится выполнять вдвоем, стол рекоменду­ется располагать параллельно стене, чтобы два работника сидели друг против друга, или ставить его к стене в виде буквы Т, что позволяет более экономно использовать площадь стола. Шкафчики для стеклянной посуды и мелкого ин­вентаря можно устроить под столом или повесить на стену. Покрытие лабора­торного стола должно быть устойчивым к действию дезинфицирующих веществ. Лабораторные стулья лучше всего металлические, так как они легко очищаются и дезинфицируются. Над рабочим местом устанавливают бактерицидные лампы (БУВ-30). У входа в бокс кладут резиновый губчатый коврик, пропитанный дезраствором. В предбокснике находятся стерильные халаты, колпаки, косынки, маски и тапочки, перчатки, которые надевают перед работой в боксе, и, в зави­симости от назначения бокса, соответствующее оборудование (термостат, холо­дильник, водяная баня, центрифуга и пр.).



Рисунок 1. Схема размещения оборудования: а – для работы с культурами клеток, б – для изготовления сред и растворов для культур клеток



Рисунок 2. Микробиологический защитный бокс I класса:1 – вытяжной вентилятор; 2 - высокоэффективный воздушный фильтр; 3 - смотровая стеклянная панель; 4- открытый проем для рук работающего; 5 - штуцера для подводок воды, воздуха


Рисунок 3. Бокс с ламинарной подачей стерильного воздуха:1 – газовая горелка, 2 – матрас, 3 – резиновая груша

Ограничить численность бактерий можно с помощью бактерицидных ламп БУВ-15 и БУВ-30. Значительного снижения количества бактерий в воздухе боксов и предбоксников, на поверхности столов и другого оборудования можно достигнуть обра­боткой аэрозолем перекиси водорода и некоторых других веществ. Уборку помещений проводят влажным способом: полы, стены, мебель про­тирают марлей, увлажненной дезраствором.

Для вирусологической лаборатории любого типа обязательной частью обору­дования должен быть настольный бокс, содержащий бактерицидную лампу, еще лучше – ламинарный шкаф с подачей стерильного воздуха (рис. 2, 3).

При работе в вирусологической лаборатории необходимо строго соблюдать методы и правила асептики и антисептики!

Асептика – система мероприятий и приемов работы, предупреждающих попадание микроорганизмов и вирусов из окружающей среды в организм человека, а также в исследуемый материал. Она предусматривает использование стерильных инструментов и материалов, обработку рук сотрудников, соблюдение особых санитарно-гигиенических правил и приемов работы.

Антисептика – комплекс мероприятий, направленных на уничтожение микроорганизмов и вирусов, способных вызвать инфекционный процесс при попадании на поврежденные или интактные участки кожи и слизистых оболочек. В качестве антисептиков используют различные химические вещества: 70%-ный этиловый спирт, 5%-ный спиртовой раствор йода, 0,5–3%-ный раствор хлорамина, 0,1%-ный раствор перманганата калия, 0,5–1%-ный раствор формалина, 1-2%-ные спиртовые растворы метиленового синего или бриллиантового зеленого.